Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Nöronlarında yeşil floresan proteinleri veya GFP'leri ifade eden transgenik Caenorhabditis elegans içeren bir agar plakası ile başlayın.
Plakaya steril su ekleyin, solucanları kaldırmak için döndürün ve bir tüpe aktarın.
Solucanların yerleşmesine izin verin, ardından fazla suyu çıkarın ve tekrar askıya alın.
Yeniden süspanse edilmiş solucanları pestisit kaplı bir plakaya ve pestisit içermeyen bir kontrol plakasına aktarın, ardından inkübe edin.
Eylemlerine bağlı olarak, pestisit spesifik olarak belirli nöronlara zarar verir ve nöronal şişmeye neden olarak GFP ekspresyonunu azaltır.
Solucanları anestezik bir madde içeren bir agaroz pedine aktarın, ardından bir lamel yerleştirin.
Slaytı bir floresan mikroskoba monte edin. İlk olarak, faz kontrast modunu kullanarak solucanları görselleştirin, ardından floresan moduna geçin.
Pestisitle tedavi edilen solucanlarda, nöronlar azalmış floresan, şişmiş soma ve nöronal süreçlerde boşluklar sergiler ve bu da nörodejeneratif etkileri gösterir.
Kontrol altındayken, sağlıklı nöronlar parlak floresan ile sağlam soma gösterir.
Bir mikropipet kullanarak, nematod plakasına 1 mililitre steril su koyun. Ardından, nematodları kaldırmak için suyu çalkalayın. Ardından, nematodlarla birlikte sıvıyı 1,5 mililitrelik bir mikrofüj tüpüne çıkarın. 10 dakika sonra, nematodlar yerçekimi ile çöktüğünde, en az 500 mikrolitre suyu dikkatlice çıkarın ve atın.
Daha sonra, nematodları yeniden süspanse edin ve kesilmiş sarı bir pipet ucu kullanarak, her bir plakanın en az 10 yetişkin solucana sahip olduğundan emin olarak, her bir tedavi plakasına 50 ila 100 mikrolitre asılı solucan çıkarın. Düzgün kalınlıkta bir ped oluşturmak için slaytın yalnızca bir tarafına bir parça etiket bandı yerleştirerek iki slayt hazırlayın.
Ardından, tezgahın arasına temiz, kullanılmayan bir sürgü yerleştirin. Bir mikropipetleyici kullanarak slaydın ortasına 10 mikrolitrelik bir erimiş agaroz damlatın. Ardından, damla ile slayta dik olarak üstüne başka bir temiz slayt yerleştirerek damlayı düzleştirin ve agaroz damlasının etiketleme bandının kalınlığını oluşturması için basınç uygulayın.
Daha sonra, iki sürgüyü ayırmak için sabit bir basınç uygulayın. Ardından, slaytı agar tarafı yukarı bakacak şekilde tezgahın üzerine koyun ve kullanmadan önce bir ila iki dakika kurumasını bekleyin. Agaroz pedi ile hazırlanan slayta nematod eklemek için, agar pedine 1 molar sodyum azid içeren 5 mikrolitrelik bir damla su ekleyin, bu da solucanları uyuşturacak ve onları harekete geçirecektir.
Daha sonra, nematodları transfer etmeden önce ve sonra sterilize edilmesi gereken bir solucan penası kullanarak tedavi slaydı başına en az 10 nematod damlacığa aktarın. Ardından, forseps kullanarak bir açıyla yerleştirerek ve yavaşça indirerek bir lamel ekleyin.
Daha sonra, solucanları gözlemlemek için hazırlanan ıslak montajı bir floresan mikroskobu üzerine yerleştirin, önce 10x büyütme ve faz kontrastı altında, ardından faz kontrastı ve flüoresan aydınlatma ile 40x büyütme altında.
Mikroskop tablasına her seferinde hazırlanmış bir ıslak montaj parçası yerleştirin ve mikroskop tablası klipslerini kullanarak yerine sabitleyin. Ardından, tipik olarak 10x olan en düşük büyütme objektifine sahip ıslak yuvaları görüntülemeye başlayın ve nematodları görselleştirmek ve odaklanmak için parlak bir alan veya faz kontrastı kullanın.
Görüş alanına bir nematod yerleştirildiğinde, mikroskop üzerindeki ince odak düğmesini kullanarak ona odaklanın. Ardından, kadranı çevirerek aydınlatmayı floresan olarak değiştirin ve dijital görüntüleri yakalamak için ışığı kameraya yönlendirin.
Ardından, görüntüleme yazılımını kullanarak aydınlatmayı, nöronların parlak bir şekilde aydınlatılacağı, ancak aşırı doygun olmayacağı şekilde ayarlayın. Bir noktada, şekilleri için bir büyütme ölçeği sağlamak için hücre görüntüleriyle aynı büyütmede bir cetvelin ayrı bir görüntüsünü elde edin.
