Name: Seçimi Plasmodium falciparum İnsan Beyninin endotel hücreleri Cytoadhesion için Parazitler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Öğrenin Plasmodium falciparum parazitlerinin insan beyin endotelyal hücrelerine bağlanması için seçilme yöntemini. Bu model serebral malarya mekanizmalarını araştırmak ve tedavi hedefleri belirlemek için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Francisco Candal, CDC Teknoloji Transfer Ofisi, Atlanta Georgia HBEC-5i hücreler için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Wellcome Trust (AC ve JAR Temel Biyomedikal Bilim Kıdemli Bursu 4 yıl kişilik Doktora öğrenciliğine, hibe sayısı 084.226) tarafından finanse edildi.

Genel öneriler İnsan beyni mikrovasküler endotel hücre (HBEC-5i) kültür daha önce 8, 6 tarif edilmiştir. P. falciparum parazitler 9 kültüre edildi. HBEC-5i ve P. falciparum parazit kültürleri, her zaman steril koşullar tutulmalıdır . Bütün çözeltiler 37 ° C'de önceden ısıtılmış olmalıdır Biz mycoplasma kontaminasyon 10 PCR (Minevera Biolabs, aşağıdaki üreticinin talimatlarına) tarafından düzenli olarak kontrol etmenizi öneririz . Protokolü Şekil 1'de özetlenmiştir. 1. Endotel hücre rutin kültür <ol><li> Gerekli reaktifler hazırlayın. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Hazırlamak için Orta </td><td> Reaktifler </td><td> Miktar </td></tr><tr><td> "Eksik DMEM" </td><td> DMEM-F12 Ham </td><td> 500ml </td></tr><tr><td> &amp;nbsp; </td><td> L-glutamin 200mm </td><td> 5ml </td></tr><tr><td></td><td> 100X Penisilin / streptomisin </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td></td><td> NaOH 1M </td><td> 1.3 ml (pH 7.4 'e ayarlamak) </td></tr><tr><td> "Tam DMEM" </td><td> "Eksik DMEM" </td><td> 450ml </td></tr><tr><td></td><td> Fetal Bovine Serum ısı ile inaktive </td><td> 50ml </td></tr><tr><td></td><td> Endotelyal hücre büyüme ek </td><td> 5 ml </td></tr></tbody></table> <ol start="2"><li> Kültür HBEC% 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör 10ml DMEM tam orta Bacalı balonuna 25cm 2-5i. </li><li> Passage hücreleri konfluent haline. Emme eski orta çıkarın ve DMEM eksik orta veya doku kültürü sınıf PBS (Ca 2 + ve Mg 2 + free) 37 önceden ısıtılmış ° C iki kez kullanarak yıkayın </li><li> Önceden ısıtılmış deneyin 1ml eklebalonun tamamını kapsayacak ve 37 ~ 2 dakika boyunca inkübe psin-EDTA (% 0.025 tripsin, 0.5mm EDTA), girdap ° C </li><li> Inverted mikroskop altında hücrelerin en az% 90 müstakil olduğunu kontrol edin. Gerekirse, yapışık hücreleri çıkarmak için hafifçe balonun alt çalıyorum. 10ml 15ml konik bir tüp içine tripsin ve transfer hücreleri engellemek için DMEM tam orta ekleyin. 300 gr oda sıcaklığında (RT) 4 dakika santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı atın ve pelet DMEM tam orta 10ml ile tekrar süspansiyon haline getirin. Iyice hücreleri tekrar süspansiyon çözüm yukarı ve aşağı Pipet. </li><li> 1 veya 2 ml hücre süspansiyonu, yeni bir kültür balona ekleyin ve kültürünü korumak için taze orta 8 ml ekleyin. Ters bir mikroskop altında her geçen gün kültür gelişimi değerlendirmek ve sarıya döner her 2 ya da 3 gün önce ortamı değiştirmek. </li></ol> 2. Bir seçim için endotel hücreleri hazırlanması <ol><li> Selectio gün iki gün önce n, bir (veya daha fazla) 60 mm Petri kabı steril PBS (2 mg / cm 2) seyreltilmiş fibronektin ekleyin. 37 5 - 20 dakika için çanak inkübe ° C, daha sonra bir ay boyunca 4 ° C'de saklanır ve bir kez yeniden kullanılmış olabilir fibronektin çözüm kaldırmak. </li><li> Passage hücreleri gibi bölümleri 1.3 nitelendirdi. 1.5. Varsayarsak,% 100 konfluent hücreleri müstakil ve 10ml DMEM tam orta (bölüm 1.6. Confluency düşükse orta eşdeğer bir hacmi ile tekrar süspansiyon confluency% 80 ise, örneğin 8 ml ile tekrar süspansiyon) yeniden süspanse edildi, askıya 1.5ml eklemek fibronektin kaplı Petri kabı ve DMEM tam orta bir başka 1.5ml hücreleri. </li><li> Inkübatör numaralı seribaşı Petri kabı yerleştirin. Not: İdeal olarak confluency, iki gün sonra seçim zamanında yaklaşık% 90 olacaktır. </li><li> İsteğe bağlı. HBEC-5i etkinleştirmek için, seçime 50μg/ml 24 saat önce son bir konsantrasyonda TNF (Tümör Nekroz Faktörü) sitokin ekleyin. </li></ol>E_TITLE "&gt; 3 Plasmodium falciparum rutin kültür <ol><li> Gerekli reaktifler (Aşağıdaki tabloya bakınız) hazırlayın. İnsan kırmızı kan hücreleri (RBC), lökosit tükenmesi filtresi (genel sıtma parazitleri kültür için yayın 11 "Sıtma Araştırma Yöntemleri" bölümüne bakın) geçişi tam kan (grup O +) ayırarak hazırlayın . 