Erişkin Bir Drosophila Bacağında Floresan İşaretli Motor Nöronların Görüntülenmesi

İki lamel arasındaki boşluğa monte edilmiş sabit, genetik olarak değiştirilmiş bir Drosophila bacağı içeren konfokal bir mikroskop kurulumuyla başlayın. Bacaktaki motor nöron aksonları, zar etiketli bir floresan proteini eksprese eder.

Motor nöron aksonlarından gelen floresan sinyalleri ve bacağın en dış tabakası olan kütikülün arka plan otofloresansını yakalamak için tek bir lazer ve iki dedektör kullanın.

Optimum çözünürlük ve görüntü kalitesi için görüntüleme ayarlarını yapın.

Parlak bir aksonal sinyal ve doymuş bir kütikül otofloresan sağlamak için parlaklığa ince ayar yapın.

Hem aksonal sinyal hem de kütikül otofloresan ile bir görüntü yakalayın.

Uygun görüntü işleme yazılımını kullanarak, yakalanan görüntüyü açın.

Kanalları ayırın ve arka plan kütikül otofloresansını aksonal sinyalden çıkarın.

Görüntü netliğini artırmak için her iki sinyalin parlaklığını ve kontrastını ayarlayın.

Bacak segmentindeki motor nöron aksonlarını görselleştirmek için birleştirilmiş bir görüntü oluşturmak için kanalları birleştirin.

Bacakları görüntülemek için, hem GFP hem de kütikül otofloresansını elde etmek için ilk yolu ayarlamak üzere 488 nanometre lazer ve iki dedektörü aynı anda kullanın. 20 ila 25x yağa daldırma hedefi seçin ve çözünürlüğü 12 bit derinliğe sahip 1024 x 1024 piksel olarak ayarlayın. Ve z aralığını 1 mikrometre olarak ayarlayın. Slaytı mikroskop tablasına yükleyin.

Ve her iki dedektör için de aynı lazer gücünü kullanarak, parlak bir GFP sinyali elde etmek için ilk dedektörün kazancını ayarlayın. Ve yüksek kütikül sinyaline sahip bazı alanların bu dedektörde doymuş bir sinyal üretmesini sağlamak için ikinci dedektörü ayarlayın. Ardından, bir bacak uzatılmışsa veya tek bir karede görüntülenemeyecek kadar büyükse, tüm bacağı yakalamak için döşeme veya konum seçeneklerini kullanarak bacakları görüntüleyin.

Görüntü işleme için ImageJ Fiji'de konfokal yığını açın. Ve TIFF biçiminde olmayan görüntüleri açmak için biçimler eklentisini kullanın. Kanalları bölmek için Görüntü, Renk ve Kanalları Böl'ü seçin. Kütikül sinyalini GFP sinyalinden çıkarmak için İşlem ve Görüntü Hesaplayıcı'yı açın ve dedektörden yığını Image1 olarak seçin.

İşlem penceresinde Çıkar'ı seçin ve Dedektör 2'den izi Image2 olarak seçin, böylece yalnızca endojen GFP sinyali elde edilecektir. Endojen GFP sinyali için maksimum yoğunluk projeksiyonu oluşturmak için Image, Stacks, Z Protect'i kullanın. Parlaklığı ve kontrastı ayarlamak için parlaklık kontrol penceresindeki kontrolleri kullanın.