DNA metilasyonunun derecesini belirlemek için 5-metilsitozin nokta lekesi

DNA metilasyonu, 5-metilsitozin oluşturmak için DNA'nın sitozin bazına bir metil grubunun eklenmesini içeren epigenetik bir modifikasyondur. Bu modifikasyon gen ekspresyonunu değiştirir.

Nokta lekesi yoluyla DNA metilasyonunu ölçmek için, farklı metillenmiş sitozin seviyeleri sergileyen çeşitli farklılaşma aşamalarında insan kondrositlerinden türetilen genomik DNA örneklerini alın.

DNA örneklerini güçlü bir alkali olan sodyum hidroksit ile işlemden geçirin ve ısıtın. Bu işlem, iki DNA zinciri arasındaki hidrojen bağlarını kopararak DNA denatürasyonuna neden olur. Alkaliyi nötralize etmek için amonyum asetat ekleyin ve aşırı DNA bozulmasını önleyin.

Naylon bir zar alın ve denatüre DNA örneklerini noktalar halinde tespit edin. Negatif yüklü DNA, elektrostatik etkileşimler yoluyla pozitif yüklü naylon zara bağlanır ve katı destek üzerinde lekelenmesine neden olur.

Spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için lekeli membrana bir bloke edici tampon uygulayın. Daha sonra, zara anti-5-metilsitozin antikorları ekleyin ve inkübe edin. Bu antikorlar sadece DNA üzerindeki metillenmiş sitozine bağlanır.

Bağlanmamış antikorları çıkarmak için yıkayın ve birincil antikorlara spesifik olarak bağlanan kemilüminesan enzim konjuge ikincil antikorları ekleyin.

Membran üzerine kemilüminesan bir substrat ekleyin. Antikor üzerindeki enzim, kemilüminesans üretmek için substrat ile reaksiyona girer - çeşitli yoğunluklarda noktalar verir.

Membranı görüntüleyin ve her numunedeki DNA metilasyonunun derecesine karşılık gelen noktaların yoğunluklarını ölçün.

İzole edilen DNA'yı 0.1 molar sodyum hidroksit içinde 95 santigrat derecede 10 dakika boyunca denatüre ederek bu işleme başlayın. DNA'yı buz üzerinde 1 molar amonyum asetat ile nötralize edin ve ardından çift damıtılmış su ile iki kat seyreltin.

Nokta lekesindeki en kritik adım, numunelerin zar üzerine lekelenmesidir, bunu yavaş ve dikkatli bir şekilde yapın. Her benekli alanı 3 ila 4 milimetre çapında küçültmeye çalışın.

Dar ağızlı bir pipet ucu kullanarak, 2 mikrolitre seri seyreltilmiş genomik DNA'yı ızgaranın ortasındaki pozitif yüklü bir naylon zar üzerine dikkatlice yerleştirin. Membranı 80 santigrat derecede 30 dakika kurulayın. Daha sonra, zarı TBST'de% 5 BSA'ya batırarak 10 santimetrelik bir Petri kabında oda sıcaklığında 1 saat boyunca hafifçe çalkalayarak spesifik olmayan antikor bağlanma bölgelerini bloke edin.

1 saat sonra, zarı her seferinde 5 dakika boyunca TBST'de üç kez yıkayın. Membranı, gece boyunca 4 santigrat derecede TBST'de bir fare anti-5-metilsitozin monoklonal antikoru ile inkübe edin. Ertesi gün, zarı her seferinde 5 dakika boyunca TBST'de üç kez yıkayın.

Daha sonra, ikincil bir antikor - yaban turpu peroksidaz konjuge koyun anti-fare immünoglobulin G ile TBST'de oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Membranı daha önce olduğu gibi TBST'de yıkadıktan sonra, enzim substratını membrana ekleyin ve 5 ila 10 dakika inkübe edin. Son olarak, üreticinin talimatlarına göre bir kemilüminesans kiti kullanarak ikincil antikor sinyalini görselleştirin.