Larvaların Kalp Diseksiyon, Çocuk ve Yetişkin Zebra balığı, Danio rerio

Bu prosedürün genel amacı, kalbi zebra balığından çıkarmaktır. Bu, önce zebra balıklarının toplanması ve sabitlenmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, kalbi görselleştirmek için vücut boşluğu açılır.

Daha sonra kalp çıkarılır ve kalp dışı dokudan temizlenir. Son olarak kalbin fotoğrafı çekilir. Sonuç olarak, kalbin zaman içindeki morfolojisi mikroskopi, kesit alma ve fotoğrafçılık yoluyla görülebilir.

Bu yöntemin görsel gösterimi, diseksiyonun anahtarı olarak kritik öneme sahiptir. Sta'nın öğrenilmesi zordur çünkü zebra balıkları küçüktür ve dokuların rengi farklı değildir ve tanımlanması zor olabilir Larvalardan yetişkin aşamalarına kadar zebra balığı üretmek. Bu deneyler için, yetişkin balıklarla bireysel armut veya grup çiftleşmeleri yapın.

Embriyoları temizleyin ve 28 santigrat derece inkübatörde saklayın. Döllenmeden beş gün sonra, balıkları 10 ila 15 balık yoğunluğunda tanklara ayırın ve balık tesisine yerleştirin. Balığı uygun yaşta tankından çıkarın ve uyuşturmak için %0,2 Trica'ya koyun.

Anestezi uygulanmış balığı ötenazi yapmak için 15 dakika buzlu suda bekletin. Bu arada, bir tabağa bir XPBS'de %4 para formaldehit veya PFA ekleyin. Toplanan balıkları %4 PFA'da oda sıcaklığında bir ila iki saat kuluçkaya yatırın, ardından gece boyunca perfil ile sarılmış bir Petri kabında dört santigrat derecede inkübe edin.

Bu, balığı düz tutar ve fiksasyondan sonra diseksiyonu çok daha kolay hale getirir. PBS'de %0,1 ile iki kez durulayınTween veya PBT balıkları PBT'de dört santigrat derecede 10 güne kadar saklanabilir. Tek bir balığı, yarısı taze PBS ile doldurulmuş bir Petri kabına koyun ve sağ tarafına koyun.

Dijital bir milimetre kumpas kullanarak kuyruk yüzgeçleri dahil değil, balığın burnundan kuyruğun tabanına kadar olan uzunluğunu ölçün. Bu standart uzunluk veya sl'dir. Tek bir balığın ve ortaya çıkan disseke edilmiş kalbin daha sonraki analiz için izlenmesine izin vermek için her balığa bir sayı harfi kombinasyonu atayın.

Tüm ölçümler de dahil olmak üzere tüm verileri bir elektronik tabloya girin ve diseksiyondan önce bu etiketlere göre düzenleyin. PCR tüp şeritlerini atanmış takip numarasıyla etiketleyin ve tüpleri PVT veya daha fazla analiz için uygun başka bir çözelti ile doldurun. Standart uzunlukta 12 milimetreden daha kısa balıklar için vücudu forseps ile stabilize ederken, başını gözler ve solungaçlar arasında tutarken balığın ventral bölgesini bir Petri kabına yönlendirin.

Pim tutucuda keskin forseps veya mikro iğne kullanarak. Kalbi ortaya çıkarmak için göğüs kaslarını ve yüzgeçlerini vücuttan çıkarın. Diseksiyon sırasında forsepslerin sürekli hareketi, PPT'de balığı hareket ettiren akımlara neden olabilir.

Bu özellikle küçük balıklar için sorunludur. Bu nedenle, göğüs kaslarını ve yüzgecini çıkarmak ve vücut boşluğunu açmak için bir mikro iğne kullanılması gerekir. Kalbi atriyumun altından boşluktan nazikçe çıkarmak için forsepsleri kullanın.

Balık bir floresan kardiyak işaretleyici içeriyorsa, diseksiyon için bir floresan dürbünü kullanın ve kalbin floresan ile çıkarıldığını doğrulayın. Kalp boşluktan çıkarıldıktan sonra, kalbi tutmak için forseps ve kalbin dışından ekstra kardiyak olmayan dokuyu ve epikardiyal astarı çıkarmak için bir mikroiğne kullanın. Standart uzunlukta 12 milimetreden daha uzun balıklar için.

Yaylı saplı mikro makas kullanarak üç kesi yapın. İlk önce, solungaçlardan enine bir kesim yapın. İkinci olarak, ön göbekte başka bir enine kesim yapın.

Üçüncüsü, her iki enine kesimi birbirine bağlayan ventral tarafta sagital bir kesim yapın. Keskin forseps kullanarak, vücut boşluğunu açmak ve perikardın gümüşi dokusunu ortaya çıkarmak için göğüs kaslarını ve yüzgeçlerini vücuttan çıkarın. Bu perikardiyal dokuyu çıkarın ve kalp görünür hale gelecektir.

Kalbin üstünde bulunan bulbus arteryoza bağlı arteri kesmek için mikro makas kullanın. Bu arter kesildikten sonra, forsepsin uçlarını atriyumun altına yerleştirin ve kalbi boşluktan çıkarmak için forsepsleri kullanın. Kalple birlikte gelen ekstra doku varsa, daha sonra çıkarılabileceği için sorun değil.

Alternatif olarak, bazı balıklarda, bulbüsü nazikçe dışarı çekerek kalbi çıkarmak mümkündür ve kalbin geri kalanı takip edecektir. Alternatif tekniği kullanıyorsanız, kolayca zarar görebileceğinden, atriyumun konumuna dikkat edin. Kalple birlikte gelen ekstra doku varsa, bu iyidir ve daha sonra temizlenebilir.

Kalp boşluktan çıkarıldıktan sonra, kalbi tutmak için iki forseps kullanın ve kalbi tutmak için fazla dokuyu veya bir çift forseps ve ekstra kardiyak olmayan dokuyu çıkarmak için bir mikroiğne kullanın. Zebra balığı kalbini fotoğraflamak için litre başına 23 gramlık bir besleyici agar petri kabı hazırlayın ve katılaşmış agarı PBS ile kaplayın. Agarda kalbin doğru yöne oturmasını sağlayan bir kuyu yapmak için forseps kullanın.

Bulbüsün ucunu tutarak kalbi PCR tüpünden çıkarın. Forseps ile sıkıca Kalbi agar kabına yerleştirin.

Fotoğraf çekmek için kalbi agarda yönlendirin. Örnek, her resimden sonra mümkün olan tüm yönlere döndürülebilir. Kalpleri fotoğraflamak için baş üstü, ışık ve kısa pozlama sürelerini kullanın.

En iyi fotoğrafı elde etmek için pozlamayı gerektiği gibi kullanarak ışık kalitesinde ayarlamalar yapın. İyi kesilmiş temiz bir kalp örneği burada gösterilmiştir. Her kalbin genel morfolojisinde bazı farklılıklar olacaktır, ancak kalbin gelişmesinden sonra sağlam bir ventrikül atriyumu ve soğanlı arteryoz içeren eksiksiz olması gerekir.

Bu teknik, zebra balığı kardiyak gelişimi alanındaki araştırmacıların, zebra balığı gelişiminin çeşitli aşamalarında kardiyak olgunlaşmayı keşfetmelerinin yolunu açtı.