Kanser Hücreleri Endotel Hücre Tek tabakalı Invasion Tedbir Gerçek zamanlı Elektrik Empedans Tabanlı Tekniği

Bu video, gerçek zamanlı elektriksel empedans tabanlı bir teknik kullanarak bir endotel hücresi tek tabakasının kanser hücreleri tarafından istilasını izlemek için bir yöntemi göstermektedir. İlk olarak, VE olarak adlandırılan insan umbilikal ven endotel hücreleri, kuyu dibinde altın elektrotlarla kaplanmış 16 kuyulu EPL'ye oturtulur. Birleşen bir tek tabaka oluşturmak için, VE'ye bağlanan ve HVAC tek tabakasını istila eden ve endotel hücre bağlantılarını bozan kanser hücreleri eklenir Hücreler tarafından kaplanan kuyu tabanının toplam alanına bağlı olan empedans okumaları daha sonra elde edilir.

İstilanın kapsamı daha sonra elektrik empedansındaki değişikliklere bağlı olarak belirlenebilir. Bu tekniğin veya boşluk odası ve METROGEL tahlilleri gibi mevcut yöntemlerin ana avantajı, endotel hücreli tümör hücresi etkileşimlerinin in vivo metastatik süreci daha yakından taklit etmesi ve verilerin gerçek zamanlı olarak elde edilmesi ve diğer yöntemler için uç nokta analizinin aksine daha kolay ölçülebilir olmasıdır. Bu yöntem kanser hücresi istilası hakkında fikir verebilir.

Bağışıklık sistemindeki hücre hücre etkileşimlerinin araştırılması gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Ayrıca, UX hücrelerinin büyümesini gözlemlediğimiz deneyin ilk aşaması, prosedürü gösteren daha fazla invazyon adımı olmadan herhangi bir hücre hattının hücre proliferasyonunu değerlendirmek için kullanılabilir. Bu protokolün tüm aşamaları steril koşullar altında doku kültürü başlığında yapılmalıdır.

Bu deney için kullanılan Xcel sistemi, yalnızca bu cihazın ilk kullanımında kullanılmak üzere 37 santigrat derece %5'lik bir karbondioksit inkübatöründe kalıcı olarak tutulur. Cihaz, yeni sıcaklık ve nem ortamına uyum sağlamak için en az 16 saat inkübatörde bırakılmalıdır. Ardından, Thence EPL 16'yı 37 santigrat derecede bir saat boyunca %0,1 jelatin ile kaplayarak hazırlayın.

Plaka kaplandıktan sonra, PBS ile bir kez yıkayın. Daha sonra boş bir okuma yapmak için 100 mikrolitre sulandırılmış e gm iki orta ekleyin. Hücre yokluğunda arka plan empedansını ölçmek için.

EPL'yi bilgisayardaki Excel aracı sistemine yerleştirin. Yazılım penceresinde masaüstünde bulunan RTCA yazılım simgesine tıklayarak Excel aracısı yazılımını açın. Düzen sekmesine tıklayın ve numune içeren kuyuları seçin.

Gerçek zamanlı veri toplama sıklığını programlamak. Program sekmesine tıklayın, ardından bir adım ekle simgesine tıklayın, süpürmeler okuma sayısını ve aralıklar okumalar arasındaki zaman aralığını gösterir. Bunlar otomatik olarak sırasıyla bir ve 1.00 dakikaya ayarlanır.

Bu, sistemi bir arka plan okuması yapacak şekilde programlar. Bir adım ekle'ye tıklayın ve süpürme kutusuna 300 ve aralıklar kutusuna 10 dakika girin. Bu, cihazı 50 saate kadar empedans ölçümleri yapacak şekilde programlayacaktır.

Deneye başlamak için bir adım başlat simgesine tıklayın. Her bir kuyunun arka plan empedansı, arka plan ölçümü yapıldıktan sonra ölçülecektir. Pencerede mesaj görüntülenir.

Bir sonraki adıma hazır, lütfen tıklayın. Başlamak için bir sonraki adım. Bu sırada, hücreler eklenebilir ve tarif edildiği gibi bir tek tabakanın oluşumu izlenebilir.

Bir sonraki bölümde, burada kullanılan insan göbek damarı, endotel hücreleri veya VE, büyüme faktörleri takviyeleri içeren EGM iki mermi kiti ile sulandırılan EGM iki besiyerinde kültürlenir ve %5'lik FBS hücreleri, %5 karbondioksit varlığında 37 derecelik bir inkübatörde muhafaza edilmelidir. Deney gününde, HUB E'nin akıcılığını kontrol edin Mikroskop altında, hücreler düşük bir geçiş sayısı olmalı, tercihen altıdan fazla ve %75'ten az olmamalıdır. Bir renk tonu oluşturmak için akıcı, tek tabakalı hücreleri tripsin ile hasat edin. Hücreler şişeden ayrıldıktan sonra, tüm tripsin izleri 200 G'de santrifüjleme ile uzaklaştırılmalıdır.

