Seçimi Plasmodium falciparum İnsan Beyninin endotel hücreleri Cytoadhesion için Parazitler

Bu prosedürün genel amacı, insan beyni endotel hücrelerine bağlanmak için plazmodyum, fpar ve parazitleri seçmektir. Bu, ilk olarak, enfekte olmuş ve enfekte olmamış kırmızı kan hücrelerinin bir insan beyni endotel hücreleri tabakası ile bir karışımını içeren bir plazmodyum, fpar ve parazit kültürünün inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir, bir sonraki adım, enfekte olmamış ve bağlanmamış kırmızı kan hücrelerinin birkaç kez yıkanarak yıkanmasıdır. Daha sonra parazit popülasyonunun daha fazla büyümesine izin vermek için orta, taze kırmızı kan hücreleri eklenir.

Birkaç hafta sonraki son adım, yeterli bir paragrafa ulaşılır ulaşılmaz genel seçimi tekrarlamaktır. Sonuç olarak, mikroskopi, HBE beş i'ye bağlı yüksek miktarda paraziti göstermek için kullanılır. Bu yöntem, sito dayanıklılık sürecinde yer alan parazit ligandlarının veya konak reseptör moleküllerinin tanımlanması gibi serebral sıtma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bir lökosit tükenme filtresinden geçerek kırmızı kan hücrelerini beyaz kan hücrelerinden ayırarak O grubu pozitif tam kandan insan kırmızı kan hücrelerini hazırlayın. Hücreleri 10 dakika boyunca 1000 G'de santrifüjleyin ve Reese peleti tüm PMI ile harcar. Eksik, orta.

Bu yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın, ardından peleti yeniden askıya alın. PMI %50 hematokrit eksik ortamımızda, kırmızı kan hücreleri bir hafta boyunca dört santigrat derecede saklanır. Kültür: Odium Valspar ile enfekte olmuş kırmızı kan hücreleri.

RPMI ile ortamı %2 hematokritte tamamlayın ve her gün %3 karbondioksit, %1 oksijen ve %96 nitrojen ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Parazitlerin gelişim aşamasını değerlendirmek için bir mücevher lekesi yapın. Kültürü beş dakika boyunca 500 G'de döndürerek ortamı günlük olarak değiştirin.

Süpernatanı aspire etmek ve haftada bir kez taze RPMI tam ortamı eklemek. Parazitleri sulu% 5 D sorbitol ile muamele ederek senkronize edin. Seçim testi, en az %5 ila %10 Parsit içeren bir halka aşama kültürü gözlendikten sonraki gün gerçekleştirilebilir.

Ayrıca. Beş göz hücresinin 60 milimetrelik çanağı başına 30 mikrolitrelik bir P hücre hacmi oluşturmak için yeterli parazit kültürüne ihtiyaç vardır. Tabağa santimetre kare başına iki mikrogram fibronektin ve steril salin ekleyerek insan beyni mikrovasküler endotel hücre hattını veya H geri fivei'yi almak için 60 milimetrelik bir doku kültürü kabı hazırlayın.

Çanağı 37 santigrat derecede beş ila 20 dakika inkübe edin, ardından fibronektin çözeltisini aspire edin. Daha sonra HBE beş I hücresini iyonizasyon ve santrifüjleme Reese ile 25 santimetre karelik bir doku şişesinden hasat edin, hücre peletini 10 mililitre DMEM, tam ortamda askıya alın. Daha sonra bu hücre süspansiyonundan 1.5 mililitre fibronektin ile muamele edilmiş doku kültürü kabına ekleyin ve kültür %50 ila 100 co akıcılığına ulaşana kadar iki ila üç gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin ve parazit kültürleri test gününde sito aian için hazır olur.

HBE beş I kültürü %50 ila %100 co akıcılıkta olmalıdır. Parazit kültürü, en az% beş ila% 10 para ve% 2 hematokrit ile pigmentli trofozoitler aşamasında olmalıdır. İlk olarak, kültür şişesinden 1.5 mililitre parazit kültürünü pipetleyin ve 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Kültürü 500 G'de beş dakika santrifüjleyin ve 10 mililitrede yeniden bükün. Taze yapılmış sıcak bir DMEM eksik, orta. Son santrifüjleme tamamlandıktan sonra bu yıkama adımını ikinci kez tekrarlayın.

Asberry DMEM eksik, orta ve 30 mikrolitre peleti 1.5 mililitre DMEM'de yeniden harcar. Eksik ortam, %1 BSA ile desteklenmiştir. Ardından, 60 milimetrelik hvac kabını alın. Beş.

Göz hücreleri kültür ortamını aspire eder ve üç mililitre DMEM ile iki kez yıkar. Eksik ortam. Parazitlerin çözeltisini, HPE beş göz hücresinin kabını ekleyin ve doku kültürü inkübatöründe toplam 75 dakika inkübe edin.

