İnsan Pankreas Kanseri Xenografts Kök Hücre İzolasyonu

Kanser kök hücreleri veya CSC'ler, uzun süreli kendini yenileme kapasitesine ve farklılaşmış döl üretme yeteneğine sahiptir. CSC'ler, aldehit dehidrojenaz aktivitesi ve hücre yüzeyi antijeni, CD 44, CD 24 ve CD 1 33'ün ekspresyonuna dayalı olarak tanımlanabildikleri pankreatik adenokarsinom da dahil olmak üzere giderek artan sayıda malignitede tanımlanmıştır. Burada tümörler, insan pankreas kanserini barındıran farelerden izole edilir.

Ksenogreftler ve tek hücreli süspansiyonlar üretilir. Hücreler daha sonra yüksek aldehit dehidrojenaz aktivitesine ve hücre yüzeyi antijeni CD 44 ve CD 24'e sahip hücreleri tanımlayan eldor reaktifi ile boyanır. Kanser kök hücre popülasyonları daha sonra floresanla aktive edilmiş hücre sıralaması kullanılarak izole edilir.

İzole edilen hücreler, çeşitli aşağı akış fonksiyonel ve analitik tahlillerde kullanılabilir. Kök hücre hipotezi, kanser biyolojisinde gelişmekte olan bir alandır. Özünde, hipotez, tümörlerin farklı fenotipik ve fonksiyonel hücre alt kümeleri içerdiğini belirtir.

Tümör başlatıcı hücreler veya kanser kök hücreleri olarak adlandırılan belirli hücre alt kümeleri, immün yetmezliği olan farelerde veya in vitro konjenik deneylerde kolonilerde tümörler oluşturabilir. Son zamanlarda, kanser kök hücrelerinin de metastaz gelişiminde ve terapötik dirençte önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir. Başlangıçta, kanser kök hücreleri, periferik kan veya kemik iliği örnekleri kullanılarak miyeloid lösemilerde incelenmiştir.

Bununla birlikte, kök hücre biyolojisinin ve katı tümörlerin ortaya çıkmasıyla birlikte, aşağı akış uygulamaları için çalışılandan daha fazla akış sıralaması yapılabilen tek hücreli süspansiyonlar üretmek için bir zorluk ortaya çıkmıştır. Ey dost Zan yazım şimdi bu prosedürü gösterecek. Bu protokol sırasında birkaç kritik adımı görsel olarak göstereceğim.

Bir insan pankreas kanseri ksenogreftinden tek bir tümör hücresi süspansiyonunun üretilmesiyle başlar. Daha sonra hücreleri aldehit, dehidrojenaz aktivitesi ve birkaç hücre yüzeyi antijeni için boyayacağım. Son olarak, floresanla aktive edilmiş bir hücre sıralayıcı kullanarak hücreleri sıralayacağım.

Bu protokol için kullanılan fareler, deri altı insan pankreas kanseri ksenogreftlerini barındırır. Bu fareler daha önce aşağıdaki gibi üretilmişti. Johns Hopkins Hastanesi'nde pankreas adenokarsinomu ameliyatı geçiren hastalardan yeni toplanan tümörler iki ila üç milimetrelik parçalara ayrıldı ve altı haftalık atletik farelerin yanlarına deri altına implante edildi.

Tümörler yaklaşık 1.5 santimetreküp olduğunda, tümör havuzunu genişletmek için eksize edildi ve ikincil alıcı farelere nakledildi. Bu protokol, marş halindeki bir farenin kanadından künt diseksiyon ile deri altı bir tümörün çıkarılmasıyla başlar. Tümör çıkarıldıktan sonra, hemen hücre ayrışma tamponuna yerleştirin.

Daha sonra, tümörü tartın, ardından steril bir biyogüvenlik kabininde çalışan bir gram tümör dokusu başına 10 mililitre hücre ayrışma tamponuna geri yerleştirin. Tümörü, steril tıraş bıçakları ve forseps kullanarak bir mililitre hücre ayrışma tamponu içeren 100 x 20 milimetrelik bir kültür kabına aktarın. Tümörü mekanik olarak kıyın.

