Dorsal Kök Ganglion Eksplant ve Disizosiyasyon Hücre Kültürü Oluşturulması

Serum içermeyen bir ortamda dorsal kök ganglionu veya DRG dokuları ile başlayın. DRG dokusu, hücre dışı matris ECM'ye gömülü duyusal nöronlar ve uydu glial hücreleri içerir.

Doku yapışmasını arttırmak için jelatinimsi bir protein karışımı ile kaplanmış bir kültür kabına tohumlayın.

Zamanla, glial hücreler, nöronal uzantılara izin veren nörotrofik büyüme faktörlerini serbest bırakır ve bir DRG eksplant kültürü oluşturur.

Ayrışmış bir hücre kültürü geliştirmek için, bu DRG eksplantlarını bir tüpe alın. ECM'yi bozmak için onlara kollajenaz ve ardından hücre bağlantılarını bozan, nöronları ve glial hücreleri serbest bırakan tripsin uygulayın.

Enzimatik reaksiyonu durdurmak için serumla zenginleştirilmiş bir ortam ekleyin.

Tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için içeriği tekrar tekrar pipetleyin ve kalıntıları gidermek için filtreleyin.

Bu hücre süspansiyonunu santrifüjleyin ve enzim içeren süpernatanı çıkarın.

Hücreleri nörobazal bir ortamda yeniden süspanse edin ve bunları laminin kaplı bir plakaya aktarın.

Uydu glial hücreler ve duyusal nöronlar, laminin kaplı plakaya yapışarak ayrışmış bir hücre kültürü oluşturur.

Her DRG'yi kuru, cam bir Petri kabına aktarın. Cerrahi mikroskop altında, bir bıçak kullanarak DRG'ye hala bağlı olan fazla lifleri ve bağ dokusunu temizleyin ve kesin. DRG, beyaz omurilik siniri boyunca şişkin, şeffaf bir yapı olarak kolayca tanımlanabilir ve genellikle DRG'yi çevreleyen kan damarları bulunur.

Bundan sonra, temizlenmiş olanı buz gibi, serumsuz ortam içeren yeni bir Petri kabına DRG'ye yerleştirin. Jelatinli protein karışımını buz gibi, serumsuz ortamda 1'e 1 oranında seyreltin. Daha sonra, DRG ex vivo'yu 10 veya 20 mikrolitre jelatinimsi protein karışımı ile önceden kaplanmış 12 oyuklu plakalara yerleştirin ve 30 ila 60 dakika boyunca 37 santigrat derecede tutun.

Şimdi, tüm eksplantları kaplamak ve eksplantları kültür koşullarında tutmak için kültür sistemine nazikçe 1,5 ila 2 mililitre serumsuz ortam ekleyin. DRG büyüme ortamını her 72 saatte bir değiştirin. ve DRG'nin gerektiği kadar büyümesine izin verin.

DRG, jelatinimsi protein karışımı kullanılarak cam plakaya sabitlendiği için bu kritik bir adımdır. Bu nedenle, polimerizasyon süresi ve pipetleme becerileri, yüzmeyi önlemek için kritik öneme sahiptir.

Bu prosedürde, toplanan tüm DRG'yi kollajenaz IV içeren F12 ortamı ile 1.5 mililitrelik steril bir tüpe yerleştirin ve 37 santigrat derecede 45 dakika inkübe edin. Daha sonra, kollajenaz IV içeren taze ortamı değiştirin ve numuneyi 45 dakika daha inkübe edin. Daha sonra, eksplantları 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede% 0.025 tripsin içeren% 2 mililitre F12 ortamı ile muamele edin.

Kollajenaz IV tedavisinden hemen sonra, 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede fetal sığır serumu içeren 2 mililitre F12 ortamı ile inkübe edin. Daha sonra, eksplantları 2 mililitre F12 ortamı ile üç kez yıkayın ve ortam bulanıklaşana kadar bir cam pipetle mekanik olarak ayırmaya devam edin.

Bunu takiben, herhangi bir safsızlığı ve fazla bağ dokusunu gidermek için ayrışmış hücre kültürünü 0.22 mikrometrelik bir filtreden süzün. Ardından, filtrelenmiş hücre lizatını iki dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 500 mikrolitre nöro-bazal ortamda yeniden süspanse edin. Ayrışmış hücreleri, tercih edilen hücre yoğunluğunda laminin kaplı örtü kızaklarına yerleştirin.