Meme Kanseri Beyin metastaz tümör Hipoksi Dynamics in vivo Biyoparlaklık Görüntüleme Fare Modeli

Hipoksi indüklenebilir faktör-1α aktivite Biyoparlaklık görüntüleme, bir meme kanseri beyin metastazı fare modeli intrakranial tümör hipoksi gelişimini izlemek için uygulanır.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir fare modelinde ortotopik meme kanseri beyin metastazlarında tümör hipoksi dinamiklerini non-invaziv olarak değerlendirmektir. Bu, meme kanseri MDA MB 2 31 hücrelerinin hipoksi raportör yapısı ile stabil bir şekilde dönüştürülmesiyle elde edilir. Daha sonra, hipoksi raportör yapısının başarılı bir şekilde transfeksiyonunu ve ekspresyonunu sağlamak için in vitro lusiferaz testleri kullanılır.

Daha sonra, intrakraniyal metastazların tümör hipoksisindeki uzunlamasına değişiklikleri izlemek için in vivo biyolüminesans görüntüleme yapılır. Sonuçlar, hipoksi raportör geninin ekspresyon paterninin biyolüminesans görüntülemesine dayalı olarak meme kanseri beyin metastazlarının tümör hipoksisinin başlangıcını ve evrimini göstermektedir. Bu tekniğin EOL oksijen elektrodu gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bu maddenin tamamen noninvaziv olması ve dinamik değişimin uzunlamasına invadan izlenmesine izin vermesidir.

Bu tekniğin etkileri, beyin tümörlerinin tedavisine veya teşhisine kadar uzanır, çünkü tümör hipoksisi, radyasyon gibi geleneksel tedavinin etkinliğini azaltır. Bu nedenle, tümör hipoksisinin derecesini tespit etmek, terapötik müdahalelerin tasarlanmasında yardımcı olacaktır. İlk kültür, MDA MB 2 3 1 5 H-R-E-O-D-D lusiferaz hücreleri, in vitro HIF bir alfa biyolüminesans test plakası için takviye edilmiş DMEM ortamında yeni bir HIF bir alfa bağımlı reporto geni ile stabil bir şekilde transfekte edilmiş bir insan metastatik meme kanseri hücre hattı olan üç kez 10 ila beş MDA MB 2 3 1 5 H-R-E-O-D-D lusiferaz hücreleri, hücreleri bir gece boyunca inkübe eder. doku kültürü inkübatörü, hücrelerin tabağa yapışmasını sağlamak için 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksite ayarlanmıştır.

Ertesi gün. Kültürlerin EVA anormalliğini önlemek için altı kuyucuklu plakadan birini 10 ila 20 mililitre steril su içeren bir tabakla birlikte hipoksi odasına yerleştirin. İkinci plaka, doku kültürü inkübatöründe% 21 oksijende kalır ve normoksi kontrolü olarak görev yapar.

Giriş portu borusunu %0.1 oksijen, %5 karbondioksit ve %94.9 nitrojen içeren bir gaz silindirine bağlayın. Hem giriş hem de görünüm portu kelepçelerini açın ve %0.1'lik bir oksijen konsantrasyonu elde etmek için hipoksi odasını gazlayın. Gaz kaynağını ayırın ve plastik kelepçeleri kapatarak hazneyi kapatın.

Daha sonra odayı 24 saat boyunca doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. 24 saat sonra, biyolüminesans testini gerçekleştirin, önce ortamı her iki altı kuyucuklu plakadan aspire edin ve hücreleri buz gibi soğuk PBS ile iki kez hızlı bir şekilde yıkayın. Ardından, 1 30, 60 ve 180 saniyelik pozlama sürelerine sahip kumpas Enogen spektrumunu kullanarak, lüminesans görüntüleriyle elde edilen 100 mikrolitre Lucifer içeren bir mililitre, revize edilmiş soğuk PBS ekleyin.

Ve intrakraniyal enjeksiyon gününde canlı görüntüleme yazılımı kullanarak her bir kuyucuktaki biyolüminesans yoğunluğunu ölçün, MDA MB 2 3 1 5 H-R-E-O-D-D lusiferaz hücrelerini tripsin ve santrifüjleme ile% 80 birleşimde hasat edin. Peleti taze, orta derecede yeniden askıya alın ve bir hücre sayımı yapın. Hücre süspansiyonunu dört mikrolitrelik bir hacimde 10 ila beş hücrelik bir nihai konsantrasyona seyreltin ve anesteziden sonra yeniden askıya alınan hücreleri buz üzerine yerleştirin.

Oksijenle karıştırılmış %3 buz flor içeren dört ila altı haftalık dişi çıplak fareler. Bir indüksiyon odasında, anesteziyi sürdürmek için% 2 flor uygulayan hayvanı bir burun konisine aktarın, Betadine solüsyonu ve ardından% 70 alkol ile silerek kafa derisini sterilize edin. Daha sonra, keskin bir neşter kullanarak, orta hat kesisi yapın ve kafatasının sağ yarım küresini ortaya çıkarın.

Koronal sütürün bir milimetre önünde ve sagital sütürün iki milimetre yanında olan noktayı belirleyin. Bir milimetrelik bir delik açmak için yüksek hızlı bir matkap kullanın. Bu noktada, dört mikrolitre hücre süspansiyonunu 10 mikrolitrelik bir Hamilton şırıngasına çekin.

