Co-kültür Modelleri Pseudomonas aeruginosa Biyofilmler

Bu kağıt büyüyen farklı yöntemleri açıklar.

Bu prosedürün genel amacı, canlı insan hava yolu epitel hücrelerinin apikal yüzeyinde pseudomonas aerojen biyofilmlerini büyütmektir. Bu, önce plastik bir yüzey veya bir cam örtü kayması üzerinde birleşik bir hava yolu epitel hücresi tek tabakası oluşturularak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, yeşil floresan proteinini eksprese eden yapısal olarak bir p aerojen bakteri kültürü yetiştirmektir.

Bir sonraki adım, bakteri ve hava yolu hücrelerini statik bir ortamda veya bir akış odasında birbirleriyle temas edecek şekilde yerleştirmektir. Prosedürün son adımı, hava yolu hücrelerinin canlılığını değerlendirirken bakteriyel biyofilmlerin zamanla gelişmesine izin vermektir. Floresan mikroskobu ile canlı hava yolu hücreleri üzerinde biyofilm oluşumunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin anlamı, kistik fibroz hastalarının tedavisine kadar uzanır, çünkü bu kokültür modelleri, hava yollarının kronik kolonizasyonundan sorumlu biyofilmleri eradike edebilen yeni antibiyotik rejimleri geliştirmek ve doğrulamak için kullanılabilir. Kistik fibroz hastalarında, statik ko-kültür biyofilm modeli, ölümsüzleştirilmiş insan hava yolu olan CFBE hücrelerini kullanır. Epitel hücreleri başlangıçta bakteri inokülasyonundan yedi ila 10 gün önce kistik fibrozisli bir bireyden geliştirilir ve CFBE hücreleri 24 oyuklu bir doku kültürü plakasında tohumlanır.

% 10 fetal sığır serumu, iki milimolar L-glutamin, mililitre başına 50 birim, penisilin ve mililitre başına 50 mikrogram ile desteklenmiş 0.5 mililitre minimal esansiyel ortam veya MEM içinde kuyu başına iki kez 10 ila beşinci hücre konsantrasyonunda hücreleri tohumlarız. Streptomisin, hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte büyütür. Yedi ila 10 gün boyunca% 95 hava, ortamı her iki ila üç günde bir değiştirir.

Bu koşullar, deneyden bir gün önce birleşik, tek katmanlı ve sıkı bir bağlantı oluşumuna yol açacaktır. Dondurulmuş bir stoktan beş mililitrelik bir LB kültürünü pierro gen ile aşılayın ve bir döndürücü üzerinde 37 santigrat derecede 18 saat büyütün. 200 RPM'de, bakteri aşılama gününde GFP'nin yapısal ekspresyonu için PSMC 21 plazmidini taşıyan p aerojeni kullanıyoruz.

Ortamı CFPE hücrelerinden çıkarın ve fenol kırmızısı içermeyen MEM olan eşit hacimde bir mikroskopi ortamı ekleyin, iki milimolar L-glutamin inokulat birleşmesi ile desteklenmiş, yaklaşık 30 ila bir enfeksiyon çokluğunda posa ile CFBE tek tabakaları orijinal olarak 24 oyuklu bir plaka için tohumlanan CFBE hücrelerinin sayısına göre. Bu, 1.2 mililitre MEM'de mililitre başına yedinci CFU'nun 10 katına eşittir. Plakayı bir saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit,% 95 havada inkübe edin.

Bir saatlik inkübasyonun ardından, snat'ı çıkarın ve taze mikroskopi ile değiştirin. Orta% 0.4 arginin ile desteklenmiştir. Arginin ilavesi, CFPE hücreleri üzerinde biyofilmlerin oluşması için yeterince uzun süre tek tabakanın tahrip olmasını geciktirir.

Plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit,% 95 havada, her birkaç saatte bir yaklaşık sekiz saate kadar çeşitli zaman noktalarında inkübe edin. Mikroskopi kullanarak CFBE tek tabakasının bütünlüğünü ve biyofilmin büyümesini analiz edin. Akış hücresi ko-kültür biyofilm modeli, 40 milimetre çapında bir cam örtü kızağı üzerinde birleşik bir CFBE hücre tek tabakasının oluşturulmasını gerektirir.

