Name: RNAi-aracılı Gene Nakavt ve In Vivo diürez Testi Aedes aegypti Sivrisinekler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Öğrenin, Aedes aegypti sivrisineklerinde RNAi aracılı gen susturma ve in vivo diürez testi yöntemini. Bu teknik, akaporin su kanallarının işlevini incelemek ve sıvı düzenlemesini anlamak için entomoloji araştırmalarında kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar bu protokolün onun eleştirel yorumlar için Victoria Carpenter teşekkür ederim.

Bölüm I - yetişkin Aedes aegypti sivrisinekler RNAi-aracılı gen devirme. Deney genel bakış için Şekil 1'e bakınız. 1. dsRNA Sentezi <ol><li> Ilgi ve kontrol dsRNAs genler karşı spesifik dsRNAs sentezlerler. Not: 3 'özgü cDNA 2 sonu ve 5 de ekli T7 primer sekans ile' de uç (5'-GAC TAA TAC TCA CTA bulunan 300-500 baz çifti aralığında PCR parçaları için gelişmekte olan primerler önermektedir TAG GG-3 '). Parçalarının tekliği BLASTN analizi 3 tarafından teyit edilmelidir. </li><li> DsRNA sentezlemek için transkripsiyon reaksiyonu için T7 RNA polimeraz kullanır Ambion Megascript T7 Yüksek Kapasiteli Transkripsiyon Seti (Ambion, reaktiflerin tablo) kullanın. Not: Benzer reaktifler ve kitler yerde mevcuttur. </li><li> DsRNA arındırmak için, Megascript kiti ile yönergeleri izleyerek lityum klorür ile hızlandırabilir. </li><li> Purificat sonraiyon, steril su içinde dsRNA pelet çözülür. Mikroenjeksiyon için yeterli viskozite sağlamak için, dsRNA konsantrasyonu 2 mg / ml geçmemelidir. </li></ol> 2. Enjeksiyon Hazırlık <ol><li> Basit bir mikro enjektör boruları, makas, metal bir iğne, bir 1 ml şırınga ve 1 ml'lik plastik pipet (bkz. Şekil 2) kullanılarak inşa edilebilir. Boru uzunluğu ~ 40 cm kesilmelidir. Alternatif olarak, bir otomatik mikro enjektör gibi Drummond Nanojet II 4 olarak kullanılabilir. <ol><li> 2 ml ölçek işaretine şırınga ucu (iğne hub) kesin ve piston gelen lastik pistonu kaldırın. </li><li> Lastik pistonu ve yerine geri iğne hub kauçuk piston kafasına metal bir iğne kullanarak Punch bir delik. </li><li> Tüpün her bir ucunda bulunan iğne göbeği yerleştirin ve ağız parçası (alternatif olarak, bir 10 ml sy olarak kullanılacak diğer ucu bir 1 ml plastik bir pipet ucu, yerleştirmekRinge) enjeksiyon için gerekli hava basıncı üretmek için kullanılabilir. </li></ol></li><li> Lastik pistonu deliğe bir cam kılcal iğne yerleştirin ve genişliği sıvı akmaya için yeterince büyük olduğunu bu nedenle iğne ucunu kırın. Not: iğne ucu optimal büyüklüğü ampirik olarak belirlenmelidir - iğne genişliği çok küçük ise iğne genişliği bu travma ve yüksek bir sivrisinek ölüm oranı ile sonuçlanacaktır çok büyük ise, bu nüfuz mümkün olacak sivrisinek dış iskelet. </li><li> Hazırlanan dsRNA numunedeki Submerge enjeksiyon iğne ve ağız parçası (ya da bir şırınga) ile sıvı kadar emerek bir iğne içine sıvı numune çizer. Not: Bu aşama (bkz. aşağıda) in vivo test protokolü diürez içinde kullanılan PBS tamponu, dahil olmak üzere, sivrisinekler içine enjekte edilir tüm sıvı reaktifler için aynıdır. </li></ol> 3. Sivrisinekler toplayın ve uyuştur <ol><li> Collecbir koleksiyon şişeye bir pille çalışan aspiratör ile t sivrisinekler. Toplama flakon