Karaciğer Hücreleri Karaciğer Perfüzyon Arıtma Takip in vivo Karaciğer endositoz

Bu prosedürün genel hedefleri, karaciğer hücrelerinin endositik aktivitesini değerlendirmek, ardından plastik tabaklarda kültürlenebilen saf bir canlı karaciğer popülasyonunun, sinüzoidal endotel hücrelerinin izolasyonunu yapmaktır. Bu, canlı bir hayvanın karaciğerinin kanüle edilmesi ve eksize edilmesi ve kanı temizlemek için karaciğerin tuz tamponlu bir çözelti ile yıkanmasıyla gerçekleştirilir. Karaciğer hücreleri daha sonra içselleştirme için etiketli ligandlara maruz bırakılır.

Bir sonraki adım, süspansiyon halinde karaciğer hücrelerinin bir karışımını üretmek için karaciğeri kollajenaz ile sindirmektir. Perol gradyanları ile bir sonraki diferansiyel santrifüjleme, saniyeleri yıldız hücreleri, küçük hepatositler, kalan kan hücreleri ve hücre kalıntılarından ayırmak için kullanılır. Son adım, cam üzerine yapıştırma ile saniye hücrelerinden ayrılmaktır.

Sonunda, ligand alımı için test edilebilen ve/veya aşağı akış uygulamaları için kültürlenebilen canlı saflaştırılmış saniyeler elde edilir. Bu yöntem, karaciğer endotel hücrelerinin rolü ve kandaki makromoleküllerin temizlenmesi veya karaciğer hasarı, yağlı karaciğer hastalığı, SSI, fibroz ve yaşlanma gibi farklı fizyolojik durumlara verilen yanıtlar gibi karaciğer biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Ölümsüzleştirilen diğer karaciğer hücrelerinin aksine, farklılaşmış karaciğer sinüzoidal endotel hücre hatları mevcut değildir.

Dolayısıyla bu birincil hücreler doğrudan hayvandan türetilmelidir. Bugün size göstereceğimiz prosedür, santrifüjleme ve lusyon gibi sermaye ekipmanı kullanılmadan karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin saflaştırılmasını içerir. Size göstereceğimiz prosedür, hücrelerin kısa süreli kültür bazında toplanmasını içerir ve tüm prosedür boyunca steril teknik kullanmayacağız.

Bununla birlikte, uzun süreli kültürler kullanmak istiyorsanız, steril teknik kullanır ve bir biyogüvenlik kabini kullanırsınız. Bu işlemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü dikişlerin sıkılığı ile birlikte kateterin yerleştirilmesi, karaciğeri kesmeden karaciğerin hayvandan alınması ve kateterin çıkarılması kritik öneme sahiptir. Kollajenazı tartarak ve buzun üzerine koyarak deneye hazırlanın.

Daha sonra TBS'yi ısıtın ve oksijenlendirin ve gerekli araçları hazırlayın. Daha sonra, 200 gramlık bir sıçan seçin ve bir flor odasında derin bir şekilde uyuşturun. Ventral karnı% 70 etanol ile ıslatarak anesteziyi onaylayın.

Yanıt yoksa, en iyi sonucu almak için makas ve forseps kullanarak karın boşluğunu açmaya devam edin. Karaciğerin beyazlatılması için aşağıdaki adımlar sadece birkaç dakika sürmelidir. Portal veni bulun ve damarın altına, mezenterik dalın hemen üzerine iki dikiş yerleştirin.

Şimdi damarı 18 gauge kateter ile kanüle edin. Kateteri tıkayan iğne, ipliğin halkasının birkaç milimetre ötesine gitmeli, iğnenin serbest kalmasını tetiklemeli ve sütürü, büyükanne veya kare düğüm olarak da bilinen iki el üstü düğümle sıkmalıdır. En fazla 10 dakika boyunca TBS ile karaciğerden kanı yıkamaya başlayın.

