İlköğretim Rat Kortikal Nöronlar ve Glia bilaminar Co-kültür

Bu prosedürün amacı, büyümelerini destekleyen bir glia tabakasının varlığında birincil nöronları kültürlemektir. Bu nöronlar daha sonra analiz için saf bir nöron popülasyonu olarak izole edilebilir. Bu, önce birincil glial hücrelerin kültürlenmesiyle gerçekleştirilir.

İkinci adım, glial hücreleri, kültürlenmiş nöronlara karşı koyacak bir yüzeye alt kültürlemektir. Daha sonra nöronal glial hücre katmanları stabil bir ko-kültür sisteminde birleştirilir. Sonuç olarak, sito kimyasal analiz, saf bir olgun nöron tabakasının gelişimini gösterir.

Merhaba, benim adım Anna T ve Drexel Üniversitesi'ndeki Dr.Olympia Muci laboratuvarında öğrenciyim. Burada, bir glia besleme tabakasının varlığında kortikal nöronlarda nasıl kültür yapılacağını göstereceğiz. Bu, ilk olarak Gary Banker ve meslektaşları tarafından geliştirilen ve Dr. Muci ve Richard Miller'ın Chicago Üniversitesi'ndeki laboratuvarı tarafından öğrenilen ve daha sonra deneysel ihtiyaçlarımıza uyarladığımız bir tekniktir.

Bu tekniğin saf nöronal kültüre göre ana avantajı, glia tarafından salınan trofi faktörlerinin nöronal büyümeyi ve farklılaşmayı desteklemesidir. Nöronlar daha sonra saf bir popülasyon olarak izole edilebilir. Diseksiyona hazırlanmak için steril aletleri% 70 etanole yerleştirin, dört mililitre soğuk diseksiyon, orta ila 60 milimetre tabaklar ekleyin, ardından% 2,5'ini ve DNA'ları buz üzerinde çözün.

İki ila dört günlük yavruların kafasını kestikten sonra, kafaları her kafa için 100 milimetre steril bir tabağa koyun. Kafatasını ortaya çıkarmak için cildi orta çizgide bir kesik yapın ve cildi geri çekin. Ardından, altındaki beyin dokusuna zarar vermeden kafatasında bir orta hat kesimi ve iki yanal kesim yapmak için bir çift kavisli makas kullanın.

Bunu takiben, beyni ortaya çıkarmak için üst kafatasını çıkarın, ardından beyni çıkarın ve daha önce stereo mikroskop altında hazırlanan dört mililitre soğuk diseksiyon ile 60 milimetrelik çanağa yerleştirin. Yarım küreleri ayırın, orta beyni çıkarın ve meninksleri soyun. Diseke edilmiş tüm serebral korteksleri, taze soğuk diseksiyon ortamı ile 60 milimetrelik yeni bir tabakta toplayın.

Sonra dokuyu bir çift kavisli makasla kıyın. Daha sonra kıyma dokusunu 15 mililitrelik steril bir tüpe aktarın. Soğuk diseksiyon ortamı ile hacmi 4,5 mililitreye getirin ve 500 mikrolitre% 2,5 ekleyin.

Daha sonra tüpü para filme sarın ve 15 dakika boyunca 37 santigrat derece su banyosuna koyun. Bu arada, her beş dakikada bir tüpü ters çevirerek karıştırın. Daha sonra, dokuyu 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve tüpe aktarılan tripsy içeren diseksiyon ortamını en aza indirmeye çalışın.

Şimdi son hacmi taze diseksiyon ortamı ile 4.8 mililitreye getirin ve mililitre başına 60 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona 200 mikrolitre DNA ekleyin. Daha sonra steril beş mililitrelik bir pipetle yaklaşık 20 kez hafifçe ezin ve 10 mililitre glio kaplama ortamı ekleyin. Büyük doku parçalarının dibe çökmesi için dört ila beş dakika bekleyin.

