Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

Bu prosedürün amacı, fare T hücreleri üzerinde fonksiyonel antijene özgü T hücresi reseptörlerini eksprese etmektir. İlk olarak, retrovirüsü eksprese eden TCR'yi paketlemek için ilgilenilen TCR genini içeren plazmid ile retroviral üreten bir hücre hattını transfekte edin. Daha sonra, fare dalaklarından T hücrelerini izole edin ve saflaştırın, bu saflaştırılmış T hücrelerini ilk adımda üretilen retrovirüs ile enfekte edin.

Son olarak, kayda değer seviyelerde reseptör eksprese etmek ve elde etmek için dönüştürülmüş T hücrelerini genişletin. Sonuç olarak, akış sitometrisi yoluyla fare T hücreleri üzerinde fonksiyonel antijene özgü TCR'lerin ekspresyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Merhaba, benim adım Michelle Crow Guard.

NYU Tıp Fakültesi'ndeki NYU Kanser Enstitüsü'ndeyim. Bugün size birincil T hücresini nasıl transdüksiyon yapacağınızı göstereceğiz, bunu nasıl yapacağınızı gösterecek kişiler laboratuvarda doktora sonrası araştırmacı olan Shiong, laboratuvarda yüksek lisans öğrencisi olan Kaleena Melek ve laboratuvarda doktora sonrası araştırmacı olan Arian Perez Garcia olacak. Bu tekniğin transgenik fareler gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, çok daha az zaman alıcı olmasıdır.

Bu yöntem, hangi TCR'nin antijenlere karşı daha iyi yanıt verebileceği gibi temel immünolojik soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu teknik, kanser hastalarının tedavisi için umut verici olduğu gösterilen ve şunlardan oluşur: in vitro T hücrelerinin in vitro modifikasyonu T hücresi reseptörü alfa ve beta zincirlerinin eşit ekspresyonunu sağlamak için. İlgilenilen geni, aynı promotörün kontrolü altında aynı retroviral vektöre alt klonlayın.

Kyogen Maxi hazırlık kitini kullanarak yüksek kaliteli plazma DNA'sı hazırlayın ve mikrolitre başına bir mikrogram stok yapın. Platin E retroviral paketleme hücreleri ile plakadan ortamı çıkarın ve plakayı bir XPBS ile bir kez yıkayın. Tripsin EDTA ekleyerek hücreleri yerinden çıkarın ve birkaç dakika 37 santigrat derecede inkübe edin.

Yerinden çıkan hücreleri DMEM ortamı ile nötralize edin ve bir şahin tüpüne aktarın. Daha sonra hücreleri beş dakika boyunca 1000 kez G'de santrifüjleyin. Supinatı aspire edin ve hücre peletini DMEM ortamında yeniden süspanse edin.

Hücre sayısını belirleyin ve hücreleri mililitrelik plaka başına 0.6 kez 10 ila altı kez seyreltin. 10 milimetre polilisin kaplı doku kültürü plakasında 10 mililitre hücre süspansiyonu ve gece boyunca %5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede bir hücre inkübatöründe büyür. Ertesi sabah, yaklaşık% 80 co akıcılığını doğrulamak için hücreleri ışık mikroskobu altında inceleyin.

Ortamı plakadan yavaşça çıkarın. Hücreleri bir XPBS ile bir kez yıkayın ve penisilin veya streptomisin içermeyen 10 mililitre önceden ısıtılmış taze DMEM ortamı ekleyin. Dudak ortalama transfeksiyon kompleksi için, iki karışım hazırlayın ve DNA'nın ME M1'ini ve lipektomi reaktifinin diğerini oda sıcaklığında beş dakika boyunca ayrı ayrı dengeleyin.

Sonra yavaşça karıştırın ve 20 dakika inkübe edin. Oda sıcaklığında, karışımı yavaşça platin E hücrelerine damlatın. Transfeksiyon karışımını eşit şekilde dağıtmak için plakayı hafifçe ileri geri sallayın.

Daha sonra hücreleri bir hücre inkübatöründe 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Altı ila sekiz saat sonra, viral üretim için ortamı 10 mililitre taze DMEM ortamı ile değiştirin. Bir fare dalağını kesin ve RPMI ortamına aktarın.

Dalağı bir hücre süzgecine yerleştirin. Dalağı bir şırınga pistonu ile beş santimetrelik bir doku kültürü plakasına ezin. Hücreleri santrifüjlemek için hücre süzgecinden steril PBS ile durulayın, santrifüjü beş dakika boyunca 1000 kez G'de.

Malzemeyi atın. Resus, hücre peletini bir CK parçalama tamponunda askıya alarak devam edin. Dalak başına iki mililitre ekleyerek, iki dakika inkübe edin.

Oda sıcaklığında. 20 mililitreye kadar RPMI ortamı ekleyin ve beş dakika boyunca 1000 kez G'de santrifüjleyin. Son olarak, hücre peletini steril PBS'de yeniden süspanse edin.

