İnsan Cilt Yetişkin Epitel Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

Bu prosedürün genel amacı, yetişkin epitel kök hücrelerini insan derisinden izole etmek ve kültürlemektir. Bu, önce yüz germe veya başka bir ameliyattan elde edilen taze insan derisinin bir santimetre genişliğinde şeritler halinde kesilmesi ve disk boşluğu içeren ortamlarda inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. Cilt daha sonra taze ortamda durulanır ve saç kökleri koparılır.

Daha sonra foliküller diseksiyon mikroskobu altında incelenerek telojen ve antijen foliküllerine ayrılır, işlemin son aşaması tripsin foliküllerinin tek hücreli süspansiyon haline getirilmesi ve kültür kaplarında kaplanmasıdır. Sonuç olarak, faz kontrastı yoluyla klonojenik hücre büyümesini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Mikroskopi: Bu yöntemin görsel gösterimi, kesme, koparma ve tanımlama adımlarının öğrenilmesi zor olduğu için kritiktir, çünkü çok az kişi cilt ve saç foliküllerinin mikroskobik yardımlı diseksiyonuna aşinadır.

Epitelyal kök hücrelerin insan derisinden çıkarılmasına başlamak için, taze insan kafa derisi derisini, folikülleri kesmemek için saç büyümesine paralel olarak kesilmiş bir santimetre genişliğinde şeritler halinde kesin. Cildi% 10 FBS ve mililitre başına dört miligram içeren DMEM ile konik bir tüpe ekleyin. Disk tabanı.

Numuneyi 37 santigrat derecede iki ila dört saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, cildi% 10 FBS içeren taze DMEM ile durulayın ve steril bir petri kabına yerleştirin. Her bir saçı forseps ile tabandan sıkıca ve pürüzsüz bir şekilde çekerek folikülleri toplayın.

İzole edilmiş saç köklerini taze ortama yerleştirin. Daha sonra, telojen aşamasında folikülleri seçmek için bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Morfolojilerine bağlı olarak, şişkinlik bölgesini kesin ve folikülleri 15 mililitrelik sterilize edilmiş bir tüpe aktarın.

Ek olarak, antijen folikülleri kullanılabilir. Kök hücrelerin saç folikülü şişkinlik bölgesini elde etmek için foliküllerin üst üçte birini kesin veya ampul köprüsünü matriks transit yükseltici hücreleri izole etmek için kesin ve toplama tüpüne ekleyin. Daha sonra 15 ila 20 dakika boyunca dört mililitre bire bir% 0.05 tripsin EDTA ve 0.53 milimolar tetra sodyum EDTA çözeltisi ekleyin.

Oda sıcaklığında, ayrılmış hücreleri karıştırmak için tüpü periyodik olarak çalkalayın, bir diseksiyon kapsamı altında görselleştirilebilir. Sindirimin ilerlemesini izlemek için. Sindirimi durdurmak için dört mililitre DMEM artı FPS ekleyin ve beş dakika santrifüjleyin.

800 RPM'de, hücreleri kaybetmemek için yaklaşık 0,2 ila 0,5 mililitre tasarruf ederek süpernatı dikkatlice atın ve EGF olmadan bir mililitre keratinosit ortamında yeniden süspanse edin. Epitelyal kök hücreler kültür için kaplanmadan önce, altı irade mitomisin C tabağı, üç T, üç J, iki besleyici hücre yazılı protokole göre hazırlanmalıdır. Daha sonra, izole edilmiş saç folikülü kök hücrelerinin, hücreleri gece boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede, ertesi gün% 5 karbondioksitte kuluçkaya yatırdığını görün.

Besiyeri, epidermal büyüme faktörü olan keratinosit ortamına dönüşmüş ve inkübatöre geri dönmüştür. Hücreleri her iki günde bir keratinosit ortamı artı EGF ile besleyin ve 14 ila 20 gün boyunca büyütün. Kök hücreleri geçmek için besleyici hücrelerin çıkarılması gerekir.

İlk olarak, hücreleri bir kez PBS ile yıkayın ve hücreleri kaplamak için yeterli oda sıcaklığında, 0.53 milimolar tetra sodyum EDTA ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tabağı hafifçe sallayın ve üç T üç J iki besleyici hücre ayrılacak, besleyici hücrelerden aspire edilecektir.

