Bryostatin 1/Ionomycin Yoluyla Tümör-reaktif T hücrelerinin ex vivo Genişleme ve Ortak Gama Zinciri Sitokinler Formülasyon

Bu deneyin amacı, Brios statin bir iyon misin ile T hücresinin aktivasyonunu indüklemek ve ayrıca T hücrelerinin gama zinciri sitokinleri ile farklılaşmasını, tümöre duyarlı T hücrelerinin dalak ve lenf düğümlerinden izolasyonu ile başlamaktır. Daha sonra sırasıyla protein, kinaz C aktivitesini ve hücre içi kalsiyumu artıran brios, statin bir ve iyon misin iki hücre içi sinyal mimetiği ile aktive edin. Tümör reaktif T hücrelerinin farklılaşması ve genişlemesi için IL yedi IL 15 ve IL iki varlığında kültür.

İnterferon gama EISA'dan elde edilen sonuçların güçlü kombinasyonu ve sitotoksisite testi, genişlemiş T hücrelerinin tümör reaktivitesine ışık tutabilir ve evlat edinen immünoterapi için potansiyel bilgiler sunabilir. Tümör reaktif T hücrelerinin bu exvivo genişleme yöntemi, tümör immünolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin tümör reaktif T hücrelerinin farklılaşmasında yaygın gama görüntüleme sitokinlerinin rolü nedir? Ve efektör hücreler, efektör hafıza hücreleri ve merkezi hafıza hücreleri gibi her bir T hücresi fenotipinin kansere karşı uzun süreli hafıza tepkisi oluşturmadaki rolü nedir?

Lenf nodlarının ve dalağın izolasyonu ve lenfositlerin septik olarak ele alınması, uygulanması zor prosedürlerdir, ancak hızlı bir şekilde öğrenilebilir. Gözlem yoluyla. FVBN 2 0 2 transgenik dişi fareler, MMTV promotörü regülasyonu altında inaktive edilmiş bir sıçan yeni transgeni eksprese eder ve sonuç olarak, dört ila 10 aylıkken spontan meme karsinomu geliştirdi.

Bu protokolde, bu spontan tümör taşıyan fareler, tümör reaktif T hücrelerinin donörleri olarak kullanılır. Başlamak için, tümörü boşaltan lenf düğümlerini ve dalakları FVBN 2 0 2 transgenik fareler taşıyan tümörden izole edin. Şimdi, buz gibi soğuk RPMI 1640'ta tek hücreli bir süspansiyon hazırlayın, bir mikromolar cin, beş nano molar brios, statin bir ve mililitre başına 80 birim ile% 15 FBS içeren tam ortamda% 10 FB sce A kültürü ile% 10 ila mililitrede altı hücre

PMI ortamımız 37 santigrat derecede dengelendiğinde 16 saat boyunca IL iki, hücreleri üç kez yıkayın, daha sonra mililitre başına 10 nanogram ile tam ortamda mililitre başına 10 ila altı hücrede kültür, her biri IL yedi ve IL 15 24 saat boyunca. Hücreleri daha fazla aktive etmek için, mililitre başına 40 birim, IL iki, 24 saat boyunca nabız atar. Şimdi hücreleri bölün ve mililitre başına 10 nanogram ile kültürleyin, her biri IL yedi ve IL 15'in her biri gerekirse dört gün daha, ortamı değiştirin ve hücreleri iki günde bir bölün.

Genleşmiş birincil T hücrelerini santrifüjleme ile hasat edin, hücreleri ışık mikroskobu ile numaralandırın ve T hücrelerinin kat genişlemesini hesaplayın. Şimdi CD sekiz pozitif ve CD dört pozitif T hücrelerinin oranını belirlemek için hücreleri akış sitometrisi için hazırlayın. İlk olarak, hücreleri anti CD 16, CD 32 antikoru ile buz üzerinde 20 dakika inkübe ederek antikorların FC reseptörlerine spesifik olmayan bağlanmasını bloke edin.

Daha sonra hücreleri iki mililitre% 1 sodyum azid ile takviye edilmiş buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın, hücreleri buz üzerinde 20 dakika boyunca Fitz CD dört ve PE CD sekiz antikorları ile inkübe ederek lekeleyin. % 1 FBS ve% 0.1 sodyum azid ile desteklenmiş iki mililitre buz gibi PBS ile iki kez yıkayın. Son olarak, hücreleri %1 paraform aldehit ile sabitleyin ve numuneleri bir Beckman Coulter FC 500 üzerinde summit sürüm 4.3 yazılımını kullanarak altı kuyucuklu kültür plakasında analiz edin, meme tümör hücreleri ile T hücrelerini 10'a bir efektör/hedef oranında pipetleyin ve kuyucuk başına üç mililitre.

Mililitre başına 20 birim IL içeren komple ortam, ikisi 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksit 48 saat boyunca inkübe edilir. Yeni için üç renkli antikor boyaması gerçekleştirin, ardından üreticinin yeni pozitif tümör hücreleri üzerindeki protokol kapısı gerçeklerine göre PE anti-US IgG ve Xin beş fit ve propidyum iyodür uygulayın ve tümör hücrelerinin canlılığını bir Xin beş pi ile analiz edin. T hücrelerinin BI ile 16 saat boyunca aktivasyonu, in vivo olarak tümöre duyarlı olmayan saf T hücrelerinin öldürülmesine neden olur.

Tümör reaktif T hücrelerinin bi seçiciliğinden sonra, gama zinciri sitokinleri ile altı günlük bir kültür içinde 2.8 kata kadar genişlerler, hem CD sekiz pozitif hem de CD dört pozitif T hücreleri gama zinciri sitokinleri ile eşit olarak genişler. Altı günlük bir ex vivo kültürden sonra, ex vivo genişlemiş T hücreleri, interferon gama üretimi ile değerlendirildiği gibi donör farelerin duyarlı hale getirildiği tümörlere karşı yüksek yanıt gösterir. Yeni pozitif fare meme karsinomu veya MMC tümör hücrelerinin varlığında, ex vivo genişlemiş T hücreleri, yeni pozitif MMC tümör hücrelerinde apoptozu indükleyebilir, böylece tümör hücrelerinin canlılığı 48 saat içinde% 92'den% 61'e düşer.

Bu prosedürü denerken, aseptik koşullar altında çalışmayı unutmamalısınız. Bu videoyu izledikten sonra, kanserlerin adaptif T hücresi tedavisi için tümör aktif T hücrelerinin nasıl seçileceğini ve genişletileceğini iyi anlamış olmalısınız.