Daha sonra hücreleri yeniden askıya alın ve e GM iki ortamını mililitre başına 10 ila beşinci hücrenin 2.5 katı bir konsantrasyona yeniden oluşturun. Hücreler yeniden askıya alındıktan sonra, arka planda kalibre edilmiş EPL'yi EXOGEN sisteminden çıkarın ve halihazırda plakada bulunan 100 mikrolitre E GM iki ortamına 100 mikrolitre HX süspansiyonu ekleyin. EPL'yi hemen Excel sistem hücre analizörüne yerleştirin.

Yazılım penceresindeki başlat adımı düğmesine tıklayarak empedans okumalarını almaya başlayın. Endotel hücrelerinin büyümesine izin verin. Sistem her 10 dakikada bir empedans okumaları almaya devam edecektir.

Uve, tohumlamadan dört ila altı saat sonra hücre indeksinde karakteristik bir geçici düzleşme ve ardından 16 ila 18 saat sonra başka bir stabilizasyon gösterir. Bu nedenle, hücrelerin en az 18 saat boyunca birleşik bir tek tabaka oluşturmasına izin vermek önemlidir. Bir tek tabaka oluştuğunda, istila testine hazırlık olarak istilacı hücreleri eklemenin zamanı gelmiştir.

İstilacı tümör hücrelerini hazırlayın. Burada osteosarkom hücreleri kullanılır. Hücreleri tripsin ile hasat ederek başlayın.

Hücreleri 200 G'de döndürerek ve bir kez PPS ile yıkayarak tüm tripsin izlerini çıkarın. Yıkama reusunu takiben,% 10 FBS içeren RPMI veya DMEA ortamı gibi tümör hücrelerini büyütmek için kullanılan ortamda mililitre başına 10 ila beşinci hücre son yoğunlukta hücreleri askıya alın. Yazılım penceresindeki duraklatma adımı simgesine tıklayarak denemeyi duraklatın.

EPL'yi çıkarın ve EGM iki ortamını vakum tek katmanından aspire edin. Dördüncü hücrelere bir çarpı 10 içeren 100 mikrolitre tümör hücresi süspansiyonu ekleyin. Genel olarak, bir ila 2.5 tümör hücresinin endotel hücrelerine oranı, tahlil için en iyi sonucu verir.

Bununla birlikte, oran tek tek hücre hatları için optimize edilebilir. EPL'yi inkübatördeki Excel aracı sistemine geri yerleştirin. 10 dakikalık aralıklarla empedans okumaları almaya devam etmek için devam adımına tıklayın.

Önümüzdeki altı ila 12 saat içinde istilayı gerçek zamanlı olarak izleyin. Hücre indeksindeki bir düşüş, endotel bağlantılarının geri çekilmesi ve istilacı tümör hücrelerinin penetrasyonundan kaynaklanacaktır. Deney bittiğinde, sonuçları istilacı tümör hücrelerinin eklenme zamanına göre normalleştirmek için ekserjen yazılımını kullanın.

Ekserjen yazılımı, herhangi bir zaman noktasına normalizasyona izin verir, VEX, bu videoda gösterildiği gibi ekserjen sistemi üzerinde kültürlendi ve tek tabakanın oluşumunu takiben K yedi M iki hücre veya K 12 hücreleri eklendi. Burada gösterildiği gibi, K yedi M iki hücrenin eklenmesinden sonraki birkaç saat içinde hücre indeksinde keskin bir azalma meydana gelir. K yedi M iki, oldukça metastatik bir osteosarkom hücre hattıdır.

Bu hücreler, hücre hattının invaziv özelliklerini açıklayan hücre iskeleti bağlayıcı protein ene'nin yüksek seviyelerini eksprese eder. Öte yandan, K 12 hücreleri daha az metastatiktir ve endotel monotabakasına K yedi M iki hücre kadar verimli bir şekilde nüfuz edemezler. Bu, burada gösterildiği gibi hücre indeksinde daha az derin bir azalma ile temsil edilir.

Burada gösterilen kontrol, uve tek tabakasının empedansını temsil eder. Kanser hücrelerinin yokluğunda, deneyler üç kopya halinde gerçekleştirildi. Bu videoyu izledikten sonra, bir endotel hücresi tek tabakası oluşturarak ve tek tabakaya kanser hücreleriyle meydan okuyarak istilayı gerçek zamanlı olarak nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

HU XL tek tabaka oluşumunu içeren deneyin ilk adımları, empedans ile hücre proliferasyonunu değerlendirmek için kullanılabilir. İki.