üzerinde bir kap koyun ve sivrisinek uyutmak için temiz bir CO 2 ped şişe yerleştirin. Not: Alternatif sivrisinekler buz üzerinde anestezi olabilir. </li></ol> 4. Sivrisinek Enjeksiyon <ol><li> Toplama flakon açın ve doğrudan CO 2 pad üzerinde sivrisinekler yerleştirin ve sivrisinek anestezi kadar bekleyin. </li><li> Bütün erkek atın. </li><li> Enjeksiyon için daha kolay erişim için izin tarafında sivrisinek hizaya. </li><li> Yaralanmayı önlemek için bacak veya kanat tarafından sivrisinekler tut. Ayrıca ince bir fırça veya sivrisinek işlemek için tüy kullanabilirsiniz. </li><li> Ilk sivrisinek enjekte Hazır olduğunda, yavaşça forseps ile toraks bir tarafı desteklemek ve toraksın diğer tarafında (Şekil 2) içine iğne ucu takın. Bu kütikül ince bir bölümünü içine enjekte ve iğne bastırıyor önlemek için daha iyidirtoraks içine derin o. </li><li> Iğne yerleştirildikten sonra, sivrisineğin içine sıvı darbe. İstenen miktar, iğne içindeki sıvının menisküs gözlenerek belirlenebilir. Belirli bir birim için gerekli milimetre numarası cam kılcal iğne (πr 2 saat) ve silindir hesaplayarak hacmi tespit edilebilir. Tipik olarak enjeksiyon için kullanılan dsRNA arasında etkili bir miktarda 1 ug olup. </li><li> Sıvı sivrisinek enjekte edildikten sonra, iğne dikkatli bir şekilde geri çekilmesi. Göğüs dış kısmında büyük bir sıvı damla formları halinde, sivrisinek atılmalıdır. Ardından, sonraki sivrisinek ile bu işlemi tekrarlayın. </li></ol> 5.. Sivrisinek Kurtarma ve Depolama <ol><li> Enjeksiyon sonrası, depolama için bir konteyner içinde sivrisinekler yerleştirin. Örneğin, bir bira bardağı balmumu örgü karton kapak ile emniyete kaplama ile karton bardak (fincan çorba) dizildi. Kapak maruz kapsayan mesh için biçilmiş kaftan bir paya sahiptir. Bir kez tüm mosquitoes kaba konur, kuluçka için çevresel olarak kontrollü bir odaya kap ve bu tür örgü kaplama üstüne yerleştirilir% 20 sukroz batırılmış pamuk topları gibi bir besin kaynağı ile sivrisinekler sağlamaktır. In vivo diürez tayininde gerçekleştirmeden önce, her sivrisinek hidrasyon durumunu standardize etmek için 12 saat için bir su kaynağının dsRNA enjeksiyonlu sivrisinekler mahrum. </li><li> DsRNA-aracılı gen demonte bir verimlilik değişken olabilir. Gen suskunluğu enjeksiyon sonrası 1 gün başlayabilir ve enjeksiyon 4 sonra 6 gün öncesine kadar son verebilir. Maksimum geni elde etmek için portatif Optimal süre kullanılan her gen için deneysel olarak tespit edilmelidir. Biz devam etmeden önce Genel olarak, biz dsRNA enjeksiyonundan sonra 3 gün bekleyin. </li></ol> Bölüm II - vivo diürez deneyde yetişkin Aedes aegypti sivrisinekler Not: Bu protokol yazarlar tarafından geliştirilmiş vesarı humma da sivrisinek aquaporin proteinlerin RNAi aracılı devirme için kullanılan aegypti 1 Aedes. Bireysel sivrisinekler arasındaki değişkenliği önlemek için, sivrisinek gruplar olarak analiz edilmelidir. Teknik nedenlerden dolayı, biz tedavi başına 5 sivrisinek grupları tavsiye - sivrisinekler enjeksiyonundan sonra idrar salgılanmasını başlamadan önce ilk ağırlık ölçümü gerçekleştirmek için zaman sınırlı bir miktarda bulunmaktadır. 