Bunu yapmak için, önce steril bir örtüyü 60 milimetre çapında steril bir plastik kabın içine yerleştirin. Daha sonra, altında sıkışan kabarcıkları çıkarmak için pipetin ucuyla kapak fişine orta derecede bastırarak ve kapak fişini plastik tabak tohumunun dibine iki kez 10 ila altıncı CFBE hücresine zorlamak için üç mililitre ön ısıtma hücre büyümesi ekleyin. Çanağı hafifçe ileri geri sallayın, ancak hücrelerin yemeğin kenarlarına doğru santrifüjlenmesini önlemek için döndürmekten kaçının.

Çanağı sekiz ila 10 gün boyunca 37 santigrat derecede %5 karbondioksit, %95 hava inkübatörüne yerleştirin. Hücreleri her gün üç mililitre taze büyüme ortamı ile besleyin. Bu koşullar altında, hücreler cam örtü kızağı üzerinde birleşik bir tek tabaka oluşturacaktır.

Bir sonraki adım, deneyden bir gün önce P aerojen bakteri suşunu hazırlamaktır. Bir döndürücü üzerinde 37 santigrat derecede 18 saat boyunca beş mililitre LB'de p aerojeni büyütün. 200 RPM'de, deney gününde GFP'nin yapısal ekspresyonu için PSM C 21 plazmidini taşıyan P aerojen suşu, PO birini kullanıyoruz.

Bir mililitre bakteri kültüründe steril bir mikro santrifüj tüpüne girin ve üç dakika boyunca 6.000 RPM'de santrifüjleyin. Bakteri peletini bir mililitre mikroskopide iki kez yıkayın. Orta, 0.5 mililitre yıkanmış ve yeniden süspanse edilmiş bakteriyi 4.5 mililitre mikroskopi ortamına seyrelterek, mililitre başına sekizinci CFU'ların yaklaşık beş katı 10'luk bir konsantrasyon elde edin.

Artık CFPE hücrelerini gerçek zamanlı olarak gözlemlemeye hazırız, bu da uzun süre besin akışını sağlamak için peristaltik bir pompaya bağlı bir görüntüleme odası gerektiriyor. Ve bir sıcaklık kontrolörü, standart bir biyofilm akış hücresi aparatı kullanıyoruz. Biyoteknoloji FCS, CFPE hücrelerini barındıracak şekilde modifiye edilmiş iki odacıklıdır.

Akış hücresi ko-kültür biyofilm modelindeki en kritik adımlardan biri, hücre monitörüne zarar vermeden odayı monte etmektir. Perfüzyon tüpleri görünecek şekilde haznenin üst yarısını baş aşağı tutun ve 0,75 milimetre kalınlığındaki lastik contanın boşluk deliklerini perfüzyon tüplerinin üzerine hizalayın. Hazne ile birlikte verilen mikro su kemeri sürgüsünü, yivli tarafın yukarıda olduğundan emin olarak lastik contanın üzerine istifleyin.

Ardından sürgünün üzerine başka bir lastik conta yerleştirin. Bu ikinci contanın kalınlığı ve iç geometrisi, haznenin hacmini belirleyecektir. Ardından, bir mililitre ön ısıtma mikroskobu ortamı ekleyin Slaytın ortasına.

Hücre kültürü inkübatöründen CFPE hücrelerini alırken görüntüleme odasını steril bir yüzeye yerleştirin. Kullanılmış ortamı tabaktan çıkarın ve CFPE hücrelerini üç mililitre ön ısıtma mikroskobu ortamı ile bir kez yıkayın. Etanol yıkanmış forseps kullanarak.

Kapak fişini çanaktan alın ve hazneye yerleştirilen mikroskopi ortamı boncuğunun üzerine baş aşağı indirin. Kapak kayma şimdi ikinci lastik conta üzerinde duruyor ve hava yolu hücrelerinin tek tabakası aşağı bakıyor. Monte edilmiş bileşenleri bir elinizle tutarak, haznenin tabanını yığının üzerine yerleştirin ve her şey doğru tarafı yukarı bakacak şekilde hazneyi hızlı bir şekilde ters çevirin.

Halkayı çevirerek tabanı yerine kilitleyin. Giriş tüpünü düşük akışlı mikro perfüzyon pompasına bağlayın. İkinci bir boru parçası, pompayı 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirilmiş bir mikroskopi ortamına bağlar.

Mikroskobun hemen yanında bulunur. Akışı saatte 20 mililitre hızında başlatın. Bu akış hızı posanın yüzme hızı kabiliyeti dahilindedir.

Steril önceden kesilmiş bir 16. CFL borusunu odanın giriş ve çıkış perfüzyon tüplerine takın ve ardından sıcaklık kontrol cihazını bağlayın. Monte edilmiş odayı, ters çevrilmiş bir floresan mikroskobunun mikroskop aşamasına yerleştirin. Bir mililitrelik tek kullanımlık şırınga kullanarak.

