Seçimi Plasmodium falciparum İnsan Beyninin endotel hücreleri Cytoadhesion için Parazitler

Bu prosedürün genel amacı, insan beyin endotel hücrelerine bağlanan plasmodium, fpar ve parazitleri seçmektir. Bu işlem, öncelikle enfekte ve enfekte olmamış kırmızı kan hücrelerinin bir karışımını içeren plasmodium, fpar ve parazit kültürünün, insan beyin endotel hücreleri tabakası ile inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir; bir sonraki adımda, kültür ortamı ile birkaç kez yıkama yapılarak enfekte olmamış ve bağlanmamış kırmızı kan hücreleri uzaklaştırılır. Daha sonra, parazit popülasyonunun daha fazla büyümesini sağlamak için taze kırmızı kan hücreleri eklenir.

Birkaç hafta sonraki son adım, yeterli parazit sayısına ulaşıldığı anda genel seçimi tekrarlamaktır. Nihayetinde, HBE beş i'ye bağlanan yüksek miktarda parazitin gösterilmesi için mikroskopi kullanılır. Bu yöntem, parazit ligandlarının veya sitoadherans sürecinde yer alan konakçı reseptör moleküllerinin tanımlanması gibi serebral malaria alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Lökosit azaltıcı bir filtreden geçirerek kırmızı kan hücrelerini beyaz kan hücrelerinden ayırıp, O pozitif grup tam kandan insan kırmızı kan hücrelerini hazırlayın. Hücreleri 1000 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve pellet'i tüm PMI Incomplete medium ile yeniden süspande edin.

Bu yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın, ardından peleti yeniden süspanse edin. %50 hematokrit içeren PMI eksik ortamımızda, kırmızı kan hücreleri bir hafta boyunca dört santigrat derecede saklanır. Odium Valspar ile enfekte edilmiş kırmızı kan hücrelerini kültüre edin.

%2 hematokrit içeren RPMI komple besiyeri ile her gün 37 °C'de, %3 karbondioksit, %1 oksijen ve %96 azot altında inkübe edin. Parazitlerin gelişim evresini değerlendirmek için Giemsa yayması hazırlayın. Kültürü 500 G'de beş dakika santrifüj ederek besiyerini günlük olarak değiştirin.

Süpernatant aspire edilip yaklaşık haftada bir kez taze RPMI komple besiyeri eklenir. Parazitler, sulu %5D sorbitol işlemi ile senkronize edilir. Seleksiyon analizi, minimum %5 ila %10 paraziteminin gözlemlendiği halka evresi kültürünün ertesi günü gerçekleştirilebilir.

Ek olarak, 60 mm'lik hbe five eye hücresi kabı başına, 30 µL'lik P hücre hacmi oluşturacak kadar parazit kültürü gereklidir. Bir 60 mm'lik doku kültürü kabına 2 µg/cm² fibronectin ve steril salin ekleyerek, insan beyin mikrodamar endotel hücre hattı veya H back fivei için hazırlayın.

Kabı 37 °C'de 5 ila 20 dakika inkübe edin, ardından fibronectin çözeltisini aspire edin. Daha sonra, 25 cm²'lik doku flaskındaki HBE five I hücrelerini iyonizasyon ve santrifüj ile toplayın, hücre peletini 10 mL DMEM komple medyumda süspande edin. Ardından, bu hücre süspansiyonundan 1,5 mL'yi fibronectin ile işlem görmüş doku kültürü kabına ekleyin ve kültür %50 ila %100 konfluense ulaşana kadar 37 °C'de ve %5 CO2 ortamında iki ila üç gün inkübe edin; böylece pasaj kültürleri analiz gününde sitotoksisite testi için hazır hale gelecektir.

HBE five I kültürü %50 ila %100 konfluens düzeyinde olmalıdır. Parazit kültürü ise en az %5 ila %10 parazit ve %2 hematokrit içeren pigmentli trofozoit evresinde olmalıdır. İlk olarak, kültür balonundan 1,5 milliliters parazit kültürünü pipetle çekin ve 15 milliliters bir santrifüj tüpüne aktarın.

Kültürü 500 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve 10 mililitrelik taze hazırlanmış ılık DMEM eksiksiz olmayan besiyerinde yeniden süspande edin. Son santrifüj işlemi tamamlandıktan sonra bu yıkama adımını ikinci kez tekrarlayın.

DMEM eksik besiyerini hazırlayın ve 30 µL pellet'i %1 BSA ile takviye edilmiş 1,5 mL DMEM eksik besiyerinde yeniden süspande edin. Ardından, hvac.Five içeren 60 mm'lik petri kabını geri alın.

Göz hücreleri kültür medyumunu aspire edin ve üç mililitre DMEM (eksik besiyeri) ile iki kez yıkayın. Parazit çözeltisini beş HPE göz hücresi kabına ekleyin ve doku kültürü inkübatöründe toplam 75 dakika inkübe edin.

