Name: Kanser Hücreleri Endotel Hücre Tek tabakalı Invasion Tedbir Gerçek zamanlı Elektrik Empedans Tabanlı Tekniği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Öğrenin, kanser hücrelerinin endotel hücre tek tabakasına invazyonunu gerçek zamanlı elektrik empedans tekniğiyle izleme yöntemini. HUVEC kullanılarak metastatik süreçler canlandırılır ve invazyon dinamikleri nicel olarak değerlendirilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma cömertçe Çocuk Kanseri Vakfı (Baltimore, MD), Brandon Carrington Lee Vakfı (Silver Spring, MD), DOD (W81XWH-10-1-0137) ve NIH (R01CA108641) fon tarafından desteklenmiştir. Biz Dr Anton Wellstein ve deneyim paylaşımı ve sunulan yöntemleri optimize etmek için bize yardımcı olduğunuz için onun laboratuvar üyelerine teşekkür etmek istiyorum.

1. Hazırlık <ol><li> Tüm adımlar, bir doku kültürü kaputu steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir. </li><li> XCELLigence istasyonu% 5 CO2 varlığında, 37 ° C inkübatör içine yerleştirilir. </li><li> Geçit 6 daha tercihen en fazla düşük geçiş HUVEC hücreleri, kullanın. Ayrıca, hücreleri daha fazla hasat sırasında birleşik% 75 daha olduğundan emin olun. </li><li> HUVEC hücreleri, büyüme faktörleri, ek ve% 5 cenin sığır serumu içeren EGM-2 mermi kiti (Lonza'dan Biosciences) ile sulandırılır EGM-2 ortamında yetiştirilir. </li><li> Tripsin tüm izleri, 200xg de hücre iplik bir kez PBS ile yıkama ve belirtilen hücre yoğunlukları bunları tekrar süspanse ederek hücre süspansiyonları çıkarılmalıdır. </li><li> 37 ° C'de 1 saat süreyle% 0.1 jelatin ile kaplayın XCELLigence e-levhası 16 ° C ya da gece boyunca 4 ° C'de PBS ile plaka yıkayın ve 100μL sulandırılmış EGM-2 medya ekleyin. Arka plan ölçmek için XCELLigence sistemde boş bir okuma yapınhücrelerin yokluğunda empedansı. </li></ol> 2. HUVEC tek tabaka oluşturma <ol><li> Tripsinizasyon ile HUVEC hücreleri bir alt konfluent şişeye hasat. 2.5 x 10 5 hücre / ml 'lik bir nihai yoğunluğa sulandırılmış EGM-2 ortamı içinde yeniden süspanse hücreleri. </li><li> 100μL EGM-2 medya içeren e-plaka kalibre bir arka plan her kuyuya, HUVEC hücre süspansiyonu (2.5 x 10 4 HUVEC hücreleri) 100μL ekleyin. </li><li> Hemen XCELLigence aracı E-Plaka yerleştirin. </li><li> Program XCELLigence yazılım 10 dakikalık aralıklarla empedans okuma gerçekleştirmek için. </li><li> Bir tek tabaka oluşturacak kadar endotel hücreleri gibi (Şekil 2) hücre indeksi bir düzleşme kanıtladığı, 18-21 saat boyunca büyümesine izin. </li></ol> 3. Hücre ve veri normalleştirme işgal eklenmesi. <ol><li> Bir kez istikrarlı bir HUVEC tek tabaka bir son dens için trypsinization ve tekrar süspansiyon tarafından hasat tümör hücreleri, kurdu1 x 10 5 hücre / tümör hücreleri (RPMI ortam ya da DMEM% 10 FBS içeren gibi) yetiştirmek için kullanılan ortam içinde ml Sığ </li><li> Pause empedans XCELLigence yazılım okuma ve istasyondan E-Plaka çıkarın. </li><li> Aspirasyonu ile EGM-2 ortamı çıkarın. 1 x 10 hücre ihtiva eden 4 tümör hücre süspansiyonu 100μL ekleyin. Genel olarak, tümör hücre oranı 1:2.5: endotel hücreleri ekilmiş, tahlil için iyi çalışır. Bununla birlikte oran, tek bir hücre hatları için optimize edilebilir. </li><li> Inkübatör XCELLigence sistemine E-plaka koyun ve 10 dakika aralıklarla empedans okumaları devam ediyor. </li><li> Invasion tümör hücreleri işgal ederek endotel kavşaklar ve penetrasyon geri çekme nedeniyle hücre indeksi bir düşüş olarak önümüzdeki 6-12 saat üzerinden gerçek zamanlı olarak izlenebilir. </li><li> Tümör hücreleri istila ilavesi zaman sonuç normalize. XCELLigence yazılım, herhangi bir zaman noktasında ve sonuçlarına normalleşme izindoğrudan yazılım penceresinde görülebilir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Metastatik ve metastatik olmayan hücreler tarafından HUVEC tek tabaka işgali bir örneği, Şekil 3'te gösterilmiştir. K7M2 metastatik osteosarkoma hücre hattıdır. Bu hücreler bu hücre hattı 13,14 invaziv özellikleri oluşturan, sitoskeletal bağlayıcı proteinin Ezrin yüksek düzeyde ifade eder. HUVEC hücreleri K7M2 hücreleri ile meydan olduğunda, 6 saat içinde elektrik direnci bir düşüş vardır. Elektrik direnci bu düşüş işgalci tümör hücreleri tarafından HUVEC tek tabaka işgali temsil eder. K12 hücre hattı ile, diğer taraftan, Ezrin çok daha düşük seviyelerde ifade eden ve 13 ve sonuçta daha az metastatik. Hücrelere bağlı veya HUVEC tek tabaka (Şekil 3) ile işgal edemiyoruz gibi direnci daha az dik açılan K12 hücreleri sonuçları ile HUVEC tek tabaka Zorlu. <imgsrc files alt='"Şekil'></imgsrc> Şekil 1. Tümör hücreleri tarafından endotel hücreleri işgali için iş akış süreci şematik diyagramı. HUVEC hücreleri jelatin kaplı E-plakaları üzerine kaplanmış ve konfluent tek tabaka oluşturmak için izin verilir. Bir tek tabaka oluşturmuştur ve hücre indeksi endotel tek tabaka işgali nedeniyle değiştirir gibi işgali gerçek zamanlı olarak takip edilmektedir kez malign hücre eklenir. <img src="/files/ftp_upload/2792/2792fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2,"> Şekil 2. HUVEC tek tabaka oluşumu. HUVEC hücrelere tutunur ve jelatin kaplı altın elektrotlar üzerinde yayılmış gibi hücre indeksi değişiklikler. Konfluent tek tabaka oluşumu, 18 saat sonra hücre indeksi bir sabitleme ile temsil edilir. <img src="/files/ftp_upload/2792/2792fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3,"> Şekil 3,. K7M2 ve K12 osteosarkom hücreleri tarafından HUVEC hücrelerinin Invasion. Cel bir dik düşüşl-indeksi yüksek metastatik K7M2 hücrelerinin giriş birkaç saat içinde ortaya çıkar. K12 hücreleri, diğer yandan daha az metastatik ve verimli olarak K7M2 hücreleri gibi endotel tek tabaka nüfuz etmek mümkün değildir. Bu HUVEC tek tabaka K12 hücreleri ile meydan hücre endeksinde daha az dik düşüş ile temsil edilmektedir. Kontrol kanser hücrelerinin yokluğunda HUVEC tek tabaka empedans temsil eder. Deneyler, üç kopya halinde gerçekleştirildi.