400 g de 5 dakika süreyle santrifüj ve 10 ml RPMI eksik resuspending RBC iki kez yıkayın. 4 yıkanmış eritrosit tutun ° C,% 50 hematokrit eksik orta. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Hazırlamak için Orta </td><td> Reaktifler </td><td> Miktar </td></tr><tr><td> "Eksik RPMI" </td><td> RPMI 1640 (bikarbonat ile) </td><td> 500ml </td></tr><tr><td></td><td> HEPES 1M </td><td> 12.5ml </td></tr><tr><td></td><td> Glikoz 20% </td><td> 5ml </td></tr><tr><td></td> L-glutamin 200mm <td> 5ml </td></tr><tr><td></td><td> Gentamisin 50mg/ml </td><td> 250μl </td></tr><tr><td></td><td> NaOH 1M </td><td> 0.7 ml (7.2 pH ayarı) </td></tr><tr><td> "RPMI tamamlamak" </td><td> "Eksik RPMI" </td><td> 450ml </td></tr><tr><td></td><td> Insan (non-immün) serum Pooled </td><td> 50ml </td></tr></tbody></table> <ol start="2"><li> Kültür P. falciparum 37% 2 hematokrit ve inkübe RPMI tam orta ° C,% 3,% 1 O 2, CO 2 ve% 96 N 2 ile enfekte RBC Parazitler (Şekil 2) geliştirme aşamasında değerlendirmek için Giemsa smear 11 günlük olun. </li><li> Düzenli olarak 12 sorbitol tedavi kültür senkronize (yaklaşık haftada bir kez). Gün önce seçim testi% 5 parasitaemia veya daha fazla aşamalı bir halka kültür amacı (1, en azından ideal% 0). </li></ol> 4. P. Seçimi endotel hücreleri cytoadhesion için falciparum <ol><li> HBEC-5i kültür (ideal% 90)% 50 ila% 100 confluency olmalıdır testinin gününde, parazit kültür pigmentli trophozoite aşamada (Şekil 2) (ideal% 10 parasitaemia) olmalıdır . Parazit kültür 30μl hematokrit HBEC-5i Petri kabı başına ihtiyaç vardır. </li><li> Santrifüj (5 dakika için 500 gr.) 1.5ml parazit kültürü, parazitler tarafından iki kez yıkayın. Süpernatant ve taze yapılmış, ısıtılmış DMEM eksik orta 10ml ile tekrar süspansiyon atın. Yıkama, ikinci kez tekrarlayın. % 1 BSA ile eksik DMEM 1.5ml ile 30μl hematokrit tekrar </li><li> Iki kez aspire orta ve eksik DMEM 3ml ekleyerek HBEC-5i kaplamalı Petri kabı yıkayın. </li><li> 37 HBEC-5i çanağı ve inkübe parazitlerin çözüm ° C 75min için ekleyin. İnkübasyon sırasında (30 ve 60 dk sonra) iki kez parazitlerin yeniden süspansedört yönde, saat yönünde ve saat yönünün yanı sıra çanak hafifçe sallayarak. </li><li> Inkübasyondan sonra, 3 ml sıcak DMEM eksik orta ve yumuşak sallanan eklemek için bir plastik Pasteur pipeti kullanarak, orta aspire çanak 5 kez yıkayın. Birçok yemeğin kullanılıyorsa, bu, 37, su ile dolu büyük bir şişesi ° C, sıcak bir yüzey üzerinde tutmak </li><li> Çanak ters bir mikroskop altında kontrol edin. Birçok bulaşmamış RBC hala görünmüyorsa, yukarıda açıklandığı gibi daha yıkar. Herhangi bir bulaşma riskini önlemek için çok dikkatli bir şekilde Petri kabında tutun. </li><li> Yemeğin orta çıkarın ve taze uRBC 40μl hematokrit ile sıcak RPMI tam orta 3ml eklemek. </li><li> Hava geçirmeyen bir kuluçka odasında çanak, 3 dakika süreyle gaz yerleştirin ve 37 ° C gecede bir kuluçka odasının yerleştirin. </li><li> Gün sonra, benzer bir şekilde, bölüm 4.4 'de açıklandığı gibi RPMI eksik orta yıkama parazitlerin hasat. ama daha güçlü. Keep tüm orta konik tüp 15ml (yeniden süspanse RBC içeren). Inverted mikroskop altında tüm RBC çanak kaldırıldı olduğunu kontrol edin. </li><li> Pelet parazitler, 5ml RPMI tam orta yeri ve normal kültür için bir şişe karışımı tekrar süspansiyon süpernatant, atın. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Seçilmemiş parazitler HBEC-5i (Şekil 3A) bağlanarak düşük bir seviyede göstermektedir. Böylece, seçim ilk turda sonra, çok az sayıda parazitler hasat olacak ve ikinci turda seçim için yeterli bir parasitaemia ulaşmak için kültür bir ay kadar sürebilir. Her seçim turundan sonra, daha fazla parazitler endotel hücrelerine bağlanır ve seçimleri daha kısa zaman aralıklarında tekrar edilebilir. 