Bundan sonra, hücre süspansiyonunun üst% 80'ini 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra doku süresini iki ila üç mililitre GL kaplama ile tekrarlayın. Orta. Yine, dokunun yerleşmesine izin verin.

Daha sonra en üstteki %80'i bir önceki koleksiyona aktarın. Toplam hacmi 20 mililitreye getirin. Daha sonra, 280 kez G'de 15 dakika santrifüjleyin, bundan sonra, supinatı aspire edin ve hücre paletini beş ila yedi mililitre ggl kaplama ortamında yeniden süspanse edin.

Daha sonra, diseke edilen her beyin için orta ila 10 mililitre ek kaplama ekleyin ve hücreleri iyice karıştırın. Her 75 santimetre karelik şişede 10 mililitre hücre süspansiyonu plakası. Bunu takiben, kültür şişesini 37 santigrat derecede inkübe edin.

Kültür ortamını 24 ila 48 saat sonra, ardından Therman lamel fişlerini hazırlamak için her üç ila dört günde bir değiştirin. Plastik örtü kızakları, bir kültür ikincil ggl kullandı, her yıkanmış ve otoklav thermadox'un çevresine üç küçük damla erimiş para plast mumu ekleyin. Hücreler, thermadox'un bu tarafında kaplanacaktır.

Thermon'larımız el yapımı, yeniden kullanılabilir 60 milimetre kesici uçlardır ve yaklaşık 52 milimetre delik açılmıştır. Ticari olarak temin edilebilmesine rağmen, kültür kuyusu ekleri de kullanılabilir. Bir sonraki adım, birincil ggl'yi PBS ile iki kez yıkamaktır.

Bağlanmamış hücreleri çıkarmak için her şişeyi kuvvetlice çalkalayın. Birleştirilmiş birincil ggl'ye sahip her bir şişe yaklaşık 10 milyon astroglia sağlayacaktır. Bu nedenle, deney başına genellikle iki ila dört şişe kullanırız.

Ardından, EDTA'da %0,05'lik açma ile hücreleri ayırın. Hücreleri iki şişeden 50 mililitrelik bir konik tüpte birleştirin ve eşit miktarda ggl kaplama ortamı ekleyin, ardından yerçekiminin 280 katında 15 dakika santrifüjleyin. Supinatı aspire edin ve GL peletlerini birkaç mililitre GL kaplamada çözün. Orta.

Bir hemo sitometre kullanarak hücreleri sayın ve hücre süspansiyonunu gerektiği gibi seyreltin. Daha sonra 500.000 hücreyi ya 60 milimetrelik tabaklara ya da thermon plakası için GL kaplama ortamı kullanarak therman kapak kızaklarına yerleştirin. Her bir kapaktaki 600 mikrolitre hücre damla damla kayar ve iki saat sonra, hücreleri glia kaplama ortamına batırmak için her bir thermadox'u çevirin.

Nöronal örtü fişleri için 60 milimetre sekonder glia tabağı hazırlıyorsanız, nöronal diseksiyondan önceki akşam ortamı ikiye bitecek şekilde değiştirin. Bu prosedürde, 15 milimetrelik cam kapak fişlerini hazırlamak için üç küçük damla erimiş para patlaması ekleyin. Hücre katmanlarını fiziksel olarak ayırmak ve hücre kazıma kaplamasını önlemek için her steril örtü kaymasının çevresine balmumu sürün.

Kapak, tüm 60 milimetrelik tabakları mililitre polilisin başına 0,5 miligram ile iki saat veya gece boyunca kaydırır. Sonra iki ila üç kez steril suyla yıkayın ve tamamen kurumasını bekleyin Nöronal diseksiyonu hazırlamak için. 17 günlük hamile bir sıçanı ötenazi yapın.

% 70 etanol püskürtün ve uterusu ortaya çıkarmak için cildi mediale kesin. Bundan sonra, tüm fetüsleri çıkarın ve 100 milimetrelik steril bir tabağa koyun. Her fetüsü hızlı bir şekilde diseksiyon ve dekapite ettikten sonra, her bir kafayı stereo mikroskop altında dört mililitre soğuk diseksiyon ortamı ile 60 milimetrelik bir tabağa yerleştirin.