<ol><li>Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer.+The+metastasis+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer. The metastasis cascade.</a> Science. 321, 1785-1787 (2008).</li>
<li>Chiang, A. C., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of metastasis.</a> N Engl J Med. 359, 2814-2823 (2008).</li>
<li>Orr, F. W., Wang, H. H., Lafrenie, R. M., Scherbarth, S., Nance, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+cancer+cells+and+the+endothelium+in+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interactions between cancer cells and the endothelium in metastasis.</a> J Pathol. 190, 310-329 (2000).</li>
<li>Bacac, M., Stamenkovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+cancer+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Metastatic cancer cell.</a> Annu Rev Pathol. 3, 221-247 (2008).</li>
<li>Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+signals+from+the+invasive+front%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">New signals from the invasive front.</a> Nature. 441, 444-450 (2006).</li>
<li>Kramer, R. H., Nicolson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+tumor+cells+with+vascular+endothelial+cell+monolayers%3A+a+model+for+metastatic+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interactions of tumor cells with vascular endothelial cell monolayers: a model for metastatic invasion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5704-5708 (1979).</li>
<li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 3761-3764 (1984).</li>
<li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromotion+of+mammalian+cells+measured+electrically%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Micromotion of mammalian cells measured electrically.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).</li>
<li>Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+method+for+detection+of+endothelial+cell+shape+change+in+real+time%3A+assessment+of+endothelial+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 7919-7923 (1992).</li>
<li>Whipple, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+promotes+tubulin+Detyrosination+and+Microtentacles+that+enhance+endothelial+engagement%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition promotes tubulin Detyrosination and Microtentacles that enhance endothelial engagement.</a> Cancer Res. 70, 8127-8137 (2010).</li>
<li>Boyd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-microelectronic+sensing+technique+for+profiling+cytotoxicity+of+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">A cell-microelectronic sensing technique for profiling cytotoxicity of chemicals.</a> Anal Chim Acta. 615, 80-87 (2008).</li>
<li>Khanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane-cytoskeleton+linker+ezrin+is+necessary+for+osteosarcoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis.</a> Nat Med. 10, 182-186 (2004).</li>
<li>Ren, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin-cytoskeleton+linker+protein+ezrin+is+regulated+during+osteosarcoma+metastasis+by+PKC%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The actin-cytoskeleton linker protein ezrin is regulated during osteosarcoma metastasis by PKC.</a> Oncogene. 28, 792-802 (2009).</li>
</ol>