Hücre sayısını belirleyin ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 1000 kez G'de santrifüjleyin. Viral transdüksiyondan önce fare T hücrelerini aktive etmek için, aktive edici antikorlar, yani anti CD üç epsilon ve anti CD 28 ile kap plakaları. Steril PBS'de mililitre anti CD başına bir mikrogram, üç epsilon ve mililitre anti CD 28 başına iki mikrogramlık bir antikor karışımı hazırlayın, 24 kuyulu doku kültürü plakasının her bir oyuğuna 250 mikrolitre antikor karışımı dağıtın ve 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin.

Dalak hücrelerini ürün kılavuzuna göre manyetik olarak etiketleyin. Manyetik alana bir LS sütunu yerleştirin. Sütuna etiketli hücre askıya alma işlemi uygulayın.

Zenginleştirilmiş fare CD'si sekiz artı T hücresinden akışı toplayın. Kolonu üç mililitre tamponla üç kez yıkayın ve önceki üfleme ile birleştirin. Hücreleri anti CD üç epsilon ve anti CD sekiz alfa antikoru ve analiz edilmiş akış sitometrisi ile boyayın.

Daha sonra, hücreleri beş dakika boyunca 1000 kez G'de santrifüjleyin ve rekombinant insan IL iki ile RPMI ortamında hücre pellesini mililitrede 1 milyon hücreye yeniden süspanse edin. Antikor çözeltisini aktivasyon plakasından çıkarın. Her kuyuyu steril PBS ile durulayın.

Her oyuğa bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin ve plakayı 37 santigrat dereceye yerleştirin. Bir hücre inkübatöründe% 5 karbondioksit. İki günlük virüs üretiminden sonra, platin ESE hücre plakasındaki ortam sarı renkte olmalıdır.

Hücre kalıntılarını gidermek için viral supinatı 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Virüs S süpernatantını beş dakika boyunca 1000 kez G'de santrifüjleyin. Virüs supinatını dikkatlice yeni bir tüpe aktarın.

Tüpün dibinde bir miktar sıvı bırakın ve hücre kalıntılarını rahatsız etmeyin. Aktive edilmiş T hücrelerini plakadan 50 milimetrelik konik bir tüpe toplayın. Hücre numarasını belirleyin.

Bazı hücreleri, beş dakika boyunca 1000 kez G'de negatif kontrol santrifüjü olarak kullanılmak üzere ayrı bir tüpte saklayın ve sırtüstü natanı atın. Daha sonra hücre peletini virüs sırtında yeniden süspanse edin. Mililitre başına 10 ila altı hücrede, mililitre başına 20 nanogram rekombinant insan, interlökin iki ve mililitre protein sülfat başına 10 mikrogram natant.

Kontrol tüpü için 24 oyuklu plakanın her bir oyuğuna bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Resus. Hücreleri, aynı miktarda rekombinant insan, interlökin iki ve protein sülfat ile aynı hücre yoğunluğunda RPMI ortamında askıya alın. Hücreleri aynı plakaya ekleyin.

Plakayı plastik film santrifüjü ile 90 dakika boyunca 2000 kez G'de 32 santigrat derecede ara vermeden sarın. Santrifüjlemeden sonra plastik filmi çıkarın. Her birine iki adet mililitre rekombinant insan interlökin başına 20 nanogram içeren bir mililitre taze RPMI ortamı ekleyin, plakayı tekrar inkübatöre koyun.

Aktarılan T hücrelerinin günlük olarak incelenmesi önemlidir. Gerektiğinde hücreleri bir ila üç oranında bölün. Hücrelerin aşırı büyümesine izin vermeyin veya ortamın altıncı veya yedinci günde sararmasına izin vermeyin.

T hücresi yüzeyindeki TCR ekspresyonunu değerlendirmek için hücreleri TCR'ye özgü antikor ve MHC tetramer ile boyayın. UNSD T hücrelerini kontrol olarak kullanın. Bu transdüksiyonlu T hücreleri artık daha sonraki sonraki uygulamalar için hazırdır.

Viral transdüksiyondan önce. T hücreleri üzerindeki TCR'lerin ekspresyon seviyesini değerlendirmek için ticari manyetik boncuklar kullanılarak yüksek saflıkta T hücresi alt kümeleri elde etmek avantajlıdır. TCR alfa veya beta zincirlerine özgü antikor kullanılabilir.

Tipik olarak, hücrelerin %30 ila %80'i, TCR genlerine ve virüs titrelerine bağlı olarak dönüştürülmüş TCR'yi eksprese edebilir. TCR'ye özgü MHC Tetramer, TCR'lerin fonksiyonel ekspresyonunu daha fazla doğrulamak için de kullanılabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa bir hafta içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, bu prosedürü takiben hücreleri sağlıklı durumda tutmayı unutmamak önemlidir. Sitotoksisite asidi veya sitokin salınım testleri gibi diğer yöntemler, transdücenin özgüllüğü ve duyarlılığı gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. TCR'ler.

Bu videoyu izledikten sonra, en sevdiğiniz TCR'yi birincil T hücrelerine dönüştürme konusunda uzman olmalısınız. Laboratuvarda görüşmek üzere.