Kök hücre plakasını PBS ile bir kez durulayın ve 37 santigrat derece önceden ısıtın, her bir oyuğa üzerini örtecek kadar EDTA'da iki kez açın. Hücreler, saç folikülü kök hücrelerinin tamamen ayrılmasına izin vermek için yedi ila 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edilir. Hücreler ayrıldıktan sonra, tripsini durdurmak için EGF içermeyen yaklaşık 500 mikrolitre keratinosit ortamı ekleyin ve hücreleri dağıtmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.

Hücreleri konik bir tüpte toplayın ve beş dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin. Süpernatı aspire edin ve hücreleri EGF olmadan keratinosit ortamında yeniden süspanse edin. Son olarak, hücreleri sayın ve üç T üç J iki hücre tabakası ile muamele edilmiş bir mitomisin C üzerine refüle edin.

Kök hücreleri ölümsüzleştirmek için, altı oyuklu bir plakanın oyuğu başına 350.000 kök hücre, üç T, üç J, iki besleyici hücre muamele edilmiş bir mitomisin C tabakası üzerine yerleştirilir. Hücreleri iki gün boyunca kültürleyin, ikinci gün, yazılı protokolde açıklandığı gibi iki saat boyunca HPV 16, E altı ve E yediyi mitomisin C ile kodlayan PA üç 17 LX SN 16 E altı E yedi hücreyi tedavi edin. İnkübasyondan sonra, tedavi edilen hücreleri birincil epitel kök hücrelerine ekleyin, EGF ile keratinosit ortamında altı gün boyunca bir seçim kontrol ko-kültürü olarak bir kök hücre oyuğu tedavi edilmeden bırakın, altı gün sonra ortamı her iki günde bir değiştirin, besleyiciyi çıkarın ve 0.53 milimolar tetra sodyum e dta ile muamele ederek üç 17 hücreyi PA edin.

Daha önce olduğu gibi, 200.000 mitomisin C ile muamele edilmiş üç T, üç J, iki NHP hücresi ekleyin. Üç T üç J iki NHP hücresi, seçim prosedürü için gerekli olan neomisin, higromisin ve saf misine dirençli besleyici hücrelerdir. Seçim kültürü için, mililitre ilaç başına 0.2 miligramın altındaki hücreler veya altı gün daha G dört 18.

KERATİNOSİT ortamı artı EGF içeren taze G four 18'i her iki günde bir yenileyin. Hayatta kalan epitelyal kök hücreler, bu parlak alan görüntüsünde ölümsüzleştirilen kök hücreler olacaktır. Deriden alınan epitelyal kök hücreler, keratinosit ortamında kültürlendiğinde E tarafından belirlenen sıkı epitel kolonileri oluşturur ve F ile gösterilen bir besleyici hücre tabakası ile burada gösterilen, epitel büyümelerine yol açan saç folikülü implantlarıdır.

T ile belirlenen telojen çıkıntı bölgesi tabağa bağlanır ve besleyici hücrelerle birlikte epitel hücre kolonisi ile çevrelenir. Kültürdeki kök hücre kolonileri, burada yeşil renkle gösterilen sitokeratin 15 gibi epitel belirteçlerinin ekspresyonunu korur ve saç folikülü soyu boyunca farklılaştığında pluripotensi korur. Deri epitel kök hücreleri, bir kıl folikülü belirteci olan K six hf'yi eksprese eder.

Ek olarak, hücreler hava sıvı arayüzünde de epidermis, dermis veya diğer matrisler üzerinde kültürlenebilir ve kornifiye bir tabaka, granüler tabaka ve dikenli tabaka ile tabakalı bir epidermis oluşturacaktır. Ve son olarak, yağ soyu boyunca indüklenen kök hücrelerden yağ kırmızısı pozitif kürecikler görülebilir. Bu prosedürü takiben, kök hücre fenotipinin korunmasında rol oynayan genler hakkında ek soruları yanıtlamak için kendini yenileme proliferasyonu, hücre göçü, adezyon ve farklılaşma için kök hücre testleri yapılabilir.