Kanser Hücreleri Endotel Hücre Tek tabakalı Invasion Tedbir Gerçek zamanlı Elektrik Empedans Tabanlı Tekniği

Bu video, gerçek zamanlı elektriksel empedans tabanlı bir teknik kullanarak kanser hücrelerinin endotelyal hücre monokatmanına invazyonunu izleme yöntemini göstermektedir. İlk olarak, VE olarak adlandırılan insan göbek veni endotelyal hücreleri, kuyucuk tabanında altın elektrotlarla kaplanmış 16 kuyucuklu EPL'lere yerleştirilir. Konfluent bir monokatman oluşturmak için kanser hücreleri eklenir; bu hücreler VE'lere tutunur ve endotelyal hücre bağlantılarını bozarak HVAC monokatmanına invaze olur. Ardından, kuyucuk tabanının hücrelerle kaplanan toplam alanına bağlı olan empedans okumaları alınır.

İnvazyonun boyutu, elektriksel empedanstaki değişikliklere dayanarak belirlenebilir. Bu tekniğin boşluk odası (void chamber) ve METROGEL assayleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, endotel hücre ile tümör hücresi etkileşimlerinin in vivo metastatik süreci daha yakından taklit etmesi ve verilerin, diğer yöntemlerdeki son nokta analizinin aksine gerçek zamanlı olarak elde edilip daha kolay nicelendirilebilmesidir. Bu yöntem, kanser hücresi invazyonu hakkında bilgi sağlayabilir.

Bu yöntem, bağışıklık sistemindeki hücre-hücre etkileşimlerinin incelenmesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Ayrıca, UX hücrelerinin büyümesini gözlemlediğimiz deneyin başlangıç aşaması, başka herhangi bir invazyon adımına gerek kalmadan herhangi bir hücre hattının proliferasyonunu değerlendirmek için kullanılabilir; prosedür, laboratuvarımdaki lisansüstü öğrencisi Rahim tarafından gösterilecektir. Bu protokolün tüm adımları, doku kültürü davlumbazında steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir.

Bu deneyde kullanılan Xcel sistemi, ilk kullanımında yalnızca bu cihaza ayrılmış olan 37 °C ve %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde sürekli olarak tutulur. Cihazın, yeni sıcaklık ve nem ortamına uyum sağlaması için inkübatörde en az 16 saat bekletilmesi gerekir. Ardından, Thence EPL 16'yı 37 °C'de bir saat boyunca %0,1 jelatin ile kaplayarak hazırlayın.

Plaka kaplandıktan sonra, bir kez PBS ile yıkayın. Ardından, boş okuma yapmak için 100 µL yeniden konfigüre edilmiş e gm two medyum ekleyin. Bu işlem, hücrelerin yokluğunda arka plan empedansını ölçmek içindir.

EPL'yi bilgisayardaki Excel agent sistemine yerleştirin. Yazılım penceresindeki masaüstünde bulunan RTCA yazılım simgesine tıklayarak Excel agent yazılımını açın. Düzen sekmesine tıklayın ve numuneleri içeren kuyucukları seçin.

Gerçek zamanlı veri toplama sıklığını programlamak için program sekmesine tıklayın, ardından adım ekle simgesine tıklayın; "sweeps" okuma sayısını, "intervals" ise okumalar arasındaki zaman aralığını belirtir. Bunlar otomatik olarak sırasıyla bir ve 1.00 dakika olarak ayarlanmıştır.

Bu işlem, sistemin bir arka plan okuması gerçekleştirmesini sağlar. Bir adım ekle (add a step) seçeneğine tıklayın; tarama (sweeps) kutusuna 300, aralıklar (intervals) kutusuna ise 10 minutes girin. Bu işlem, cihazı 50 saate kadar empedans ölçümleri gerçekleştirmek üzere programlayacaktır.

Deneye başlamak için bir adımı başlat simgesine tıklayın. Arka plan ölçümü gerçekleştirildikten sonra her bir kuyucuğun arka plan empedansı ölçülecektir. Pencere mesajı görüntüler.

Bir sonraki adım için lütfen tıklayın. Başlamak için sonraki adıma geçin. Bu aşamada, hücreler eklenebilir ve monokatman oluşumu tarif edildiği gibi izlenebilir.

Bir sonraki bölümde, burada kullanılan insan göbek veni endotel hücreleri veya HUVEC'ler, büyüme faktörü takviyelerini içeren EGM-2 bullet kit ile yeniden oluşturulmuş EGM-2 besiyeri ve %5 FBS ile kültüre edilmiştir; hücreler 37 °C'lik bir inkübatörde, %5 karbondioksit varlığında tutulmalıdır. Deney gününde, HUVEC'lerin konfluensini mikroskop altında kontrol edin; hücreler düşük pasaj numarasına sahip olmalı, tercihen altıdan fazla olmamalı ve tek katmanlı bir yapı oluşturmak için %75'ten daha az konfluent olmalıdır; hücreleri tripsin ile hasat edin. Hücreler flasktan ayrıldıktan sonra, tüm tripsin kalıntıları 200 ×g'de santrifüjle uzaklaştırılmalıdır. Santrifüj işleminin ardından hücreleri bir kez PBS ile yıkayın.