İnkübasyon süresince iki kez, inkübasyonun ardından kabı nazikçe sallayarak ve döndürerek parazitleri süspande edin. Plastik pasta pipeti kullanarak besiyerini aspire edip üç mililitre ılık DMEM eksik besiyeri ekleyerek kabı beş kez yıkayın; son yıkamadan sonra plakayı nazikçe sallayıp kabı ters mikroskop altında inceleyin. Eğer hala çok sayıda enfekte olmamış eritrosit görünüyorsa, bunları uzaklaştırmak için yukarıda açıklanan yıkama prosedürünü tekrarlayın.

Kapta bulunan ortam aspire edildikten sonra, 40 µL taze kırmızı kan hücresi paketlenmiş hücre hacmi ısıtılmış tam RPMI ortamında süspande edilir ve hücre süspansiyonu kaba eklenir. Kap, hava sızdırmaz bir inkübasyon haznesine yerleştirilir. Ardından kap, üç dakika boyunca %3 karbondioksit, %1 oksijen ve %96 nitrojen ile gazlanır.

Ardından hazneyi 37 °C'deki bir inkübatöre yerleştirin ve gece boyunca bekletin. Bu inkübasyon sırasında, şizont aşamasındaki parazitler patlar ve merozoitler eritrositleri yeniden istila eder. Ertesi gün, yıkama işlemiyle halka aşamasındaki parazitleri toplayın.

Daha öncekiyle benzer şekilde, ancak besiyerini daha kuvvetli pipetleyerek ve plakayı daha fazla sallayarak RPMI eksik besiyeri ile işlem yapın. Resüspande edilmiş eritrositleri içeren kullanılan tüm besiyerini 15 mililitrelik konik bir tüpte saklayın. Tüm eritrositlerin santrifüj kabından uzaklaştırıldığından emin olmak için plakayı ters mikroskop altında kontrol edin.

Yıkanmış plakadan gelen medyayı içeren tüpü, parazitleri çöktürmek için santrifüjleyin, süpernatantı atın ve beş mililitre RPMI complete medium ile resüspansiyon yapın; ardından karışımı kültürleme için 25 santimetrekarelik bir erlene aktarın. Parazitler, yeterli materyal elde edilene ve yeni bir seleksiyon turu gerçekleştirilebilene kadar iki ila dört hafta boyunca kültüre edilir.

Seçilmemiş HB three parazitleri, hbe five eye hücrelerine düşük düzeyde bağlanma gösterir. Bu görüntü, %2 glutaraldehit ile fikse edilmiş ve Giemsa ile boyanmış, mikroskop altında 1000 kat büyütme ile görüntülenen hbe five eye hücrelerini göstermektedir; görüntüler, enfekte olmamış eritrositler ve bağlanmamış enfekte eritrositler yıkanıp uzaklaştırıldıktan sonra alınmıştır. Her seçim turundan sonra, daha fazla parazit endotel hücrelerine bağlanır ve beş seçim turundan sonra seçimler daha kısa zaman aralıklarıyla tekrarlanabilir.

HB üç HBE parazitleri ile burada gösterildiği gibi yüksek bağlanma kapasiteli parazit popülasyonları elde edilir. Bu tablo, HE beş'e bağlanma için başarıyla seçilen Plasmodium alspar suşlarının bir özetini göstermektedir. HB üç'ün, beş tur seçimin ardından TNF ile aktive edilmiş HE beş I üzerinde de seçildiğini belirtmek isterim.

DD two suşu, seçilmemiş DD two ile karşılaştırıldığında HBE five I'e bağlanmada herhangi bir artış göstermemiştir. 400 kat büyütülmüş bu görüntü, seleksiyon öncesinde plasmodium alspar HB three parazitlerinin HD MEK dermal endotel hücrelerine bağlanmasını göstermektedir. Burada, plasmodium alspar HB three parazitlerinin aynı dermal endotel hücre hattına dört tur seleksiyondan sonraki bağlanması gösterilmiştir.

Bu şekil, seleksiyon öncesinde plasmodium spar HB three parazitlerinin HP ME pulmoner endotel hücrelerine bağlanmasını göstermektedir. Dört seleksiyon turundan sonra, plasmodium spar HB three parazitlerinin H HP ME hücrelerine bağlanması artmıştır. hd e, C ve H HP EC için kullanılan kültür ortamları hafifçe farklılık gösterse de, seleksiyon için kullanılan protokol hbe five I ile aynıdır. Bu prosedürün ardından, seçilmemiş ve seçilmiş parazitlerdeki varyant yüzey antijeninin transkripsiyonunun karakterize edilmesi gibi ek soruları yanıtlamak için R-T-P-C-R veya mikro analiz gibi yöntemler uygulanabilir.