Kuluçka resüsü sırasında iki kez, inkübasyonu takiben tabağı hafifçe sallayarak ve döndürerek parazitleri askıya alın. Üç mililitre ılık DMEM eksik ortam eklemek için plastik bir makarna pipeti kullanarak ortamı aspire ederek ve ardından son yıkamadan sonra plakayı hafifçe sallayarak kabı beş kez yıkayın, kabı ters çevrilmiş bir mikroskop altında inceleyin. Enfekte olmamış birçok kırmızı kan hücresi hala görünüyorsa, bunları çıkarmak için yukarıda açıklandığı gibi yıkama prosedürünü tekrarlayın.

Ortamı çanaktan aspire ettikten sonra, Resus 40 mikrolitre paketlenmiş hücre hacminde taze kırmızı kan hücrelerini ısıtılmış RPMI tam ortamında askıya alın ve hücre süspansiyonunu yemeğe ekleyin. Çanağı hava görüşlü bir kuluçka odasına yerleştirin. Daha sonra tabağı üç dakika boyunca %3 karbondioksit, %1 oksijen ve %96 nitrojen ile gazlayın.

Ve odayı gece boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. Bu kuluçka sırasında, sahnedeki parazitler patlar ve kızlar kırmızı kan hücrelerini yeniden düzenler. Ertesi gün, halka aşaması parazitlerini yıkayarak hasat edin.

RPMI ile daha önce olduğu gibi eksik ortamda, ancak ortamın daha kuvvetli pipetlenmesi ve plakanın sallanması ile. Yeniden askıya alınmış kırmızı kan hücrelerini içerecek olan kullanılan tüm ortamları 15 mililitrelik konik bir tüpte saklayın. Tüm kırmızı kan hücrelerinin çanak santrifüjünden çıkarıldığından emin olmak için plakayı ters çevrilmiş bir mikroskop altında kontrol edin.

Parazitleri peletlemek için yıkanmış plakadan ortamı içeren tüp, beş mililitre süspanse eden süpernatan Resus'u atar. RPMI ortamı tamamlar ve karışımı kültür için 25 santimetre karelik bir şişeye yerleştirir. Parazitler, yeterli materyal elde edilene ve yeni bir seçim turu yapılana kadar iki ila dört hafta boyunca kültürlenir.

Seçilmemiş HB üç parazitleri, hbe beş göz hücrelerine düşük bir bağlanma seviyesi gösterir. Bu görüntü, enfekte olmamış kırmızı kan hücreleri ve bağlanmamış enfekte kırmızı kan hücreleri yıkandıktan sonra şeftalilerin 1000 kat büyütmede mikroskop altında görüntülendiği, %2 glutaraldehit ile sabitlenmiş ve giemsa ile boyanmış beş göz hücresini göstermektedir. Her seçim turundan sonra, giderek daha fazla parazit endotel hücrelerine bağlanır ve seçimler, beş tur seçimden sonra daha kısa zaman aralıklarında tekrarlanabilir.

Yüksek bağlayıcı parazit popülasyonları, burada gösterildiği gibi HB üç HBE paraziti ile elde edilir. Bu tablo, HE beşine bağlanmak için başarıyla seçilen plazmodyum alspar suşlarının bir özetini göstermektedir. Beş tur seçimden sonra TNF ile aktive edilen HE beş I'de HB üç'ün de seçildiğini not ediyorum.

DD iki suşu, seçilmemiş DD iki ile karşılaştırıldığında HBE beş I'e bağlanmada bir artış göstermedi. Bu 400 kat büyütme görüntüsü, seleksiyondan önce plazmodium alspar HB üç parazitinin HD MEK dermal endotel hücrelerine bağlanmasını göstermektedir. Burada, plazmodium alspar HB üç parazitinin aynı dermal endotel hücre hattına bağlanması, dört tur seçimden sonra gösterilmiştir.

Bu şekil, seleksiyondan önce plazmodium spar HB üç parazitinin HP ME pulmoner endotel hücrelerine bağlanmasını göstermektedir. Şimdi, plazmodyum spar HB üç parazitinin H HP ME hücrelerine bağlanması, dört tur seçimden sonra arttırılır. Her ne kadar hd e, C ve H HP EC için kültür ortamı biraz farklı olsa da, seçim için kullanılan protokol hbe beş ile aynıydı I. Bu prosedürü takiben, seçilmemiş ve seçilmiş parazitlerde varyant yüzey antijeninin transkripsiyonunu karakterize etmek gibi ek soruları yanıtlamak için R-T-P-C-R veya mikro analiz gibi yöntemler gerçekleştirilebilir.