6. Sivrisinekler toplayın ve uyuştur <ol><li> Sivrisinekler toplama önce, analitik bir hassas terazi kullanılarak bir kap ile boş bir koleksiyon şişe ağırlığı kaydetmek. Bu, daha sonraki tüm şişeye ölçümler için kullanılacaktır. </li><li> Bir aspiratör ile tartılır toplama şişeye 5 dişi sivrisinekler toplayın. Toplama flakon üzerine kap yerleştirin ve sivrisinek uyutmak için birkaç saniye için CO 2 pad üzerinde bekletin. </li></ol> 7. İlk Ağırlık Ölçüm <ol><li> T alhassas dengesi kapaklı sivrisinekler içeren koleksiyon şişe koyarak 5 sivrisineklerin o başlangıç ​​ağırlığı ölçümü. </li><li> Sivrisineklerin ağırlığı ve kap ile birlikte şişeye toplama alarak ve kap ile boş bir koleksiyon şişeden ağırlığı çıkarılarak 5 sivrisineklerin grubunun kilo hesaplamak. </li><li> Toplama flakon açın ve sivrisinek ağırlığı kaydettikten sonra doğrudan CO 2 pad üzerinde sivrisinekler yerleştirin. Sivrisinekler kilo ölçümleri sırasında uyanmaya başlıyor, bu açılış ve pad üzerine sivrisinekler yerleştirmeden önce birkaç saniye CO 2 ped şişe ayarlayın. </li></ol> 8. Enjeksiyon Hazırlık <ol><li> RNAi-aracılı gen Knockdown protokolü verilen talimatları izleyerek mikro enjektör ayarlayın. </li><li> Mikro enjektör bir cam kılcal iğne yerleştirin ve iğne ucu koptu ve böylece genişlik sıvının yetecek kadar büyükakmasına uid. </li><li> Batmak PBS tamponu iğne ve enjeksiyon iğnesi içine tampon çekmek, bu protokolü kullanmak için istenilen miktarda her sivrisinek için PBS 1.25 ul olduğunu. Not: Bu tutar, bir dişi sivrisineğin 5 tarafından alınır kan plazması ortalama miktarı taklit eder. </li></ol> 9. Sivrisinek Enjeksiyon <ol><li> Mikro enjektör ile daha kolay erişim sağlamak için sivrisinek hizaya. </li><li> Iğne yerleştirildikten sonra, sivrisineğin içine PBS tamponu darbe. </li><li> Sıvı sivrisinek içine enjekte edildiğinde, bir damlacık göğüs dışına oluşturabilir. Bu damlacık dikkatle sonraki adım önce çıkarılması gerekiyor. </li><li> Sonraki sivrisinek bu enjeksiyon işlemi tekrarlayın. Deneyimi ile, sivrisinek yaşama oranı enjeksiyonundan sonra neredeyse% 100 olacaktır. </li></ol> 10. Tartım Sivrisinekler <ol><li> Enjeksiyonundan sonra yavaşça toplama şişe içinde sivrisinekler yerleştirmekve kap. Hassas dengesi kapaklı sivrisinekler içeren koleksiyon şişe koyarak 5 sivrisinek ilk ağırlık ölçümü atın. </li><li> Kapaklı sivrisinekler ve toplama şişeden ağırlığı alarak 5 sivrisineklerin grubu ağırlığı hesaplanabilir ve kap ile boş bir koleksiyon şişeden ağırlığı çıkartılır. Not: sivrisinekler CO 2 anestezi pad çıkarıldıktan sonra 2 dakika içinde idrar salgılamaya başlar, bu yüzden onlar salgılanmasını başlamadan önce kilo ölçümü almak önemlidir. </li><li> Bunlar idrar salgılamaya başlar küçük bir kapta sivrisinek yerleştirin. </li></ol> 11. İkinci ve sonraki Ağırlık Ölçümleri Not: sivrisinek Ağırlık ölçümleri 30 dakikalık aralıklarla alınmalıdır, ama bu atılımı oranlarına bağlı olarak kısa veya daha uzun aralıklarla ayarlanabilir. <ol><li> 30 dakika sonra, grou toplamakkap ile aynı toplama şişeye bir aspiratör ile 5 sivrisinek s. Hassas dengesi kapaklı sivrisinekler içeren koleksiyon şişe yerleştirerek sivrisinek sonraki ağırlık ölçümü alın. </li><li> Ölçümünden sonra, bir