Karaciğer kızarırken ana arterlerden birini kesin. GI yolunu ve bağ dokusunu keserek karaciğeri çıkarın. Eksize edilen karaciğeri, sıvıların yeniden dolaşımına izin veren ancak sıvıları henüz 50 mililitreye geri döndürmeyen bir huni üzerine yerleştirin.

Küçük bir beherde RPMI Ortamı. Nihai konsantrasyona,% 0.05 BSA ve 0.01 miliküri radyo etiketli heparin veya diğer uygun şekilde etiketlenmiş ligand ekleyin. Endositoz için, oksijenasyona izin vermek için bu be'yi cihaza takın.

Pompayı kapatın, giriş borusunu değiştirin ve ardından pompayı dakikada 20 mililitre olarak açın. Etiketli RPMI karaciğere yaklaştığında, pompayı kapatın ve huni ve hortumdaki fazla sıvının boşalmasına izin verin. Etiketli ortamın devridaim yapmasını sağlamak için tahliye borusunu ortam kabına yerleştirin ve ardından pompayı yeniden başlatın.

Sıvıların karaciğerde bir saatten fazla dolaşmasına izin vermeyin. Bu içselleştirme adımı sırasında, karaciğerdeki sıcaklığın üzerini örterek stabil olduğundan emin olun ve ligandın endositozunu sonlandırmak için kollajenazı sindirime hazırlayın. Karaciğer, kollajenaz sindirimine hazırlanırken bağlanmamış ligandın karaciğer sinüzoidlerini temizlemek için iki dakika boyunca TBS ile yeniden yıkanır.

TBS ile iki dakikalık yeniden yıkama sırasında, önceden tartılmış kollajenaz A'yı tampon ikide 0.45 mikromolar konsantrasyona çözün ve karaciğeri yıkadıktan hemen sonra çözeltiyi süzün, pompayı kapatın ve sıvıları kollajenaz içinde yıkamak için değiştirin. Aynı akışta devridaim ile yıkamaya başlayın. Kollajenazdan sonra dakikalara kadar oranlayın.

Bir perfüzyon. Kateteri çıkarın ve karaciğeri bir tabağa aktarın. Forseps kullanarak bir tampon ekleyin, karaciğerin kapsülünü soyun ve hücreleri sıvı içinde sallayın.

Sıvı opak hale geldikçe, hücreleri 100 mikronluk bir ağdan, ardından 30 mikronluk bir ağdan ve ardından 50 mililitrelik konik bir silindirden geçirin. Oda sıcaklığında, tabağa daha fazla tampon ekleyin ve daha fazla karaciğer hücresini mekanik olarak ayırın. Ardından bunları filtreye aktarın.

Makul bir çalkalama ile hiçbir hücre yerinden çıkamayana kadar bu işleme devam edin. Hücreleri yıkayarak başlayın, hücreleri soluklaşana kadar 150 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra parankimal olmayan hücreler içeren S natin'i buz üzerinde 50 mililitrelik bir koniye aktarın ve peleti 40 mililitrede yeniden süspanse edin.

Bir tampon bir. En az% 97 hepatosit olan peletler yapmak için yıkama işlemini tampon üçte iki kez tekrarlayın ve en az% 95 saf santrifüj olan bir S saniye popülasyonu elde edin, süper natinin konikliği 200 kez G'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca. Daha sonra sıvıyı atın ve yeniden başlatın, tüm hücre peletlerini dört santigrat derecede beş mililitre R-P-M-I-B-S-A içinde askıya alın.

Hücreleri iki tüpe çekin ve tüpleri 35 mililitreye kadar R-P-M-I-B-S-A ile doldurun. Şimdi hücreleri üç dakika boyunca 100 kez G'de santrifüjleyin ve saniyeleri içeren en üstteki 25 mililitre süpernatanı buz üzerinde 50 mililitrelik bir koniğe aktarın. Daha sonra peleti kalan 10 mililitre ortamda yeniden süspanse edin ve 25 mililitre soğuk R-P-M-I-B-S-A çözeltisi ekleyin.