Bu yazının için yayın maliyet nazik Roche Applied Science tarafından sağlandı.

Gerçek zamanlı HUVEC işgali tahlil izleme işgali için basit ama güçlü bir yöntemdir. Bu son nokta analizi kullanan diğer geleneksel teknikleri üzerinde önemli bir avantaj olan, gerçek zamanlı sonuçlar sağlar. Tahlilinde test ilaçlarının, antikorlar, ligandlar ve metastazının önleyicileri veya uyarıcıları gibi proteinler için modifiye edilebilir. Kanser / endotel hücre çapraz konuşma farklı ajanların etkisi de değerlendirilebilir. Bu kültür ortamı içinde büyüme faktörleri ve uyuşturucu gibi eksojen ajanlar, tanıtan, bu onlar HUVEC tek tabaka bütünlüğünü etkilemez sağlamak için önemlidir. HUVEC tek tabaka bozulması hücreleri istila yokluğunda eksojen ajan tanıtan ve hücre indeksi bir değişiklik yoktur sağlayarak test edilebilir. Bu nedenle, uygun kontrollerin deney tasarımının bir parçası olarak dahil edilmelidir. Bir conf biçimi olarak farklı hücre hatları farklı hücre-indeksi eğrileri göstermekluent tek tabaka. Eğri, hem de yüksek hücre-indeksi elde, şekli, hücre tipine bağlıdır. HUVEC hücreleri 16-18 saat sonra daha yüksek bir hücre dizindeki başka bir istikrar ardından, 4-6 saat tohumlama sonra hücre indeksi düzleştirme bir karakteristik geçici göstermektedir. Bu nedenle, bu hücrelerin, tümör hücrelerinin ilave edilmeden önce en az 18 saat boyunca konfluent tek tabaka oluşturacak izin vermek önemlidir. Hücre indeksi elektrot / hücre interfaz iyonik ortamına bağlıdır, bu tür hücre morfolojisi ve hücre-hücre adezyon kalitesi gibi çeşitli faktörlere de kapalı alt alanında ek olarak, hücre dizini etkiler. Bu nedenle, tümör hücre istilasını üzerine oluşur hücre indeksi azalma, endotel birleşme ve takip eden tümör hücre istilası geri çekme dahil çeşitli faktörlere, bir fonksiyonudur. XCELLigence araç üç farklı konfigürasyonlarda imal edilir: gerçek zamanlı hücre analiz(RTCA) SP, RTCA MP ve RTCA DP. RTCA MP alet 96-E-plakaları aynı anda altı tutabilir ise RTCA SP araçlar, bir 96-E-plaka tutar. Bu ilaçlar ve bileşiklerin yüksek verimli tarama için izin verir. Bu makaledeki deneyler üç 16-iyi E-plakaları tutabilir RTCA DP cihazı kullanılarak yapılmaktadır. Her E-plaka tutma istasyonu bağımsız olarak birden fazla kullanıcı aynı anda deneyler çalıştırmanıza olanak veren, çalıştırılabilir. RTCA DP araç aynı zamanda CIM-plakaları kullanarak göç incelemek için kullanılabilir. Bu 8um bir ortalama gözenek boyutu olan bir polietilen tereftalat (PET) membran ile ayrılan üst ve alt odaları ile 16 oyuklu plakalar vardır. Elektronik sensörler, üst bölmenin gözenekli zarın alt kısmında bulunur. Alt bölme odasının üst hücreleri için kemo-çekici için bir rezervuar olarak hizmet vermektedir. Bununla birlikte, CIM-plakalar üzerinde HUVEC işgali tahlil önemli bir avantajı ise, bu eski içinde tümör hücre istilasını iendotel hücre işgali tümör ve endotel hücreleri arasında çapraz konuşma bağlıdır gibi s, gözenek boyutu ile sınırlı değildir. HUVEC işgali tahlil da Uygulamalı Biyofizik (Troy, New York) tarafından üretilen, ECIS Z enstrüman üzerinde gerçekleştirilebilir. ECIS Z enstrüman dizi ve elektrot konfigürasyonları farklılıklar ile, XCELLigence araç benzer bir teknoloji kullanır. Biz başarıyla 8-iyi ECIS dizileri kullanarak HUVEC işgali deneyleri gerçekleştirdik. 2.5 x 10 5 ve 1 x 10 5 hücre sırası: Bu iyi alt yüzey alanı kaplama için endotelyal ve tümör hücrelerinin daha büyük bir sayı gerektirir ECIS dizileri, daha büyük olduğuna dikkat etmek önemlidir.