4-5 tur seçim ardından, yüksek bağlayıcı parazit popülasyonları (Şekil 3) elde edilir. Bizim ellerde, HB3-HBEC HBEC-5i veya TNF aktif HBEC-5i bağlama, similar seviyesi (veriler gösterilmemiştir). 4 P. burada açıklanan protokol ile test edildi falciparum suşlarının: HB3, IT/FCR3, 3D7 ve DD2 (Tablo 1). Sadece son 5 tur seçim sonrasında bile HBEC-5i bağlamak mümkün değil kanıtladı. HB3 parazitler de İnsan Dermal ve Pulmoner mikrovasküler endotel hücreleri uygulamaları (HDMEC ve HPMEC) cytoadherence için seçildi. Burada anlatılan yöntemi kullanarak 4 tur seçim ardından, yüksek bağlayıcı nüfus HDMEC ve HPMEC (Şekil 4) hem de elde edildi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1, seçim sürecinde genel bakış . <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. P. Gelişim falciparum, kırmızı kan hücreleri enfekte . Giemsa smear 1000X büyütme mikroskop altında görüntülendi. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 HBEC-5i için bağlayıcı parazitler tipik bir örnektir . (A) mavi katmanı, Giemsa ile glutaraldehit ve boyanmış HBEC-5i sabit 1000X büyütmede mikroskop altında görüntülendi. URBC ve bağlanmamış iRBC yıkanıp sonra çekilen fotoğraflar. Sol panelinde tek bir P. gösterir falciparum HB3 (seçilmemiş) parazit HBEC-5i bağlı. Sağ panelde HB3 HBEC parazitler 5 tur için seçilen olmuştu. (B) Veriler, her biri, iki nüsha halinde yapılan iki bağımsız deneyler ortalama temsil eder. Endotel hücre başına bağlı parazit sayısı oldu. <img alt="Tablo 1" src="/files/ftp_upload/3122/3122table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tablo 1"> Tablo 1. Plasmodium falciparum suşlarının Özet HB3 TNF-aktif HB seçildi HBEC-5i. Bağlanarak başarıyla seçildiEC-5i. 5 tur seçim ardından, DD2 gerginlik seçilmemiş-DD2 göre HBEC-5i bağlayıcı herhangi bir artış gösterdi. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 P. bağlanması HDMEC ve HPMEC için kültür ortamı biraz farklılık olsa da önce ve seçim 4 tur sonra dermal (HDMEC) ve akciğer (HPMEC) endotel hücreleri, falciparum HB3 parazitler. (bkz. tedarikçinin talimatlarına), seçimi için kullanılan protokol olduğu gibi aynı oldu HBEC-5i. Resimler 400X büyütmede alınır. <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> DMEM-F12 Ham </td><td> Sigma </td><td> D6421 </td><td> DMEM tam orta </td></tr><tr><td> L-glutamin 200mm </td><td>Gibco </td><td> 25030 </td><td> DMEM ve RPMI tam orta </td></tr><tr><td> 100X Penisilin / streptomisin (10000 adet / ml ve 10mg/ml) </td><td> ScienCell </td><td> 0503 </td><td> DMEM tam orta </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum ısı ile inaktive </td><td> ScienCell </td><td> 0025 </td><td> DMEM tam orta </td></tr><tr><td> Tripsin-EDTA (% 0.025 tripsin, 0.5mm EDTA) </td><td> ScienCell </td><td> 0103 </td><td></td></tr><tr><td> Endotelyal hücre büyüme ek </td><td> ScienCell </td><td> 1052 </td><td> DMEM tam orta </td></tr><tr><td> Doku kültürü tedavi edilen 60 mm X 15 mm Petri kapları </td><td> BD </td><td> 353002 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan Fibronektin </td><td> Millipore </td><td> FC010 </td><td> 2 mg / cm 2 </td></tr><tr><td> TNF </td><td> Ar-GeD Systems </td><td> 210-TA </td><td> isteğe bağlı, 50 mg / ml </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-167F </td><td> RPMI tam orta </td></tr><tr><td> Gentamisin 50mg/ml </td><td> Lonza </td><td> 17-518Z </td><td> RPMI tam orta </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> Lonza </td><td> BE17-737E </td><td> RPMI tam orta </td></tr><tr><td> HDMEC </td><td> ScienCell </td><td> 2000 </td><td> Birincil hücre hattı </td></tr><tr><td> HPMEC </td><td> ScienCell </td><td> 3000 </td><td> Birincil hücre hattı </td></tr><tr><td> HBEC-5i </td><td></td><td></td><td> Francisco Candal (fcandal@cdc.gov) 'dan elde edilenler </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Malzeme

