8-iyi Odası Slayt in vitro Biyofilm Oluşumu

Bu makalede, 8 kuyu odasına slayt içinde yetişen bir bakteriyel biyofilm oluşumu ve görselleştirme için prosedürü anlatılmaktadır.

Bu prosedürün genel amacı, bir oda slaytının kuyularında bakteriyel biyofilmler yetiştirmektir. Her kuyucuk önce büyüme ortamında bakterilerle aşılanır, daha sonra 37 santigrat derecede kültürlenir. Biyofilmler oluştuktan sonra, hücreleri boyamak için hayati bir boya kullanılır.

Biyofilmler daha sonra yıkanır ve sabitlenir ve kuyular bir kapak fişi kullanılarak kapatılır. Son olarak, hücreler konfokal mikroskopi ve karakterize edilen farklı biyofilmlerin morfolojisi ile gözlemlenebilir. Bu tekniğin akış hücreleri gibi mevcut yöntemlere göre bir avantajı, hacimlerin çok daha küçük olması ve bu nedenle kullanılacak herhangi bir deneysel bileşiğin miktarını azaltmasıdır.

Ayrıca, üç odacıklı akış hücresine kıyasla sekiz kuyulu odacıklı bir slaytta bir seferde daha fazla değişken karşılaştırılabilir. Bu yöntem, mikrobiyoloji alanındaki biyofilm oluşumunun kinetiği gibi birkaç önemli sorunun yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem aynı zamanda kronik orta kulak iltihabı, kistik fibroz ve kronik mesane enfeksiyonları gibi bir biyofilm bileşeni içeren birçok hastalık hakkında da bilgi sağlayabilir.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler mücadele edecektir, çünkü mevcut biyofilmin yapay olarak bozulabileceği çok sayıda adım vardır. Bu nedenle, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü sıvı adımlarının çıkarılması ve eklenmesinin öğrenilmesi zordur ve saf kuvvetler nedeniyle biyofilmi bozma şansı, bugün prosedürü gösteren protokolün bu noktalarında en yüksektir. Laboratuvardan bir yüksek lisans öğrencisi olan Liz, Bakterileri sıvı kültür ortamında aşılayın, ve kültürü orta log fazına ulaşana kadar inkübe edin. Bu örnekte kullanılan tiplendirilemeyen hemophilus influenza için orta log faz süspansiyonunu ön ısıtma ortamında bir ila 2.500 oranında seyreltin.

Bu, başlangıç konsantrasyonu olarak mililitre başına 40.000 koloni oluşturan birim sağlayacaktır. Aseptik olarak 200 mikrolitre seyreltilmiş kültürü, steril sekiz kuyucuklu odacıklı bir slaytın her bir oyuğuna aktarın. Bakterilerin 16 ila 18 saat sonra biyofilm oluşturmaya başlamasına izin vermek için slaytı %5'lik bir karbondioksit inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin.

Slaytı inkübatörden çıkarın ve ortamı her odanın köşesinden aspire edin. Ardından 200 mikrolitre taze ön ısıtma ortamı ile değiştirin. Biyofilmlerin bozulmasını önlemek için yeni ortamı odaların duvarı boyunca dağıttığınızdan emin olun.

Slaytı inkübatöre geri koyun ve kültürlerin istenen yoğunluğa ulaşmasına izin verin. Bakteri canlılığını korumak için ortamı her sekiz ila 16 saatte bir değiştirin. Biyofilmleri görselleştirmek için, önce daha önce tarif edildiği gibi kültür süpernatantlarını çıkarın ve biyofilmleri 200 mikrolitre steril salin kullanarak iki kez nazikçe yıkayın.

Biyofilmler yıkandıktan sonra, sekiz kuyulu bir oda slaytı için her bir oyuğa 200 mikrolitre arka ışık canlı ölü leke ekleyin. Toplam iki mililitre leke çözeltisi oluşturun. Slaytı karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

Bu adımdan itibaren, slaytı ışıktan koruduğunuzdan emin olun. Slaytı karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Hücreler lekelendikten sonra, canlı ölü lekeyi çıkarın ve her bir kuyuyu iki kez tuzlu su ile yıkayın.

Daha önce gösterildiği gibi, her bir oyuğa 200 mikrolitre nötr tamponlu formin ekleyin ve numuneyi sabitlemek için slaytı oda sıcaklığında en az 30 dakika inkübe edin. Bu inkübasyonu takiben, fiksatifi çıkarın ve atın ve biyofilmleri iki kez yıkayın Salin kullanarak, plastik kuyuları slayttan çıkarın ve her birine yaklaşık 150 mikrolitre salin ekleyin. Contanın üzerine bir kapak fişi yerleştirerek kuyuları iyice kapatın, kabarcık olmadığından emin olun ve kapak fişinin kenarlarını montaj ortamı ile kapatın.

Alternatif olarak, kapak kızağını kapatmak için oje kullanılabilir. Bu örnekte oje kullanıyoruz Prosedürün daha iyi görselleştirilmesi için, biyofilmleri mikroskop altında incelemeden önce dolgu macununun oda sıcaklığında en az bir saat kurumasını bekleyin. Bu görüntü, konfokal bir mikroskop kullanılarak toplanan canlı ölü lekeli bir H influenza biyofilminin Zack görüntülerinin üç boyutlu bir rekonstrüksiyonudur.

Burada gösterilen biyofilm, hazne slaytında 24 saatlik büyümeden sonra NTHI tarafından oluşturulan bir biyofilm örneğidir. Bu tekniği kullanarak, bakteriler yeşil floresan ve kırmızı floresan yokluğu ile belirtildiği gibi fiksasyon sırasında canlıydı. Biyofilmin mimarisi, biyofilm yapısı içindeki çok sayıda kule ve mevcut birçok su kanalı ile oldukça net bir şekilde görülebilir.

Panel B'deki yan görünüm, bu zaman noktasında oluşan biyofilmin göreceli yüksekliğini göstermektedir. Bu prosedürü denerken, kuyuda bulunan biyofilmi bozabilecek saf kuvvetlerin oluşumunu en aza indirmek için sıvıları kuyuya yavaşça ekleyip çıkarmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü izleyerek, biyofilmdeki bakteriler tarafından oluşturulan matris içinde bulunan biyokimyasal bileşenlerle ilgili ek soruları yanıtlamak için ilgilenilen spesifik proteinler için immüno-etiketleme veya lektin etiketleme gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, bakteriyel biyofilm oluşumunu incelemek için sekiz kuyulu odacıklı bir slaydın nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.