Tümör hücresi süspansiyonunu, hücre ayrışma tamponunun kalan hacmini içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Daha sonra, tümör hücresi süspansiyonunu beş mililitrelik bir serolojik pipetten 10 kez geçirin. Tümör parçaları, beş mililitrelik serolojik boru pipetini tıkamayacak ve ardından süspansiyonu bir dakika boyunca maksimum hızda girdap haline getirmeyecek şekilde küçük olmalıdır.

Daha sonra tümör hücresi süspansiyonunu iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin ve her 20 dakikada bir dakika girdap yapın. İki saatlik inkübasyondan sonra, hücre süspansiyonunu bir dakika boyunca maksimum hızda girdaplayın. Hücre süspansiyonunu 70 mikronluk bir filtreden geçirin ve 50 mililitrelik taze bir konik tüpte toplayın.

Canlı hücreleri ölü hücrelerden ve doku kalıntılarından daha fazla ayırmak için% 10 FBS ve kalem şeridi içeren DMEM ile son hacmi 15 mililitreye ayarlayın. Yoğunluk santrifüjleme ile ayırma için bir fial gradyan hazırlamak için 15 mililitre fial paketi artı hücre süspansiyonunun altına yavaşça pipetleyin. İki katmanlı santrifüjü 500 G'de oda sıcaklığında 30 dakika boyunca karıştırmamaya dikkat edin, santrifüjlemeyi takiben ara kapalıdır, canlı hücreler fial paket artı ve hücre ayrışma tamponunun arayüzünde olacaktır.

Bunları 50 mililitrelik yeni bir konik tüpe aktarın. Hücre süspansiyonuna% 10 FBS ile takviye edilmiş taze DMEM ekleyin, bir ila üç santrifüj etmek için, santrifüjleme resüsünden sonra izole hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 450 G'de santrifüjleyin, hücre peletini bir mililitre alor tamponunda askıya alın, bu alor boyama kitinde sağlanır ve sonraki hücre boyama adımlarında kullanılacaktır. Daha sonra, 10 mikrolitre hücre süspansiyonunu 10 mililitre trian mavisi ile seyreltin ve bir hemo sitometre kullanarak canlı hücreleri sayın.

Bu adım sırasında çok sayıda ölü hücre veya doku kalıntısı fark edilirse, hücreyi tekrarlayın. Yoğunluk santrifüjleme hücreleri ile ayırma, aldehit dehidrojenaz aktivitesi için boyanacaktır. Alde Fluor reaktifi kullanılarak, hücreler ayrıca spesifik floro dört konjuge antikor kullanılarak birkaç hücre yüzeyi antijeni için boyanacaktır.

Yedi adet 12 x 75 milimetre polistiren test tüpünü etiketleyin ve buzun üzerine yerleştirin. Hücre süspansiyonunu iki mililitre eldor tamponunda mililitre başına beş ila 10 milyon hücrelik bir nihai konsantrasyona seyreltin ve buz üzerinde tutun. Ardından, ekteki yazılı bir protokoldeki talimatlara göre, faks alanında kompanzasyon kontrollerini ayarlamak için aşağıdaki örnekleri hazırlayın.

Akış sitometresi ilk ST lekeli olmayan kontrol hücreleri. İkinci hücre CD 44 A PC ile boyandı. Üçüncü hücre CD 24 PE ile boyandı ve dördüncü hücre fare CD 31 biotin fare soyu ile boyandı, biotin fare, H cp başına iki KD, biotin ve streptavidin ile boyandı. Ayrıca, yalnızca ALOR içeren beşinci bir numune ve A LDH pozitif ve CD 44 pozitif CD 24 pozitif kapılarını ayarlamak için altıncı bir numune hazırlayın.

Bu numune, aldehit dehidrojenaz izotopik kontrol antikorlarının bir inhibitörü olan ELDOR DEAB'yi içerecektir. IgG iki B kappa bir PC IgG iki a kappa PE fare CD 31 biotin fare soyu, biotin fare, H iki KD, cp başına biotin ve streptavidin. Daha sonra son tüpte, hücreleri cp başına alor CD 44 A PC CD 24 PE fare CD 31 biotin fare soyu, biotin fare, H iki KD, biotin ve streptavidin ile boyayın.