<ol><li>Scherf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+in+malaria%3A+in+situ+switching%2C+relaxed+and+mutually+exclusive+transcription+of+var+genes+during+intra-erythrocytic+development+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation in malaria: in situ switching, relaxed and mutually exclusive transcription of var genes during intra-erythrocytic development in Plasmodium falciparum.</a> Embo. J. 17, 5418-5426 (1998).</li>
<li>MacPherson, G. G., Warrell, M. J., White, N. J., Looareesuwan, S., Warrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebral+malaria.+A+quantitative+ultrastructural+analysis+of+parasitized+erythrocyte+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Human cerebral malaria. A quantitative ultrastructural analysis of parasitized erythrocyte sequestration.</a> Am. J. Pathol. 119, 385-401 (1985).</li>
<li>Seydel, K. B., Milner, D. A., Kamiza, S. B., Molyneux, M. E., Taylor, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+and+intensity+of+parasite+sequestration+in+comatose+Malawian+children%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">The distribution and intensity of parasite sequestration in comatose Malawian children.</a> J. Infect. Dis. 194, 208-208 (2006).</li>
<li>Taylor, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiating+the+pathologies+of+cerebral+malaria+by+postmortem+parasite+counts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Differentiating the pathologies of cerebral malaria by postmortem parasite counts.</a> Nat. Med. 10, 143-145 (2004).</li>
<li>van der Heyde, H. C., Nolan, J., Combes, V., Gramaglia, I., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unified+hypothesis+for+the+genesis+of+cerebral+malaria%3A+sequestration%2C+inflammation+and+hemostasis+leading+to+microcirculatory+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A unified hypothesis for the genesis of cerebral malaria: sequestration, inflammation and hemostasis leading to microcirculatory dysfunction.</a> Trends. Parasitol. 22, 503-508 (2006).</li>
<li>Dorovini-Zis, K., Prameya, R., Bowman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+characterization+of+microvascular+endothelial+cells+derived+from+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Culture and characterization of microvascular endothelial cells derived from human brain.</a> Lab. Invest. 64, 425-436 (1991).</li>
<li>Rowe, J. A., Claessens, A., Corrigan, R. A., Arman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+to+human+cells%3A+molecular+mechanisms+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+reviews+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Adhesion of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes to human cells: molecular mechanisms and therapeutic implications.</a> Expert reviews in molecular medicine. 11, e16-e16 (2009).</li>
<li>Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum%3A+involvement+of+additional+receptors+in+the+cytoadherence+of+infected+erythrocytes+to+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum: involvement of additional receptors in the cytoadherence of infected erythrocytes to microvascular endothelial cells.</a> Exp. Parasitol. 84, 42-55 (1996).</li>
<li>Corrigan, R. A., Rowe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+variation+in+early+innate+cytokine+induction+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Strain variation in early innate cytokine induction by Plasmodium falciparum.</a> Parasite. Immunol. 32, 512-527 (2010).</li>
<li>Rowe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+mycoplasma+contamination+in+Plasmodium+falciparum+cultures+and+methods+for+its+detection+and+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Implications of mycoplasma contamination in Plasmodium falciparum cultures and methods for its detection and eradication.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 92, 177-180 (1998).</li>
<li>Moll, K., Ljungström, I., Perlmann, H., Scherf, A., Wahlgren, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoll%2C+K+%22Methods+in+Malaria+Research%22">Methods in Malaria Research</a>. , MR4/ATCC. (2009).</li>
<li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li>
<li>Herricks, T., Antia, M., Rathod, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deformability+limits+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Deformability limits of Plasmodium falciparum-infected red blood cells.</a> Cell. Microbiol. , (2009).</li>
<li>Nakamura, K., Hasler, T., Morehead, K., Howard, R. J., Aikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum-infected+erythrocyte+receptor%28s%29+for+CD36+and+thrombospondin+are+restricted+to+knobs+on+the+erythrocyte+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum-infected erythrocyte receptor(s) for CD36 and thrombospondin are restricted to knobs on the erythrocyte surface.</a> J. Histochem. Cytochem. 40, 1419-1422 (1992).</li>
<li>Wassmer, S. C., Cianciolo, G. J., Combes, V., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LMP-420%2C+a+new+therapeutic+approach+for+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">LMP-420, a new therapeutic approach for cerebral malaria.</a> Med. Sci. (Paris). 22, 343-345 (2006).</li>
<li>Wassmer, S. C., Combes, V., Candal, F. J., Juhan-Vague, I., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+potentiate+brain+endothelial+alterations+induced+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Platelets potentiate brain endothelial alterations induced by Plasmodium falciparum.</a> Infect. Immun. 74, 645-653 (2006).</li>
</ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Serebral sıtma damgasını P. sekestrasyon beyin mikrovasküler 2, 3 içinde falciparum iRBC. Ancak, in vitro kültürlerde P. falciparum HBEC-5i, insan beyninin mikrovasküler endotel için bir model için sadece kötü cytoadhere. Burada fenotip bir daha &quot;gibi in vivo&quot;, HBEC-5i için bağlayıcı bir nüfus zenginleştirmek için basit bir tahlil geliştirdi. 4 P. Üç falciparum suşlarının başarıyla bu yöntem kullanılarak seçilmiştir. Dahası, HB3, bu protokol, çeşitli parazit ve endotel hücre türleri için kullanılabilir olduğunu belirten HDMEC ve HPMEC seçildi. Farklı hipotezler DD2 suşu ile bağlayıcı olmaması açıklayabilir. Bu parazit hattı knobless olduğu gerçeğini olma olasılığı en yüksek olan derin cytoadherence 13, 14 engellemektedir. Biz seçim yanlısı yanında kültür seçilmemiş parazitler önermektedir.Karşılaştırma için bir kontrol sağlamak için girilmesini sağlar. Bu parazit ligand adayları keşfetme umuduyla, bağlayıcı ve bağlayıcı olmayan parazitler transcriptome karşılaştırarak, örneğin, izin verecektir. TNF, serebral sıtma hastaları yüksek düzeyde bulunan bir sitokin ve göstermek için birçok yüzey proteinleri HBEC-5i (Claessens ve hazırlık al, ve 8, 15, 16) ifadesi neden olmuştur . Bu durumda, bağlı iRBC miktarı aktif HBEC-5i ile karşılaştırıldığında, normal HBEC-5i benzer oldu. Bu &quot;sekestrasyon modeli&quot; iRBC ve endotel hücre arasındaki moleküler etkileşim, olası anti-cytoadherence ilaçların etkisinin yanı sıra aynı zamanda çalışma için kullanılabilir. Bu durumda, &quot;8 kuyu odasına slaytlar&quot; (BD 354.628) veya &quot;CultureWell&quot; (Sigma C7735-20EA) gibi daha küçük kuyu, HBEC-5i kaplama öneririz.

