Primer Embriyonik Fare Orta Beyin Dopamin Nöronlarının İzolasyonu ve Kültürü

Fare embriyolarının orta beyninin ventral bölgesinden izole edilen orta beyin taban dokusunu alın.

Doku, nörotransmitter dopamini serbest bırakan dopamin nöronları geliştirme açısından zengindir.

Doku matrisini parçalamak için bir enzim çözeltisi ekleyin, böylece hücreleri gevşetin.

DNaz I içeren bir serum çözeltisi ekleyin ve bir hücre süspansiyonu oluşturmak için sindirilmiş dokuyu mekanik olarak ayırın. Serum proteinleri enzimleri inhibe ederken, DNaz I, hücre lizizi sırasında salınan hücre dışı DNA'yı parçalayarak hücre topaklanmasını önler.

Doku kalıntılarının çökmesine izin verin ve askıya alınan hücreleri yeni bir tüpe aktarın.

Süpernatanı santrifüjleyin ve çıkarın, ardından hücreleri bir dopamin nöron ortamında veya DPM'de yeniden süspanse edin.

Kuyucukların merkezinde bir hücre kültürü substratı ile kaplanmış bir mikroplaka alın ve mikro adalar oluşturun.

Hücreleri yüksek yoğunlukta kültürlemek için mikro adaların ortasına aktarın.

Hücrelerin mikro adalara yapışmasına izin vererek inkübe edin.

Kuyuları DPM ile doldurun ve inkübe edin, dopamin nöronlarının büyümesini kolaylaştırın.

Fare embriyonik gün 13.5 fare embriyolarından birincil embriyonik orta beyin kültürleri kurmak için, hasat edilen tüm orta beyin tabanlarını aynı 1.5 mililitrelik tüpe toplayın ve örnekleri 500 mikrolitre kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, HBSS'yi 37 santigrat derecede 30 dakikalık bir inkübasyon için% 0.5 tripsin ile değiştirin.

İnkübasyonun sonunda, kısmen sindirilmiş dokuya FBS çözeltisinde 500 mikrolitre taze hazırlanmış DNase I ekleyin ve dokuyu ezmek için ateşle parlatılmış bir uca sahip silikonlu bir cam pipet kullanın. Sadece küçük, zar zor görülebilen parçacıklar gözlemlenebildiğinde, bu doku parçalarının mikrosantrifüj tüpünün dibine yerleşmesine izin verin ve süpernatanı boş bir 15 mililitrelik konik polipropilen tüpe aktarın.

FBS'de DNase I içeren tüpe bir mililitre HBSS ekleyin ve pipetleme ile birkaç kez karıştırın. Bu çözeltinin bir mililitresini kalan doku parçacıklarına aktarın ve numuneleri tekrar ezin. Daha sonra, sindirilmiş hücre süspansiyonunu, kalan doku parçalarını aktarmadan süpernatan tüpü ile birleştirin. Doku örneğini HBS'de FBS'de kalan DNaz I ile bir kez daha tritüre ettikten sonra, toplanan hücreleri santrifüjleme ile çökeltin ve peleti bozmadan süpernatanı aspire edin.

Hücreleri, yıkama başına iki mililitre ısıtılmış dopamin nöron ortamında iki kez yıkayın ve hücreleri, bir mikrosantrifüj tüpünde altı mikrolitre taze, sıcak orta konsantrasyonda 3 x 10⁴ hücrede yeniden süspanse edin. Daha sonra, ortamı önceden hazırlanmış her bir mikro adadan çıkarın ve her bir mikro adaya altı mikrolitre hücre eklemek için 10 mikrolitrelik bir pipet kullanmadan önce hücreleri yumuşak pipetleme ile karıştırın.

Tüm hücreler eklendiğinde, plakanın kenarlarındaki boş kuyuları 150 mikrolitre su veya PBS ile doldurun ve plakayı bir saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Kuluçka işleminin sonunda, her oyuğa 100 mikrolitre taze dopamin nöron ortamı ekleyin ve plakayı inkübatöre geri koyun.