<table><tbody><tr><td>xCELLigence RTCA DP istasyonu</td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Roche Grubu</a></td><td>05469759001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA kontrol ünitesi</td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Roche Group</a></td><td>05454417001</td><td>RTCA yazılımı ön yüklü dizüstü bilgisayar</td></tr><tr><td>E-Plate 16</td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Roche Grubu</a></td><td>05469830001</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC hücreleri</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 besiyeri</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 bullet kiti</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>Steril H içinde %0,1 Jelatin&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>EMD Millipore</td><td>MCPROTO045</td><td></td></tr></tbody></table>

kanser hücreleri endotel hücre tek tabakalı invasion tedbir gerçek zamanlı elektrik empedans tabanlı tekniği

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

Malign hücrelerin metastatik yayılması konakçıda, uzak bölgelere bir taşıma aracı olarak kan dolaşımına endotel tabakasının temel membran, vasküler endotelyum, tümör hücrelerinin bağlanma, endotel birleşme geri çekilmesi ve tümör hücre istilası ve son olarak göç bozunma gerektiren 1-3. Bir kez dolaşım sisteminde, kanser hücrelerinin duvarları kapiller ve metastatik tümörler 4,5 oluşturmak için çevre dokuya extravasate uygun. Tümör hücre-endotelyal hücre etkileşiminin çeşitli bileşenleri, kanser hücreleri, insan göbek bağı damarı endotel hücrelerinin (HUVEC) tek tabakalı bir zorlu tarafından in vitro olarak çoğaltılabilir. Elektron ve faz-kontrast mikroskobu ile yapılan çalışmalar in vitro etkinlikleri sırayla oldukça in vivo metastaz 6&#39;da temsil etmektedir. Burada, izler ve gerçek zamanlı invas içinde rakamlarla bir elektrik-empedans tabanlı teknik açıklarhabis tümör hücrelerinin endotel hücrelerinin iyon. Giaever ve Keese ilk hücre popülasyonunun elektrotlar 7,8 yüzeyi üzerinde büyümeye zaman empedans dalgalanmalar ölçmek için bir yöntem tanımlanmıştır. Roche tarafından üretilen XCELLigence enstrüman,, hücrelerin iyi altındaki alanın yaklaşık% 80 kapsayan bir altın mikroelektrot dizi ile kaplı bir kültür çanak eklemek ve yaymak gibi elektrikli empedans değişiklikleri ölçmek için benzer bir teknik kullanır. Hücreleri eklemek ve elektrot yüzeyine yayılmış olarak, 9-12 elektrik empedans bir artışa yol açar. Empedans hücreleri ile kaplıdır de doku kültürü toplam alanı ile doğrudan orantılı olan bir boyutsuz olarak adlandırılan hücre-göstergesi olarak gösterilir. Bu nedenle, hücre dizini, hücre yapışması, yayma, morfolojisi ve hücre yoğunluğunu izlemek için de kullanılabilir. Bu makalede açıklanan işgali tahlil değişikliği esas alınmaktadırelektrot / hücre interfaz de elektrik empedans, malign hücrelerin bir nüfus olarak bir HUVEC tek tabaka (Şekil 1) ile işgal. Endotel kavşak bozulması, tümör hücreleri tarafından endotel tek tabaka ve yedek geri çekilmesi empedans büyük değişikliklere yol. Bu değişiklikler doğrudan tümör hücrelerinin invaziv kapasitesi ile ilişkili, yani, son derece agresif hücreleri tarafından işgali hücre empedansı ve tersi büyük değişikliklere yol. Endotel hücre-tümör hücresi etkileşim daha yakından taklit eden in vivo sürecinde, ve 2), veri gerçek elde edilir: 1) Bu teknik, Boyden odasının ve Matrigel tahlilleri gibi istila ölçme mevcut yöntemleri, üzerinde bir iki kat avantaj sağlar zaman ve diğer yöntemler için son nokta analizi aksine, daha kolay ölçülebilir.