Bakterilerin hava yolu hücrelerine yapışmasına izin vermek için pompa ile hazne arasına aynı hizada yerleştirilmiş iki bir valf kullanarak önceden hazırlanmış bakteri süspansiyonunu hazneye enjekte edin. Pompayı iki saat durdurun. İki saat sonra, akış yeniden başlatılabilir ve saatte 20 mililitrede tutulabilir.

Deneyin geri kalanı için, hava yolu hücrelerinin bütünlüğünü diferansiyel girişim ile izleyin. Tek tabakada hasar belirtilerini kontrol etmek için deney boyunca kontrast mikroskobu. Eş zamanlı olarak hava yolu hücrelerinin apikal yüzeyinde GFP işaretli p aerojen biyofilmlerin gelişimini takip edin.

Hem statik hem de akış hücresi tahlillerinde ters konfokal veya geniş alanlı floresan mikroskobu ile görüntüler elde edilerek, CFPE tek tabakasının, herhangi bir değişiklik belirtisi olmaksızın aşılamadan sonra sekiz saate kadar p aerojen varlığına dayanabileceği bulundu. Epitelyal tek tabaka bütünlüğü, doku kültürü plakaları üzerinde büyütülen birleşik bir tek tabaka CFPE hücresinin bu örneğinde gösterildiği gibi ters çevrilmiş bir faz kontrast mikroskobu ile değerlendirilebilir. Zamanla, p aerojen, epitel hücresi tek tabakasına tamamen veya bölümler halinde zarar verebilecek toksinler ve virülans faktörleri üretecektir.

Tehlikeye atılmış bir CFPE tek tabakasının bu örneğinde, yeşil renkle gösterilen P aerojen bakterileri, epitel hücrelerinin sıkı bağlantıları arasında yayılır ve bazolateral membranlara erişim kazanırken görülür. Biyofilm oluşumu tipik olarak tek tabakanın bozulması nedeniyle bu koşullar altında elde edilemez. Bu görüntü, biyofilm oluşumunu başarılı bir şekilde destekledikten sonra aşılamadan 24 saat sonra gözlemlenen aşırı büyümüş bir p aerojen biyofilmini göstermektedir.

CFPE tek tabakası tamir edilemeyecek şekilde hasar gördü ve şu anda neredeyse yok. Düz bir bakteri tabakası olarak büyüyen artık biyofilm, cam kapak kızağına yapışırken gösterilmiştir. Hava yolu tek tabakasının bütünlüğü tehlikeye atılmadığında.

P aerojen biyofilmleri, her iki ko-kültür modelinde de hava yolu hücrelerinin apikal yüzeyinde başarılı bir şekilde oluşabilir ve gelişebilir. Burada, epi floresan mikroskobu ile değerlendirilen statik ko-kültür biyofilm modeli kullanılarak CFPE hücrelerinin birleşik bir tek tabakası üzerinde büyütülen p aerojen biyofilmi eksprese eden bir GFP'nin temsili bir görüntüsü gösterilmektedir. Görüntü, yüz kontrast kanalının ve floresan kanalının bir katmanıdır.

Bu sonraki resim, p aerojen etiketli bir GFP'yi göstermektedir. Hava yolunun görselleştirilmesini kolaylaştırmak için akış hücresi ko-kültür biyofilm modeli kullanılarak birleşik bir mono CFBE hücresi tabakası üzerinde altı saat boyunca büyütülen biyofilm. Tek tabakalı çekirdekler, posa ile aşılamadan önce HEXT 3 33 42 ile boyandı ve mavi renkte göründü.

CFPE hücrelerinin apikal yüzeyine bağlı yeşil kümeler halinde ortaya çıkan filmler, hava yolu hücreleri boyunca dağılır. 3D rekonstrüksiyondan sonra A-C-F-P-E hücre tek tabakası üzerinde oluşan altı saatlik aerojen biyofilmlerinin tipik mantar benzeri yapıları burada gösterilmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, burada açıklanan ko-kültür modellerini kullanarak ve standart mikrobiyolojik yöntemler ve floresan mikroskobu ile birleştirildiğinde, yerleşik bir tek tabakalı hava yolu hücreleri üzerinde bakteriyel biyofilmlerin nasıl başarılı bir şekilde büyütüleceğini ve görselleştirileceğini iyi anlamalısınız.