Ardından hücreleri ve yeniden oluşturulmuş EGM-2 medyumunu, mililitrede 2,5 x 10⁵ hücre konsantrasyonuna gelecek şekilde tekrar süspande edin. Hücreler süspande edildikten sonra, EXOGEN sisteminden kalibre edilmiş arka plan EPL'yi çıkarın ve plaktaki mevcut 100 µL EGM-2 medyumuna 100 µL HX süspansiyonu ekleyin. EPL'yi derhal Excel sistem hücre analizörüne yerleştirin.

Yazılım penceresindeki başlatma adımına tıklayarak empedans okumalarını almaya başlayın. Endotel hücrelerinin büyümesine izin verin. Sistem, her 10 dakikada bir empedans okumaları almaya devam edecektir.

Uve hücreleri, ekimden dört ila altı saat sonra hücre indeksinde karakteristik bir geçici düzleşme gösterir ve ardından 16 ila 18 saat sonra bir başka stabilizasyon gerçekleşir. Bu nedenle, hücrelerin en az 18 saat boyunca konfluen bir monotabaka oluşturmasına izin vermek önemlidir. Monotabaka oluştuktan sonra, invazyon deneyi hazırlığı için invaze eden hücrelerin eklenme zamanı gelmiş demektir.

İstila eden tümör hücrelerini hazırlayın. Burada osteosarkom hücreleri kullanılmıştır. Hücreleri tripsin ile toplayarak başlayın.

Hücreleri 200 G'de santrifüj ederek ve bir kez PPS ile yıkayarak tüm tripsin kalıntılarını giderin. Yıkama işleminin ardından, tümör hücrelerini büyütmek için kullanılan %10 FBS içeren RPMI veya DMEA ortamı gibi bir besiyerinde, hücreleri mililitre başına 1x10⁵ hücre nihai yoğunlukta süspansiyona getirin. Yazılım penceresindeki duraklatma adım simgesine tıklayarak deneyi duraklatın.

EPL'yi kaldırın ve vak monolayer'dan EGM two medyumunu aspire edin. 1x10⁴ hücre içeren 100 µL tümör hücresi süspansiyonu ekleyin. Genellikle, bu analiz için tümör hücrelerinin endotel hücrelerine 1:2,5 oranında eklenmesi en iyi sonucu verir.

Bununla birlikte, oran bireysel hücre hatları için optimize edilebilir. EPL'yi inkübatördeki Excel ajan sistemine geri yerleştirin. 10 dakikalık aralıklarla empedans ölçümleri almaya devam etmek için devam adımına tıklayın.

Sızmayı sonraki 6 ila 12 saat boyunca gerçek zamanlı olarak izleyin. Endotel bağlantılarının geri çekilmesi ve istilacı tümör hücrelerinin penetrasyonu sonucunda hücre indeksinde bir düşüş meydana gelecektir. Deney sona erdiğinde, sonuçları istilacı tümör hücrelerinin eklendiği zamana göre normalize etmek için exergen yazılımını kullanın.

Exergen yazılımı, bu videoda gösterildiği gibi, VEX'lerin exergen sisteminde kültüre edildiği herhangi bir zaman noktasına göre normalizasyon yapılmasına izin verir ve monolayer oluşumunu takiben ya K seven M two hücreleri ya da K 12 hücreleri eklenmiştir. Burada gösterildiği üzere, K seven M two hücrelerinin eklenmesinden sonraki birkaç saat içinde hücre indeksinde keskin bir düşüş meydana gelir. K seven M two, yüksek derecede metastatik bir osteosarkom hücre hattıdır.

Bu hücreler, hücre hattının istilacı özelliklerini açıklayan sitoskeletal bağlantı proteini ene'yi yüksek seviyelerde eksprese ederler. Öte yandan K 12 hücreleri, daha az metastatikle çalışırlar ve endotelyal tek tabakayı K seven M two hücreleri kadar verimli bir şekilde geçemezler. Bu durum, burada gösterildiği gibi hücre indeksindeki daha az belirgin bir düşüşle temsil edilmektedir.

Burada gösterilen kontrol, uve tek tabakasının empedansını temsil etmektedir. Kanser hücrelerinin yokluğunda, deneyler üç tekrarlı olarak gerçekleştirilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, bir endotel hücre tek tabakası oluşturarak ve bu tek tabakayı kanser hücreleriyle zorlayarak invazyonun gerçek zamanlı olarak nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

HU XL monotabaka oluşumunu içeren deneyin başlangıç adımları, hücre proliferasyonunu empedans yoluyla değerlendirmek için kullanılabilir.İki.