32 gauge Hamilton iğnesi ile donatılmıştır. Hamilton şırıngasını kafatasındaki deliğin üzerine yerleştirin. İğnenin ucunu URA malzemesinin bir milimetre altına dikkatlice yerleştirin.

Bu derinliğe ulaşıldığında, hücreleri doğrudan doğru koridora enjekte etmek için şırınganın pistonuna dikkatlice bastırın. D kelon. Hücreler enjekte edildikten sonra yaklaşık 30 saniye bekleyin, ardından iğneyi dikkatlice geri çekin.

Bur deliğini kemikle doldurun, kafa derisini emilebilir dikişlerle kapatın ve bölgeyi %70 alkol ile sterilize edin. Analjezi için ilk buprenorfin enjeksiyonunu uygulayın. Buprenorfin analjezisi iki gün boyunca her 12 saatte bir uygulanır.

Hayvanın anesteziden tamamen kurtulduğundan emin olun. Sonra ev kafesine geri dönün. Hücrelerin intrakraniyal implantasyonundan iki hafta sonra, ivus spektrum sistemini kullanarak uzunlamasına biyolüminesansı başlatın.

Üç fareyi aynı anda% 3 isof, flor ve oksijen ile uyuşturduktan sonra. Boynun ensesinde toplam 80 mikrolitre hacminde kilogram Lucifer başına 120 miligramlık bir çözelti uygulayın. Enjeksiyonun uygulanmasından hemen sonra, bir zamanlayıcıyı beş dakikaya ayarlayın.

Fareleri görüntüleme odasına yerleştirin ve anesteziyi dakikada bir desimetre küp akış hızında %1 isof, flor ve oksijen ile koruyun. Luciferian enjeksiyonu zamanından itibaren beş dakika geçtikten sonra. 1, 30, 60 ve 180 saniyelik pozlama sürelerine sahip biyolüminesans görüntüleri elde edin.

Son görüntüyü yakaladıktan sonra, hayvanları odadan çıkarın ve anesteziden kurtulmaları için ev kafesine geri koyun. Canlı görüntüleme yazılımını kullanarak verileri analiz edin, biyolüminesans sinyalinin ana hatlarını çizmek için manuel olarak bir ilgi alanı çizin ve ardından sinyalin yoğunluğunu ölçmek için saniyedeki mutlak foton sayımlarını kullanın. Biyolüminesans görüntülemeyi sekiz ila 10 hafta boyunca haftada bir kez tekrarlayın.

Ardından, son biyolüminesans görüntüleme seansından hemen sonra, hipoksi belirteci olan piol'ü uygulayın ve fareleri kurban edin. Bir saat sonra, tüm beynin gömmesini çıkardıktan sonra, optimum kesme sıcaklığında, ortam ve eksi 80 santigrat derece dondurucuyu dondurun. Sonraki histolojik krestal menekşe boyama ve lusiferaz hipoksiye karşı immünohistokimyasal boyama.

Görüntüleme gözlemlerini doğrulamak için işaretleyici OLE ve H bir alfa gerçekleştirilir. Bu görüntü, in vitro HIF bir alfa biyolüminesans testinden elde edilen temsili sonuçları göstermektedir. Sağdaki ölçek çubuğu aşağıdan yukarıya doğru gösterilir.

Yalancı renk, artan biyolüminesans ile ilişkili değişir. MDAM 2 3 1 5 HEDD Lucifer hücrelerinin üst iki kuyusu hipoksik koşullar altında muhafaza edildi. Bu video makalesinde açıklanan prosedüre göre, yeşil renk, hipoksik koşullara yanıt olarak HIF bir alfa promotöründen lusiferaz raportörünün artan transkripsiyonunu gösterir.

Alttaki iki kuyu, normoxia altında tutulan ve sadece çok düşük seviyelerde biyolüminesans yayan kontrol kuyularıdır. Bu görüntü, tümör hipoksi dinamiklerinin uzunlamasına in vivo biyolüminesans görüntülemesinin sonuçlarını göstermektedir. Aynı hayvan, M-D-A-M-B 2 31 5 H-R-E-O-D-D lusiferaz hücrelerinin intrakraniyal uygulamasından beş ila 10 hafta sonra haftada bir kez görüntülendi.

Fare beyninin sağ tarafından gelen zayıf bir ışık sinyali ilk kez görselleştirildi. Meme kanseri hücrelerinin intrakraniyal implantasyonundan beş hafta sonra, altı hafta boyunca artmış optik sinyal gözlendi, bu da tümör hipoksisinin arttığını gösteriyor. Bu grafik, altı haftalık görüntüleme boyunca ışık sinyalinin kantitatif foton sayımlarının zaman seyri eğrisini gösterir.

Bu görüntü, hipoksik belirteç pi Monosol al hipoksinin intratümöral heterojenliği ile meme kanseri immünoboyasının metastazı taşıyan donmuş bir fare beyninin 10 mikronluk bir bölümünü göstermektedir, burada anti lusiferaz antikoru ile immünostain ile aynı bölüm belirgindir. Bu bindirme görüntüsü, hipoksinin intratümöral heterojenliğinin, lucifer'in ifadesi ile uzamsal olarak ilişkili olduğunu göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, hipoksi tarafından bildirilen gen HRE görünümüne dayalı olarak intrakraniyal tümör hipoksi dinamiklerini izlemek için biyo biyolüminesans görüntülemenin nasıl uygulanacağını iyi anlamış olmalısınız.