seçimi plasmodium falciparum İnsan beyninin endotel hücreleri cytoadhesion için parazitler

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Çoğu insan sıtma ölüm, kan aşamalı Plasmodium falciparum parazitlerin neden olur . Serebral sıtma, hastalığın en çok yaşamı tehdit eden bir komplikasyon, 2-4 beyin mikrovasküler pigmentli trophozoite aşamada Plasmodium falciparum bulaşmış kırmızı kan hücreleri (iRBC) birikimi ile karakterize edilir . Bu mikrovasküler obstrüksiyon (sekestrasyon), asidoz, hipoksi ve zararlı inflamatuvar sitokinler (5) yol açar . İhtiyati Haciz, aynı zamanda insan vücudunda 2, 3 en mikrovasküler dokularda bulunur. IRBC kan damarı duvarlarının eklemek hangi mekanizma hala tam olarak anlaşılamamıştır. Ölümsüzleştirdi İnsan Beyin mikrovasküler endotel hücre hattı (HBEC-5i) kan-beyin bariyerini 6 in vitro model olarak kullanılmıştır. Ancak, Plasmodium falciparum iRBC yoğun sequestrat aksine sadece in vitro HBEC-5i kötü takmakserebral sıtma vakaları meydana gelir iyon. Bu nedenle, (zenginleştirmek) çeşitli P. seçmek için kaydırma tahlil geliştirdi HBEC-5i yapışma falciparum suşlarının yüksek bağlayıcı parazitler, in vivo olarak ortaya çıkar ne daha fazla temsilcisi nüfusu elde etmek için. Pigmentli trophozoite aşamada bir parazit kültürünün bir örnek (iRBC ve bulaşmamış RBC karışım) Petri kabı yetiştirilen HBEC-5i bir katman üzerinde yıkanır ve inkübe edilir. Inkübasyondan sonra, çanak nazikçe uRBC ve bağlanmamış iRBC ücretsiz yıkanır. Taze uRBC HBEC-5i ve inkübe gecede bağlı birkaç iRBC eklenir. Schizont sahne parazitler patlaması gibi, reinvade RBC ve bu halka sahne parazitler, ertesi gün hasat merozoites. Yeterince malzeme elde edilir (genellikle 2 ila 4 hafta) ve yeni bir tur seçim yapılabilir kadar Parazitler kültür. P. bağlı falciparum gerilme, 4 ila 7 tur seçim bir nüfusa almak için gereklien parazitler HBEC-5i bağlamak. Kademeli olarak bağlayıcı fenotip böylece HBEC-5i olağan seçim fenotip korumak için gerekli olan varyant yüzey antijeni gen ekspresyonu bir geçiş gösteren, bir kaç hafta sonra kaybolur. Özetle, biz bir seçim testi render P. geliştirdi falciparum parazitler &quot;serebral sıtma yapıştırıcı&quot; fenotip. 4 P. 3 seçmek için başardık HBEC-5i falciparum suşlarının. Bu testte de başarılı bir insan dermal ve pulmoner endotel hücreleri için bağlayıcı için parazitler seçmek için kullanılır olmuştur. Önemlisi, bu yöntem, beyin endotel bağlama aday parazit ligandlar belirlemek amacıyla doku-spesifik parazit nüfusu seçmek için kullanılabilir. Ayrıca, bu testte varsayılan anti-sekestrasyon ilaçlar 7 için ekran kullanılabilir.