Bu makalede, bir açıklar<em&gt; In vitro</emEndotel hücrelerinin bir tek tabaka ile istila izleme kanser hücreleri&gt; tekniği. Bu veriler de alt elektrotların yüzeyini empedansın değişikliklerin bir fonksiyonu olarak gerçek zamanlı olarak elde edilir.

Kanser Hücreleri Endotel Hücre Tek tabakalı Invasion Tedbir Gerçek zamanlı Elektrik Empedans Tabanlı Tekniği

Kötü huylu hücrelerin metastatik yayılımı; bazal membranın yıkımını, tümör hücrelerinin vasküler endotelyuma tutunmasını, ... geri çekilmesini gerektirir.

Bu video, gerçek zamanlı elektriksel empedans tabanlı bir teknik kullanarak kanser hücrelerinin endotelyal hücre monokatmanına invazyonunu izleme yöntemini göstermektedir. İlk olarak, VE olarak adlandırılan insan göbek veni endotelyal hücreleri, kuyucuk tabanında altın elektrotlarla kaplanmış 16 kuyucuklu EPL'lere yerleştirilir. Konfluent bir monokatman oluşturmak için kanser hücreleri eklenir; bu hücreler VE'lere tutunur ve endotelyal hücre bağlantılarını bozarak HVAC monokatmanına invaze olur. Ardından, kuyucuk tabanının hücrelerle kaplanan toplam alanına bağlı olan empedans okumaları alınır.İnvazyonun boyutu, elektriksel empedanstaki değişikliklere dayanarak belirlenebilir. Bu tekniğin boşluk odası (void chamber) ve METROGEL assayleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, endotel hücre ile tümör hücresi etkileşimlerinin in vivo metastatik süreci daha yakından taklit etmesi ve verilerin, diğer yöntemlerdeki son nokta analizinin aksine gerçek zamanlı olarak elde edilip daha kolay nicelendirilebilmesidir. Bu yöntem, kanser hücresi invazyonu hakkında bilgi sağlayabilir.Bu yöntem, bağışıklık sistemindeki hücre-hücre etkileşimlerinin incelenmesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Ayrıca, UX hücrelerinin büyümesini gözlemlediğimiz deneyin başlangıç aşaması, başka herhangi bir invazyon adımına gerek kalmadan herhangi bir hücre hattının proliferasyonunu değerlendirmek için kullanılabilir; prosedür, laboratuvarımdaki lisansüstü öğrencisi Rahim tarafından gösterilecektir. Bu protokolün tüm adımları, doku kültürü davlumbazında steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir.Bu deneyde kullanılan Xcel sistemi, ilk kullanımında yalnızca bu cihaza ayrılmış olan 37 °C ve %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde sürekli olarak tutulur. Cihazın, yeni sıcaklık ve nem ortamına uyum sağlaması için inkübatörde en az 16 saat bekletilmesi gerekir. Ardından, Thence EPL 16'yı 37 °C'de bir saat boyunca %0,1 jelatin ile kaplayarak hazırlayın.Plaka kaplandıktan sonra, bir kez PBS ile yıkayın. Ardından, boş okuma yapmak için 100 µL yeniden konfigüre edilmiş e gm two medyum ekleyin. Bu işlem, hücrelerin yokluğunda arka plan empedansını ölçmek içindir.EPL'yi bilgisayardaki Excel agent sistemine yerleştirin. Yazılım penceresindeki masaüstünde bulunan RTCA yazılım simgesine tıklayarak Excel agent yazılımını açın. Düzen sekmesine tıklayın ve numuneleri içeren kuyucukları seçin.Gerçek zamanlı veri toplama sıklığını programlamak için program sekmesine tıklayın, ardından adım ekle simgesine tıklayın; "sweeps" okuma sayısını, "intervals" ise okumalar arasındaki zaman aralığını belirtir. Bunlar otomatik olarak sırasıyla bir ve 1.00 dakika olarak ayarlanmıştır.Bu işlem, sistemin bir arka plan okuması gerçekleştirmesini sağlar. Bir adım ekle (add a step) seçeneğine tıklayın; tarama (sweeps) kutusuna 300, aralıklar (intervals) kutusuna ise 10 minutes girin. Bu işlem, cihazı 50 saate kadar empedans ölçümleri gerçekleştirmek üzere programlayacaktır.Deneye başlamak için bir adımı başlat simgesine tıklayın. Arka plan ölçümü gerçekleştirildikten sonra her bir kuyucuğun arka plan empedansı ölçülecektir. Pencere mesajı görüntüler.Bir sonraki adım için lütfen tıklayın. Başlamak için sonraki adıma geçin. Bu aşamada, hücreler eklenebilir ve monokatman oluşumu tarif edildiği gibi izlenebilir.Bir sonraki bölümde, burada kullanılan insan göbek veni endotel hücreleri veya HUVEC'ler, büyüme faktörü takviyelerini içeren EGM-2 bullet kit ile yeniden oluşturulmuş EGM-2 besiyeri ve %5 FBS ile kültüre edilmiştir; hücreler 37 °C'lik bir inkübatörde, %5 