Zebrafish embriyolarının kaudal damarına bakterilerin mikroenjeksiyonu

Balık suyunda asılı olan erken evre zebrafish embriyolarını alın ve embriyoları çevreleyen koruyucu membran olan korionu çıkarın.

Embriyoları, mikroenjeksiyon için immobilize edilmek amacıyla balık suyu içeren bir anestezi maddesi içeren V şeklinde bir pozisyon odasına aktarın.

Embriyoları odanın içine yerleştirin.

Sonra, floresan olarak işaretlenmiş patojenik bakterilerin homojen bir süspansiyonunu deterjan içeren bir tampon içinde seyreltirerek bakteriyel topaklanmayı en aza indirin.

Enjeksiyonun izlenmesini kolaylaştırmak için bir iz boyası ekleyin.

Süspansiyonu mikroenjeksiyon iğnesine yerleştirin, iğneyi bir mikromanipülatöre monte edin ve ucunu kırarak küçük bir açıklık oluşturun.

Embriyoyu ventral tarafı iğneye bakacak şekilde konumlandırın ve iğne ucunu ürogenital açıklığa yakın getirin.

Ucu nazikçe kaudal ven bölgesine yerleştirin ve bakteri süspansiyonu enjekte edin.

Embriyoları, sonraki konak-bakteriyel etkileşim çalışmaları için balık suyu içeren çok kuyu bir plakaya aktarın.

M . mikroenjeksiyonunu gerçekleştirmek için. Döllenmeden veya HPF'den yaklaşık 24 saat sonra absess , embriyoları cımbızla 100 milimetrelik Petri kabında dekoriyonat edin ve 28,5 derece Celsius sıcaklığında tutun.

30-48 hpf embriyoları, 25 mililitre balık suyu ile doldurulmuş ve litrede 270 miligram tricaine sahip V şeklinde bir konumlandırma odasına aktarın. Kırpılmış bir mikro yükleyici ucu ile, embriyoları kanallara doğru yerleştirerek mikro manipülasyonu kolaylaştırabilirsiniz.

Mikrobakteriyel aşıyı istenen CFU'ya kadar seyreltmek için %0,05 Tween 80 ile PBST kullanın ve doğru enjeksiyonu kontrol etmek için %10 fenol kırmızısı ekleyin. Mikroloader ucuyla, mikroenjeksiyon iğnesine 5 ila 10 mikrolitre bakteri aşısı yükleyin.

Mikroenjeksiyon iğnesini enjektöre bağlı bir mikro manipülatörün tutucusuna bağlayın ve ince cımbızlarla iğnenin üst kısmını kırarak 5 ila 10 mikrometre açıklık çapı elde edin.

Enjeksiyon hacmini mikroenjeksiyon basıncını ve süresini ayarlayarak kalibre edin. Daha sonra, gerekli enjeksiyon hacmini elde etmek için, bir embriyonun sarısına atılan bir damlanın çapını ölçer.

Kuyruk venine mikroenjeksiyon yapmak için, embriyoyu ventral tarafı iğneye bakacak şekilde konumlandırın, iğne ucunu ürogenital açıklığa yakın yerleştirin ve iğnenin ucunu yumruk ven bölgesini delene kadar nazikçe embriyoya itin.

Daha sonra istenen hacmde bakteriyel süspansiyon veriliyor; genellikle 1 ila 3 nanolitre, nanolitre başına yaklaşık 100 CFU içerir. Embriyoları metin protokolüne göre kuluçka altına alın ve izleyin.