Saniyeler içinde iki S natin koleksiyonu daha yapmak için yıkama adımını bir kez tekrarlayın. Şimdi süpernatan koleksiyonlarını santrifüjleme sırasında dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin. PBS'de arama başına üç konik% 20 mililitre% 25 doldurun.

Onları buzun üzerine koyun ve altlık yaparak bir gradyan oluşturun. Her tüpte çağrı başına 15 mililitre% 50. Hücreleri toplam 30 mililitre, BSA ile RPMI içinde yeniden süspanse edin, bunları birleştirin ve ardından her gradyanı 10 mililitre kombine hücre süspansiyonu ile dikkatlice kaplayın.

Gradyanları dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 900 kez G'de santrifüjleyin, çünkü saniyeler ve kofer hücreleri yukarıdan aşağıya %25 50 arayüz aspiratında ve %25 50'lik arayüzün yakınına kadardır. Bu, yıldız hücrelerini çıkarır, şimdi hücreleri %25 50 arayüzde toplar ve bunları soğuk RPMI ile yaklaşık 40 mililitrelik bir nihai hacme kadar bir konik yapıya aktarır. Bu, çağrı başına santrifüjü, saniyeleri ve fer hücrelerini dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 350 kez G'de seyreltir.

Peletleri yaklaşık 10 mililitre önceden uyarılmış, değiştirilmemiş olarak yeniden süspanse edin. RPMI: süspansiyonu bir Petri kabına veya kristalizasyon kabına aktarın ve kabı 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Kuluçkadan sonra, tabağı hafifçe çalkalayın ve süpernatanttaki saniyeleri toplayın.

Cooper hücreleri cama yapışmış olacak ve saniyeler, tabağa yapışan hücrelerden modifiye RPMI ortam hücresi lizatları ile fibronektin kaplı plakalar üzerinde kültürlenebilir ve süspansiyonda kalanlar SDS sayfası ile ayrıldı ve anti CD 1 63 antikoru ile incelendi. CD 1 63 markörü içeren Cooper hücreleri, cama yapışmayan cam hücrelere bağlanarak CCS'den ayrıldı. Cam, fibronektin kaplı plastik üzerine kaplandı. Altı kuyu yemekleri ve gece boyunca inkübe edilir. %0,1 BSA ve kalem streptokok ile desteklenmiş RPMI ile.

Mikroskopi gibi faz kontrastı altında, saniyeler, in vivo mimarilerini anımsatan çok düz bir sitoplazmik morfoloji sergiler. S Stalin iki reseptörünün her iki izoformuna karşı bir monoklonal antikor. Anahat protokolü kullanılarak toplanan hepatosit, lizat ve CCS'yi araştırmak için bir SEC farklılaşma belirteci kullanıldı.

Beklendiği gibi, saniyeler stepin için olumluydu. İki. Önceki deneylerde, heparinin karboksilat grubu üzerine bir biyotin etiketi ile etiketlenmiş heparin enjekte edildi. Disakkarit, enjeksiyondan sonraki 30 dakika boyunca iyotlu streptavidin ile konjuge edildi.

Karaciğer, prosedürleri kullanarak etiketli heparini temizleyen birincil organdı. Bu videoda, etiketli heparinin büyük çoğunluğunun saniyeler içinde içselleştirildiğini gösteriyoruz. Hepatositlerin aksine, bu içselleştirme olayları, hücrelerin doğal durumlarında olduğu sağlam bir karaciğerde meydana geldi.

Bu videoyu izledikten sonra, karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin canlı bir hayvandan nasıl saflaştırılacağını iyi anlamış olmalısınız. Ve bu hücreleri 24 ila 48 saat içinde kullanmak önemlidir. Karaciğer gibi sinüzoidal endotel hücreleri kültürde çok kısa sürede içgüdüsel özelliklerini kaybederler.