karbondioksit varlığında tutulmalıdır. Deney gününde, HUVEC'lerin konfluensini mikroskop altında kontrol edin; hücreler düşük pasaj numarasına sahip olmalı, tercihen altıdan fazla olmamalı ve tek katmanlı bir yapı oluşturmak için %75'ten daha az konfluent olmalıdır; hücreleri tripsin ile hasat edin. Hücreler flasktan ayrıldıktan sonra, tüm tripsin kalıntıları 200 ×g'de santrifüjle uzaklaştırılmalıdır. Santrifüj işleminin ardından hücreleri bir kez PBS ile yıkayın.Ardından hücreleri ve yeniden oluşturulmuş EGM-2 medyumunu, mililitrede 2,5 x 10⁵ hücre konsantrasyonuna gelecek şekilde tekrar süspande edin. Hücreler süspande edildikten sonra, EXOGEN sisteminden kalibre edilmiş arka plan EPL'yi çıkarın ve plaktaki mevcut 100 µL EGM-2 medyumuna 100 µL HX süspansiyonu ekleyin. EPL'yi derhal Excel sistem hücre analizörüne yerleştirin.Yazılım penceresindeki başlatma adımına tıklayarak empedans okumalarını almaya başlayın. Endotel hücrelerinin büyümesine izin verin. Sistem, her 10 dakikada bir empedans okumaları almaya devam edecektir.Uve hücreleri, ekimden dört ila altı saat sonra hücre indeksinde karakteristik bir geçici düzleşme gösterir ve ardından 16 ila 18 saat sonra bir başka stabilizasyon gerçekleşir. Bu nedenle, hücrelerin en az 18 saat boyunca konfluen bir monotabaka oluşturmasına izin vermek önemlidir. Monotabaka oluştuktan sonra, invazyon deneyi hazırlığı için invaze eden hücrelerin eklenme zamanı gelmiş demektir.İstila eden tümör hücrelerini hazırlayın. Burada osteosarkom hücreleri kullanılmıştır. Hücreleri tripsin ile toplayarak başlayın.Hücreleri 200 G'de santrifüj ederek ve bir kez PPS ile yıkayarak tüm tripsin kalıntılarını giderin. Yıkama işleminin ardından, tümör hücrelerini büyütmek için kullanılan %10 FBS içeren RPMI veya DMEA ortamı gibi bir besiyerinde, hücreleri mililitre başına 1x10⁵ hücre nihai yoğunlukta süspansiyona getirin. Yazılım penceresindeki duraklatma adım simgesine tıklayarak deneyi duraklatın.EPL'yi kaldırın ve vak monolayer'dan EGM two medyumunu aspire edin. 1x10⁴ hücre içeren 100 µL tümör hücresi süspansiyonu ekleyin. Genellikle, bu analiz için tümör hücrelerinin endotel hücrelerine 1:2,5 oranında eklenmesi en iyi sonucu verir.Bununla birlikte, oran bireysel hücre hatları için optimize edilebilir. EPL'yi inkübatördeki Excel ajan sistemine geri yerleştirin. 10 dakikalık aralıklarla empedans ölçümleri almaya devam etmek için devam adımına tıklayın.Sızmayı sonraki 6 ila 12 saat boyunca gerçek zamanlı olarak izleyin. Endotel bağlantılarının geri çekilmesi ve istilacı tümör hücrelerinin penetrasyonu sonucunda hücre indeksinde bir düşüş meydana gelecektir. Deney sona erdiğinde, sonuçları istilacı tümör hücrelerinin eklendiği zamana göre normalize etmek için exergen yazılımını kullanın.Exergen yazılımı, bu videoda gösterildiği gibi, VEX'lerin exergen sisteminde kültüre edildiği herhangi bir zaman noktasına göre normalizasyon yapılmasına izin verir ve monolayer oluşumunu takiben ya K seven M two hücreleri ya da K 12 hücreleri eklenmiştir. Burada gösterildiği üzere, K seven M two hücrelerinin eklenmesinden sonraki birkaç saat içinde hücre indeksinde keskin bir düşüş meydana gelir. K seven M two, yüksek derecede metastatik bir osteosarkom hücre hattıdır.Bu hücreler, hücre hattının istilacı özelliklerini açıklayan sitoskeletal bağlantı proteini ene'yi yüksek seviyelerde eksprese ederler. Öte yandan K 12 hücreleri, daha az metastatikle çalışırlar ve endotelyal tek tabakayı K seven M two hücreleri kadar verimli bir şekilde geçemezler. Bu durum, burada gösterildiği gibi hücre indeksindeki daha az belirgin bir düşüşle temsil edilmektedir.Burada gösterilen kontrol, uve tek tabakasının empedansını temsil etmektedir. Kanser hücrelerinin yokluğunda, deneyler üç tekrarlı olarak gerçekleştirilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, bir endotel hücre tek tabakası oluşturarak ve bu tek tabakayı kanser hücreleriyle zorlayarak invazyonun gerçek zamanlı olarak nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.HU XL monotabaka oluşumunu içeren deneyin başlangıç adımları, hücre proliferasyonunu empedans yoluyla değerlendirmek için kullanılabilir.İki.