Bir<em&gt; In vitro</em&gt; Serebral sıtma sekestrasyon model açıklanmıştır<sup&gt; 1</sup&gt;.<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Bulaşmış kırmızı kan hücreleri ölümsüzleştirdi insan beyin mikrovasküler endotel hücreleri için bağlayıcı için seçilir. Seçilen parazitler farklı bir fenotip göstermektedir. Seçim süreci çeşitli kullanılarak yapılabilir<em&gt; S. falciparum</em&gt; Suşları ve endotel hücre hatları.

Seçimi Plasmodium falciparum İnsan Beyninin endotel hücreleri Cytoadhesion için Parazitler

İnsanlardaki sıtma ölümlerinin çoğu, kan aşamasındaki Plasmodium falciparum parazitlerinden kaynaklanmaktadır. ...'nın en ölümcül komplikasyonu olan serebral sıtma,

Bu prosedürün genel amacı, insan beyin endotel hücrelerine bağlanan plasmodium, fpar ve parazitleri seçmektir. Bu işlem, öncelikle enfekte ve enfekte olmamış kırmızı kan hücrelerinin bir karışımını içeren plasmodium, fpar ve parazit kültürünün, insan beyin endotel hücreleri tabakası ile inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir; bir sonraki adımda, kültür ortamı ile birkaç kez yıkama yapılarak enfekte olmamış ve bağlanmamış kırmızı kan hücreleri uzaklaştırılır. Daha sonra, parazit popülasyonunun daha fazla büyümesini sağlamak için taze kırmızı kan hücreleri eklenir.Birkaç hafta sonraki son adım, yeterli parazit sayısına ulaşıldığı anda genel seçimi tekrarlamaktır. Nihayetinde, HBE beş i'ye bağlanan yüksek miktarda parazitin gösterilmesi için mikroskopi kullanılır. Bu yöntem, parazit ligandlarının veya sitoadherans sürecinde yer alan konakçı reseptör moleküllerinin tanımlanması gibi serebral malaria alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Lökosit azaltıcı bir filtreden geçirerek kırmızı kan hücrelerini beyaz kan hücrelerinden ayırıp, O pozitif grup tam kandan insan kırmızı kan hücrelerini hazırlayın. Hücreleri 1000 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve pellet'i tüm PMI Incomplete medium ile yeniden süspande edin.Bu yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın, ardından peleti yeniden süspanse edin. %50 hematokrit içeren PMI eksik ortamımızda, kırmızı kan hücreleri bir hafta boyunca dört santigrat derecede saklanır. Odium Valspar ile enfekte edilmiş kırmızı kan hücrelerini kültüre edin.%2 hematokrit içeren RPMI komple besiyeri ile her gün 37 °C'de, %3 karbondioksit, %1 oksijen ve %96 azot altında inkübe edin. Parazitlerin gelişim evresini değerlendirmek için Giemsa yayması hazırlayın. Kültürü 500 G'de beş dakika santrifüj ederek besiyerini günlük olarak değiştirin.Süpernatant aspire edilip yaklaşık haftada bir kez taze RPMI komple besiyeri eklenir. Parazitler, sulu %5D sorbitol işlemi ile senkronize edilir. Seleksiyon analizi, minimum %5 ila %10 paraziteminin gözlemlendiği halka evresi kültürünün ertesi günü gerçekleştirilebilir.Ek olarak, 60 mm'lik hbe five eye hücresi kabı başına, 30 µL'lik P hücre hacmi oluşturacak kadar parazit kültürü gereklidir. Bir 60 mm'lik doku kültürü kabına 2 µg/cm² fibronectin ve steril salin ekleyerek, insan beyin mikrodamar endotel hücre hattı veya H back fivei için hazırlayın.Kabı 37 °C'de 5 ila 20 dakika inkübe edin, ardından fibronectin çözeltisini aspire edin. Daha sonra, 25 cm²'lik doku flaskındaki HBE five I hücrelerini iyonizasyon ve santrifüj ile toplayın, hücre peletini 10 mL DMEM komple medyumda süspande edin. Ardından, bu hücre süspansiyonundan 1,5 mL'yi fibronectin ile işlem görmüş doku kültürü kabına ekleyin ve kültür %50 ila %100 konfluense ulaşana kadar 37 °C'de ve %5 CO2 ortamında iki ila üç gün inkübe edin; böylece pasaj kültürleri analiz gününde sitotoksisite testi için hazır hale gelecektir.HBE five I kültürü %50 ila %100 konfluens düzeyinde olmalıdır. Parazit kültürü ise en az %5 ila %10 parazit ve %2 hematokrit içeren pigmentli trofozoit evresinde olmalıdır. İlk olarak, kültür balonundan 1,5 milliliters parazit kültürünü pipetle çekin ve 15 milliliters bir santrifüj tüpüne aktarın.Kültürü 500 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve 10 mililitrelik taze hazırlanmış ılık DMEM eksiksiz olmayan besiyerinde yeniden süspande edin. Son santrifüj işlemi tamamlandıktan sonra bu yıkama adımını ikinci kez tekrarlayın.DMEM eksik besiyerini hazırlayın ve 30 µL pellet'i %1 BSA ile takviye edilmiş 1,5 mL DMEM eksik besiyerinde yeniden süspande edin. Ardından, hvac.Five içeren 60 mm'lik petri kabını geri alın.Göz hücreleri kültür medyumunu aspire edin ve üç mililitre DMEM (eksik besiyeri) ile iki kez yıkayın. Parazit çözeltisini beş HPE göz hücresi kabına ekleyin ve doku kültürü inkübatöründe toplam 75 dakika inkübe edin.