Glikojen dallanma derecesini ölçmek için glikojen dallanma deneyi

Glikojen gibi dallı polisakkaritler, alfa-1,4-glikozidik bağlar yoluyla doğrusal olarak ve dallarda alfa-1,6-glikozidik bağlar yoluyla bağlanan glikoz kalıntılarını içerir.

Polisakkaritlerde dallanma derecesini belirlemek için, potasyum iyodür, iyot ve kalsiyum klorür içeren sulu bir renk reaktifi ile başlayın. Sulu koşullar altında, potasyum iyodür ve iyot iyodür iyonları verir.

Ayrı mikrosantrifüj tüplerinde, reaktifi bilinen dal yapılarına sahip polisakkaritler ve karakterize edilmemiş bir yapıya sahip bir glikojen numunesi ile karıştırın.

Polisakkaritler, alfa-1,4-glikozidik bağları aracılığıyla sarmal yapıları benimser. İyodür iyonları bu sarmal çekirdeğe bağlanarak doğrusal poliiyodür zincirleri oluşturur. Bu, polisakkaritler ve poliiyodür zincirleri arasında yük transfer kompleksi oluşumu ile sonuçlanır ve renkli polisakkarit-iyodür kompleksleri ile sonuçlanır.

Daha uzun poliiyodür zincirlerine sahip dallanmamış polisakkaritler mavi bir renk geliştirirken, daha kısa poliiyodür zincirlerine sahip dallı polisakkaritler sarımsı ila turuncu-kahverengi kompleksler geliştirir. Reaktifteki kalsiyum klorür karmaşık rengi yoğunlaştırır.

Karışımı tek kullanımlık küvetlere aktarın. Bir spektrofotometre kullanarak, absorbans spektrumunu 330 ila 800 nanometre arasında ölçün.

Mavi renkli dallanmamış kompleksler, daha uzun dalga boylarında ışığı emer ve absorbans maksimumunda sağa doğru bir kayma gösterir. Buna karşılık, dallanmış kompleksler ışığı daha kısa dalga boylarında emer ve absorbans maksimumundaki sola doğru kayma, yapıda daha yüksek dallanmayı gösterir.

Karakterize edilmemiş glikojen numunesinin yaklaşık 450 nanometredeki absorbans maksimumları, dallı yapısını doğrular.

Glikojen dallanmasını belirlemek için, 650 mikrolitre iyot / kalsiyum klorür renk reaktif stoğunu 1,5 mililitrelik bir tüpte 100 mikrolitre su ile birleştirin ve tek kullanımlık bir metakrilat küvete aktarmadan önce çözeltiyi iyice karıştırın. Arka plan spektrumunu 330 ila 800 nanometre arasında toplamak için dalga boyu tarama modunda bir çalışma yapmak için küveti spektrofotometreye yerleştirin.

Ayrı bir 1.5 mililitrelik tüpte, 650 mikrolitre çalışma iyot / kalsiyum klorür renk reaktifini 50 mikrogram istiridye glikojeni ile birleştirin ve son hacmi su ile 750 mikrolitreye kadar tamamlayın. Karışımı iyice karıştırdıktan sonra, 330 ila 800 nanometre arasında bir absorpsiyon spektrumu toplamak için çözeltiyi tek kullanımlık bir metakrilat küvete aktarın.

Benzer şekilde, daha önce tarif edildiği gibi 50 mikrogram amilopektin ve 30 mikrogram amiloz içeren bir absorpsiyon spektrumu elde edin.

Karakterize edilmemiş bir glikojen numunesinin dallı yapısının bir göstergesini elde etmek için, 25 ila 50 mikrogram glikojeni 650 mikrolitre çalışan iyot / kalsiyum klorür renk reaktifi ile birleştirin ve absorpsiyon spektrumunu elde etmek için daha önce açıklandığı gibi devam edin.