a-real-time-electrical-impedance-based-technique-to-measure-invasion

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu videoda, elektrik empedansına dayalı üç odacıklı bir dizi kullanan bir istila testi açıklanmaktadır. Bu teknik, tümör mikro ortamlarında yerleşik stromal hücreler tarafından salgılanan çözünür faktörlerin etkisi altında kanser hücrelerinin istilacı potansiyelini ölçer.

Üç odacıklı dizi tabanlı empedans testi: elektrik empedansını ölçerek kanser hücrelerinin invaziv potansiyelini değerlendirmek için gerçek zamanlı bir analiz tekniği

Kaynak: Mudduluru, G., et. al. Kanser Hücresi Göçü ve İstilasının Empedans Tabanlı Gerçek Zamanlı Ölçümü. J. Vis. Uzm. (2020)Bu video, glioblastoma hücre istilasını ve göçünü ölçmek için empedans tabanlı bir testi göstermektedir. Hücreler hücre dışı matrisi bozar, mikro gözenekli zarlardan geçer ve elektrotlara yapışarak empedans oluşturur. Bu gerçek zamanlı analiz, kanser araştırma uygulamaları için istilacı potansiyellerini yansıtıyor.

Beyin Kanseri Hücre İstilasının Empedans Tabanlı Ölçümleri

Bu protokol Electric Cell-substrat Empedans Algılama, hücre eki, çoğalması, hareketliliği ve farmakolojik ve toksik uyaranlara hücresel yanıtların ölçümü için yapışık hücrelerin empedans spektrumu kaydetmek ve analiz etmek için bir yöntemi incelemektedir. Endotelial geçirgenliğin ve hücre-hücre ve hücre-yüzey kontaktların değerlendirilmesi tespiti vurgulanmıştır.