Cildi ve kafatasını çekerek açarak, beyni çıkararak, hemisferleri ayırarak ve orta beyin ve meninksleri çıkararak serebral korteksleri izole etmek için bir çift forseps kullanın. Disseke edilmiş tüm korteksleri soğuk diseksiyon ortamı ile 60 milimetrelik taze bir tabakta toplayın. Daha sonra dokuyu bir çift kavisli makasla yaklaşık bir milimetrelik parçalar halinde kıyın.

Kıyma dokusunu 15 mililitrelik steril bir tüpe aktarın. Soğuk diseksiyon ortamı ile hacmi 4,5 mililitreye getirin ve dokuya 500 mikrolitre% 2,5 ekleyin. Bunu takiben.

Tüpü para filme sarın ve 15 dakika boyunca 36 santigrat derece su banyosuna yerleştirin. Bu arada, her beş dakikada bir tüpü ters çevirerek karıştırın. Daha sonra, dokuyu 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve tüpe aktarılan tripsin içeren diseksiyon ortamını en aza indirmeye çalışın.

Taze diseksiyon ortamı ile hacmi 4.8 mililitreye getirin ve mililitre başına 60 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona 200 mikrolitre D Ns ekleyin. Daha sonra steril beş veya iki mililitrelik bir pipetle yaklaşık 10 kez ezin. Bu adımı gerektiği kadar tekrarlayın.

Dokunun çoğunu ayırmak için ateşle parlatılmış bir makarna pipeti kullanarak, kalan doku parçalarının dört ila beş dakika boyunca dibe çökmesine izin verin. Daha sonra, yerleşmiş doku parçalarını geride bırakırken üst tek hücreli süspansiyonu çıkarın. Eşit hacimde nöron kaplama ortamı olan yeni bir tüpe aktarın ve hafifçe karıştırın.

Daha sonra hücreleri bir hemo sitometre kullanarak sayın ve bunları 15 milimetrelik örtü fişlerine 200 mikrolitrede yaklaşık 35.000 hücre veya 60 milimetrelik tabaklarda üç mililitrede yaklaşık 1 milyon hücre olarak plakalayın. Hücreleri inkübasyondan sonra üç ila dört saat boyunca 36.5 santigrat derecede inkübe edin. Nöron katmanını ve nöronlar için ikincil ggl'yi 60 milimetrelik tabaklarda birleştirin.

Hücreleri ılık DMEM ile yıkayın. Ortamı dört mililitre N iki orta olarak değiştirin ve her plakaya ggl ile bir thermon ekleyin. GL, nöronal örtü kaymaları için nöronlara bakarken, nöronlar kaplandıktan 24 saat sonra nöronlar aşağı bakacak şekilde her 60 milimetrelik ikincil ggl çanağına üç ila beş örtü fişi aktarın, burada laminer ko-kültür ile nörogliadan nöronların bir örneği olarak gösterilen glia proliferasyonunu önlemek için her yemeğe 10 mikromolar sitozin Beta D Arab azi ekleyin.

Bu aşamada kaplama işlemleri beş saat sonra uzamaya devam etmektedir. İşte kaplamadan 12 gün sonra neuroglia bi lanar ko-kültüründen bir nöron örneği. Bu aşamada, hücrelerin genişlemiş aksonları ve nitleri açıkça görülebilir.

Nöronlar olgunlaştıkça, dendritik ABA'lar daha ayrıntılı hale gelir ve kaplamadan yaklaşık iki ila üç hafta sonra sinaptik temaslar geliştirir. Bu şekilde gösterildiği gibi birçok dendritik diken görülebilir. Bu tekniği uygularken, hızlı çalışmak ve her bir reaktifin sterilitesini korumak kültürümüzde antibiyotik eksikliğidir.

Ortam, hücreleri kontaminasyona karşı çok hassas hale getirir.