Fare Embriyonik Kök Hücre Genomunda Homolog Rekombinasyonu Tespit Etmek için Güney Blotting

Her gDNA için, numune başına 30 mikrolitre Dra I için 10X tampon, üç mikrolitre Dra I ve 10 mikrogram gDNA karıştırın. Son hacim 30 mikrolitre olana kadar su ekleyin ve gDNA'ları sindirmek için gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Etidyum bromür içeren% 1'lik bir agaroz elektroforez jeli hazırlayın. Önceden elde edilen numuneleri 1 Kb'lik bir merdivenle birlikte jelin üzerine yükleyin ve gece boyunca 30 ila 40 voltta çalıştırın. Ertesi gün, jeli 0.2 Newton hidroklorik asit çözeltisi içeren bir tepsiye batırın. Tepsiyi oda sıcaklığında 20 dakika hafifçe sallamak için bir çalkalayıcı kullanın.

Jeli, DNA denatüre edici bir çözelti içeren bir tepsiye aktarın. Oda sıcaklığında 20 dakika hafifçe çalkalayın. Daha sonra jeli DNA nötralize edici bir çözelti içeren bir tepsiye aktarın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Aşağı doğru hızlı bir transfer sistemi kullanarak, DNA'ları jelden zara aktarın.

Ardından, TurboBlotter ve kurutma yığınını üretici tarafından sağlanan talimatlarda belirtildiği gibi birleştirin. Bundan sonra, zarı çıkarın ve bir dakika boyunca 2X salin-sodyum sitrat ile yıkayın. Sıvıyı dokularla emdirin ve ardından DNA'yı zarla çapraz bağlamak için bir UV çapraz bağlayıcı kullanın.

DNA problarını radyoaktivite ile etiketlemeye başlamak için, ısıyla denatüre edilmiş prob DNA'larını, kullanıma hazır DNA etiketleme boncuklarını içeren tüpe ekleyin. Karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin ve 5 mikrolitre radyoaktif etiketli deoksisitozin trifosfat ekleyin. 37 santigrat derecede on beş dakika inkübe edin. Etiketli probları, üretici tarafından sağlanan talimatlara göre G-50 mikro sütunları kullanarak saflaştırın. Radyoaktiviteyi ölçmek için bir parıldama sayacı kullanın.

Membranları etiketli problarla hibritleştirmeye başlamak için, membranı hibridizasyon tüpüne yerleştirin. Karışık ön hibridizasyon çözeltisini ekleyin. Tüpü hibridizasyon fırınına yerleştirin ve ön hibridizasyonun 30 dakika boyunca 42 santigrat derecede ilerlemesine izin verin.

Daha sonra tüpü fırından çıkarın ve ön hibridizasyon çözeltisini 50 mililitrelik bir tüpe dökün. Denatüre probu ekleyin ve hafifçe karıştırın. Karışık hibridizasyon çözeltisini hibridizasyon tüpüne ekleyin ve tüpü hibridizasyon fırınına geri koyun. Ardından, hibridizasyonun gece boyunca devam etmesine izin verin.

Hibritlenmemiş probları çıkarmak için, zarı %0,1 SDS'li 1x salin-sodyum sitrat içeren bir tepsiye yerleştirin ve 55 ila 60 santigrat derecede 10 dakika hafifçe çalkalayın. Bundan sonra, zarı plastik sargı ile sarın ve pozlama kasetine sabitleyin. Karanlık bir odada, zarı 2 yaprak X-ışını filmine maruz bırakın. Sonuçları görselleştirmek için filmi geliştirin.