Bu, tüm boyama yapıldıktan sonra sıralanacak gerçek numunedir, hücre sıralaması yapılana kadar tüpleri karanlıkta buz üzerinde tutun. Bu sıralama protokolü, A LDH pozitif CD 44, pozitif CD 24 pozitif pankreatik CSC'lerin izolasyonuna yol açacaktır. Sıralamadan hemen önce, ST lekeli olmayan CD 44 A PC CD 24 PE fare soyunu kullanarak cansız hücreleri çıkarmak için AL DH pozitif CD 44 pozitif CD 24 pozitif yolluk tüpüne mililitre propidyum iyodür başına iki miligram ekleyin ve alor hücreleri bir FIA akışında kompanzasyon kontrollerini ayarlayın.

Sitometre, hücre singletlerini toplamak için ileri ve yan saçılma parametrelerine dayalı kapılar oluşturur. FL üç kanalını kullanarak CP negatif ve canlı propidyum iyodür negatif hücreler başına kullanılmaması için bir kapı oluşturmak için ST lekeli olmayan ve fare soy tüplerini kullanın. Çoğu insan pankreas kanseri ksenogrefti, fare CD'si 31, fare soy kokteyli ve fare H, iki kd kullanılarak %20 ila 60 fare türevi hücreler içerir.

DEAB ile muamele edilmiş hücreleri kullanan biyotin konjuge antikorlar, A LDH pozitif hücreler için FL bir kanalında kapılar oluşturur. Farklı ksenogreftlerden AL DH pozitif popülasyonun sıklığı değişkendir, ancak genellikle toplam hücre popülasyonunun bir ila %4'üdür. Ardından, hücreleri faks bağlantı noktasına sıralamak ve bu kapıları kullanmak için yerleştirin.

A LDH pozitif hücreleri,% 10 FBS ile desteklenmiş bir mililitre DM EM içeren 12 x 75 milimetre polistiren test tüplerine toplayın. Daha sonra, FL dört ve FL iki kanalda eldor IgG iki B kappa bir PC ve IgG iki bir kappa PE ile boyanmış hücreler kullanılarak oluşturulan kapılar oluşturun. Daha sonra, her hücre popülasyonu sıralandıktan sonra genellikle toplam popülasyonun% 0.2 ila 5'i olan CD 44 pozitif CD 24 pozitifini toplayın.

Hücre süspansiyonunu 10 dakika boyunca 450 G'de santrifüjleyin ve hücreleri% 10 FBS ile desteklenmiş 500 mililitre taze DMEM'de yeniden süspanse edin, bir hemo sitometre kullanarak sıralanan hücrelerin sayısını sayın. Bu prosedür, canlı pankreatik CSC'lerin izolasyonu ile sonuçlanacaktır. Bu hücreler, canlı hücreler gerektiren bir dizi analitik ve fonksiyonel test için kullanılabilir.

Onları in vitro klonojenik büyümeyi ve istilayı ölçmek için kullandık. Onları in vivo tümör başlangıcını ve metastaz oluşumunu ölçmek için kullandık ve karşılaştırmalı genetik analizler yapmak için kullandık. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yaklaşık yedi saat içinde gerçekleştirilebilir.

Saf bir canlı hücre popülasyonu elde etmek için kritik olan birkaç adım vardır. İlk olarak, çapı bir santimetreden daha küçük olan ksenogreftler, tümörler içinde en az miktarda nekrotik dokuya sahip olacaktır. Bu, son izole hücre popülasyonunuzu kirleten en az miktarda canlı olmayan hücre ve doku kalıntısı sağlayacaktır.

İkincisi, tek bir tümör hücresi süspansiyonu oluştururken, hücre canlılığını artırmak için hızlı bir şekilde çalışmak ve hücreleri veya tümörü% 10 serumla desteklenmiş ortamda tutmak önemlidir. Üçüncüsü, alde Fluor reaktifi ve antikorları ile hücre boyama başlatıldıktan sonra, hücrelerden alor reaktifinin akış miktarını azaltmak için hücreleri buz üzerinde tutmak ve onları alor tamponunda tutmak önemlidir. Ek olarak, floro dörtlüsünün foto ağartma miktarını azaltmak için hücreleri mümkün olduğunca karanlıkta tutmak önemlidir.

Son olarak, bir hemo sitometre kullanarak hücreleri manuel olarak saymak önemlidir. Akış sitometresi genellikle yanlış hücre sayımları vereceğinden.