İnkübasyon süresince iki kez, inkübasyonun ardından kabı nazikçe sallayarak ve döndürerek parazitleri süspande edin. Plastik pasta pipeti kullanarak besiyerini aspire edip üç mililitre ılık DMEM eksik besiyeri ekleyerek kabı beş kez yıkayın; son yıkamadan sonra plakayı nazikçe sallayıp kabı ters mikroskop altında inceleyin. Eğer hala çok sayıda enfekte olmamış eritrosit görünüyorsa, bunları uzaklaştırmak için yukarıda açıklanan yıkama prosedürünü tekrarlayın.Kapta bulunan ortam aspire edildikten sonra, 40 µL taze kırmızı kan hücresi paketlenmiş hücre hacmi ısıtılmış tam RPMI ortamında süspande edilir ve hücre süspansiyonu kaba eklenir. Kap, hava sızdırmaz bir inkübasyon haznesine yerleştirilir. Ardından kap, üç dakika boyunca %3 karbondioksit, %1 oksijen ve %96 nitrojen ile gazlanır.Ardından hazneyi 37 °C'deki bir inkübatöre yerleştirin ve gece boyunca bekletin. Bu inkübasyon sırasında, şizont aşamasındaki parazitler patlar ve merozoitler eritrositleri yeniden istila eder. Ertesi gün, yıkama işlemiyle halka aşamasındaki parazitleri toplayın.Daha öncekiyle benzer şekilde, ancak besiyerini daha kuvvetli pipetleyerek ve plakayı daha fazla sallayarak RPMI eksik besiyeri ile işlem yapın. Resüspande edilmiş eritrositleri içeren kullanılan tüm besiyerini 15 mililitrelik konik bir tüpte saklayın. Tüm eritrositlerin santrifüj kabından uzaklaştırıldığından emin olmak için plakayı ters mikroskop altında kontrol edin.Yıkanmış plakadan gelen medyayı içeren tüpü, parazitleri çöktürmek için santrifüjleyin, süpernatantı atın ve beş mililitre RPMI complete medium ile resüspansiyon yapın; ardından karışımı kültürleme için 25 santimetrekarelik bir erlene aktarın. Parazitler, yeterli materyal elde edilene ve yeni bir seleksiyon turu gerçekleştirilebilene kadar iki ila dört hafta boyunca kültüre edilir.Seçilmemiş HB three parazitleri, hbe five eye hücrelerine düşük düzeyde bağlanma gösterir. Bu görüntü, %2 glutaraldehit ile fikse edilmiş ve Giemsa ile boyanmış, mikroskop altında 1000 kat büyütme ile görüntülenen hbe five eye hücrelerini göstermektedir; görüntüler, enfekte olmamış eritrositler ve bağlanmamış enfekte eritrositler yıkanıp uzaklaştırıldıktan sonra alınmıştır. Her seçim turundan sonra, daha fazla parazit endotel hücrelerine bağlanır ve beş seçim turundan sonra seçimler daha kısa zaman aralıklarıyla tekrarlanabilir.HB üç HBE parazitleri ile burada gösterildiği gibi yüksek bağlanma kapasiteli parazit popülasyonları elde edilir. Bu tablo, HE beş'e bağlanma için başarıyla seçilen Plasmodium alspar suşlarının bir özetini göstermektedir. HB üç'ün, beş tur seçimin ardından TNF ile aktive edilmiş HE beş I üzerinde de seçildiğini belirtmek isterim.DD two suşu, seçilmemiş DD two ile karşılaştırıldığında HBE five I'e bağlanmada herhangi bir artış göstermemiştir. 400 kat büyütülmüş bu görüntü, seleksiyon öncesinde plasmodium alspar HB three parazitlerinin HD MEK dermal endotel hücrelerine bağlanmasını göstermektedir. Burada, plasmodium alspar HB three parazitlerinin aynı dermal endotel hücre hattına dört tur seleksiyondan sonraki bağlanması gösterilmiştir.Bu şekil, seleksiyon öncesinde plasmodium spar HB three parazitlerinin HP ME pulmoner endotel hücrelerine bağlanmasını göstermektedir. Dört seleksiyon turundan sonra, plasmodium spar HB three parazitlerinin H HP ME hücrelerine bağlanması artmıştır. hd e, C ve H HP EC için kullanılan kültür ortamları hafifçe farklılık gösterse de, seleksiyon için kullanılan protokol hbe five I ile aynıdır. Bu prosedürün ardından, seçilmemiş ve seçilmiş parazitlerdeki varyant yüzey antijeninin transkripsiyonunun karakterize edilmesi gibi ek soruları yanıtlamak için R-T-P-C-R veya mikro analiz gibi yöntemler uygulanabilir.

selection-plasmodium-falciparum-parasites-for-cytoadhesion-to-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bir<em&gt; In vitro</emOkumak&gt; Co-enfeksiyon Modeli<em&gt; Plasmodium falciparum</emİnsan İlköğretim Monosit kökenli Bağışıklık Hücrelerde&gt;-HIV-1 Etkileşimleri

Bu yöntem, Platelet dolayımlı topaklanma fenotip...