Elektrik Hücre-substrat Empedans endotel Yayılmasının, Bariyer Fonksiyonu Nicelik için Algılama ve Motilite

Kanser, farklı organlara metastaz yeteneği nedeniyle ölümcül bir hastalıktır. Kanser hücrelerinin çeşitli tedavi koşulları altında göç ve işgal yeteneğini belirlemek terapötik stratejilerin değerlendirilmesi için çok önemlidir. Bu protokol glioblastoma kanser hücre hattının gerçek zamanlı metastatik yeteneklerini değerlendirmek için bir yöntem sunar.

Empedans tabanlı Gerçek Zamanlı Kanser Hücre Göçü ve İstilası Ölçümü

İnvaziv hücre alt popülasyonlarını gerçek zamanlı olarak tespit etmek ve yakalamak için bir yaklaşım açıklıyoruz. Deneysel tasarım, hücrelerin elektrik empedansındaki değişiklikleri izleyerek Gerçek Zamanlı Hücresel Analiz kullanır. Kompleks dokulardaki invaziv kanser, immün, endotel veya stromal hücreler yakalanabilir ve ko-kültürlerin etkisi değerlendirilebilir.

Ko-kültürlerden İnvaziv Hücre Alt Popülasyonlarının Gerçek Zamanlı Tespiti ve Yakalanması

Birçok yukarı regüle edilmiş gen, tümör hücresi göçünü ve invazyonunu uyararak kötü prognoza yol açar. Hangi genlerin tümör hücresi göçünü ve invazyonunu düzenlediğini belirlemek çok önemlidir. Bu protokol, bir genin artan ekspresyonunun tümör hücrelerinin göçü ve invazyonu üzerindeki etkilerini gerçek zamanlı olarak araştırmak için bir yöntem sunar.

Sentetik mRNA Transfeksiyonunu Takiben Tümör Hücresi Migrasyonu ve İnvazyonunun Gerçek Zamanlı Kantitatif Ölçümü

Burada empedans tabanlı biyosensörleri kullanma tekniğini gösteriyoruz: beyin endotel bariyer gücünü ölçmek için ECIS ve cellZscope. Beyin endotelinin in vitro modeline çeşitli uyaranlar eklemenin hazırlanmasını ve tekniğini detaylandırıyoruz. Bulguları ölçüyor, kaydediyor ve temsili bir analiz yapıyoruz.

Kanser Hücreleri ve Sitokinlere Yanıt Olarak İki Empedans Tabanlı Biyosensör ile Beyin Endotel Bariyer Bütünlüğündeki Değişikliklerin Ölçülmesi

Biz bir kuş embriyo modeli dinamik, gerçek zamanlı intravital görüntüleme kullanarak insan xenografted tümörlerin vasküler nanoparçacık yerelleştirme ölçmek için yeni bir yaklaşım sunuyoruz.

Intravital Görüntüleme Gerçek Zamanlı tümörler Nanopartikül Alımı Değerlendirme

Etiketli hücreleri çok foton mikroskobu ile dil içinde ağız kanseri ve tümör invazyonu niceliksel olarak izlenmesi bir fare modeli üreten yer alan tekniklerin kapsamlı bir bakış sunulmaktadır. Bu sistem, anti-invaziv bileşiklerin moleküler değerlendirme ve ilaç etkinliği için faydalı bir platform olarak hizmet verebilir.

Oral Skuamöz Hücre Karsinomu Ortotopik Fare Modeli Tümör Hücre Invasion Multi-foton Görüntüleme

Kantitatif büyüme faktörü (TGF)-β indüklenen 3 boyutlu kolajen jel işgali dönüştürme ölçmek için bir test tarif edilir. Bu testte, meme kanseri gelişiminin farklı aşamaları temsil hücre hatlarının MCF10A serisi, yararlanır. Bu yöntem, diğer hücre hatları ile birlikte kullanılmak üzere ve diğer potansiyel aktivatörleri veya işgali inhibitörleri araştırmak için kullanılmış olabilir kabul edilebilir.

TGF-β-kaynaklı Invasion Tedbir Sfero Testi

Öğrenin, kanser hücrelerinin endotel hücre tek tabakasına invazyonunu gerçek zamanlı elektrik empedans tekniğiyle izleme yöntemini. HUVEC kullanılarak metastatik süreçler canlandırılır ve invazyon dinamikleri nicel olarak değerlendirilir.

Kanser Hücreleri Endotel Hücre Tek tabakalı Invasion Tedbir Gerçek zamanlı Elektrik Empedans Tabanlı Tekniği

Daha fazla video keşfet