Trombosit-aracılı kesekleşme için Basit Protokolü<em&gt; Plasmodium falciparum</emBir kaynak Poor Setting&gt; ile enfekte Eritrosit

Beyin kan damarlarının gelen yapışık inflamatuar lökositlerin izolasyonu için bir...

Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-enfekte Fare

Antikor fonksiyonu Ölçme Plasmodium falciparum sıtma dokunulmazlık anlamanın anahtarıdır. Bu yöntem, uygun bir merozoit saflaştırılmasını ve akış sitometresi ile opsonizasyon bağımlı fagositoz ölçümünü açıklamaktadır.

Yüksek Kapasiteli saflaştırılması<em&gt; Plasmodium falciparum</emOpsonizing Antikor Analizlerde kullanım için&gt; merozoitler

kırmızı kan hücrelerinin içinde sıtma paraziti girdiği, ve çoğaltır. Merozoit işgali ve parazitemya doğru değerlendirme sıtma enfeksiyonu seyrini değerlendirmede nedenle çok önemlidir. Burada sıtma bir fare modelinde bu parametrelerin ölçülmesi için tabanlı protokol sitometri akışı tarif eder.

Akış Cytometry tarafından Kemirgen Plasmodium parazitemi Vivo Değerlendirilmesi ve Merozoit Invasion

Hücre temelli sistemlerde sıtma proteinlerin sentezlenmesi zor kalır. Biz HeLa hücrelerinden sıtma rekombinant proteinleri ifade rhoptry için iki adım ve (in vitro çeviri) bir adım IVT hücresi serbest ifade sistemlerini göstermektedir. Biz rhoptry proteinleri saflaştırmak için bir Ni-afinite reçinesi bazlı saflaştırma sistemini kullanır.

İfadesi için HeLa Tabanlı Hücre Özgür İfade Sistemleri<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteinler

Sıtma parazitlerinin sivrisinek aşamaları üzerinde ayrıntılı araştırmalar, etkili bulaşma engelleme stratejileri tasarlamak için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, enfeksiyöz gametositlerin etkili bir şekilde nasıl kültüreılacağını ve daha sonra bu gametositlerin sivrisineklere nasıl beslendiğini gösterir P. falciparumsivrisinek aşamaları .

Plazmodium falciparum Yapay Membran Besleme Yoluyla Gametosit Kültürü ve Sivrisinek Enfeksiyonu

Bu protokolün genel amacı, plasmodium falciparum enfeksiyonuna doğal olarak maruz kalan bireylerin sera veya plazmasında bulunan antikorların kapasitesinin nasıl ölçüleceklerine, parazit enfekte eritrositlerin (IEs) fagositozunu opsonize etmek ve indüklemek tir.

Akış SitometriSi-Bazlı Bir Test ile Plasmodium falciparum Parazitlerine Doğal Olarak Edinilmiş Fagositoz-Indükleyen Antikorların Ölçülmesi

Kriyo-elektron tomografisi için dalma dondurulmuş biyolojik örneklerden vitreus ızgara üzerinde lamel üretmek için odaklanmış iyon ışını frezeleme kullanımı.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Çift Işınlı Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanarak Vitreus Biyolojik Numunelerinden Lamel Hazırlanması

Standart membran besleme testi (SMFA), potansiyel sıtma önleyici bileşiklerin değerlendirilmesi ve tanımlanması için altın standart olarak kabul edilir. Bu yapay besleme sistemi, bu tür bileşiklerin Plasmodium falciparum parazitinin yoğunluğu ve prevalansı üzerindeki etkilerini daha fazla değerlendirmek için sivrisinekleri enfekte etmek için kullanılır.

Anofellerde Plasmodium falciparum Enfeksiyonunun Tespiti için Standart Membran Besleme Testi

Kimyasal genetik, bir kapı bekçisi kalıntısının, hedef lokusta farklı bir yan zincir içeren bir amino asit ile değiştirilmesini içerir. Burada, cdpk1'in hipomorfik bir alelini içeren mutant bir parazit oluşturduk ve mutant arka planda parazit tarafından benimsenen telafi edici yolları belirledik.

Bitki Benzeri Kinazların Hipomorfik Alelini Barındıran Mutant Bir Sıtma Parazitinde Telafi Edici Yolların Gelişimini Anlamak

Öğrenin Plasmodium falciparum parazitlerinin insan beyin endotelyal hücrelerine bağlanması için seçilme yöntemini. Bu model serebral malarya mekanizmalarını araştırmak ve tedavi hedefleri belirlemek için değerlidir.

Seçimi Plasmodium falciparum İnsan Beyninin endotel hücreleri Cytoadhesion için Parazitler

Daha fazla video keşfet