sonraki 30 dakika için aynı tutma kabı olarak sivrisinekler yerleştirin. </li><li> Bir zaman istenilen miktar için bu işlemi tekrarlayın. </li></ol> 12. Belirlenmesi Sivrisinek Boşaltım Oranı <ol><li> 5 sivrisineklerin grubu içine enjekte edildi sıvının miktarı hemen enjeksiyonundan sonra ağırlığı sivrisineklerin başlangıç ​​ağırlık çıkarılması ile hesaplanır. </li><li> , Belirli bir zaman noktasında sivrisineklerin grup tarafından salgılanan edildi idrar miktarı belirli bir zaman noktasında sivrisineklerin ağırlığından sivrisineklerin başlangıç ​​ağırlık çıkarılarak hesaplanabilir. </li><li> Belirli bir zaman noktasında atılım hızı divi hesaplanabilirSıvı enjekte edilen (Tablo 1) toplam miktarı, bu zaman noktasında atılır idrar ding miktarı. </li></ol> 13. Temsilcisi Sonuçlar Gen Knockdown RNAi-aracılı ve in vivo diürez tayininde Aedes aegypti sivrisinek diürez su kanallarının etkilerini incelemek amacıyla Hansen laboratuvar tarafından kullanılmıştır. Aedes aegypti Malpighi tüpleri tübüllerinde ifade Üç su kanallarının sivrisinekler 1 kontrole göre atılımı oranları üzerinde önemli etkileri olan nakavt edildi. Şekil 4 diürez testi Aedes aegypti ve Culex quinquefasciatus arasındaki atılımı oranlarını karşılaştırmak için kullanılan bir denemeyi temsilcisi sonuçlarını gösterir farklı sıcaklıklarda. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1.. 10 sivrisinekler ea RNAi / diürez testinin Akış Şeması. 5 grupch belirli bir gen için dsRNA ile enjekte edilir ve on sivrisinek başka beş gruba kontrolü dsRNA ile enjekte edilir. PBS ile 200 uM HgCl 2 enjekte sivrisineklerin başka bir grubu, bir pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Bunlar, sivrisinekler enjeksiyon öncesinde ve 3 saat boyunca otuz dakikalık aralıklarla enjeksiyonundan sonra tartılır. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. RNAi-aracılı gen demonte ve in vivo diürez deneyde basit bir mikro püskürtme cihazı. A. Cam kılcal iğneler enjeksiyon için kullanılır. Gri üçgen sivrisinek içine sıvı enjekte miktarını belirtmek için iğne çizilen milimetre artışlarla temsil eder. B. 1 ml şırınga mikro enjektör oluşturmak için kullanılır. Beyaz üçgen iğne merkezi temsil eder ve siyah üçgen şırınga içinde piston bağlı lastik piston başını temsil eder. C. hortuma ağızlığın bağlamak için kullanılmaktadırenjektör. Mikroenjeksiyon cihazın ağızlık olarak kullanılır D. 1 ml pipet ucu (mavi ucu). E. AD parçaları birleştirir mikroenjeksiyon aygıtı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3479/3479fig2large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Optimal sivrisinek enjeksiyon yerinde. A. Kadın Aedes aegypti sivrisinek göğüs büyük ölçekler arasında bir cam kılcal iğne ile enjekte. Siyah çubuk boyutu karşılaştırma için 1 mm gösterir. Dişi sivrisineğin toraks bir çizim B. ve beyaz noktalar sivrisinek Exoskeleton beyaz ölçekleri temsil eder. Enjeksiyon iğnesi delip noktalar arasında sivrisinek enjeksiyon sırasında ölüm oranını minimize etmek gerekir. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. Tempera EtkileriCulex quinquefasciatus ve Aedes aegypti diürez üzerine Ture. diürez assay farklı sıcaklıklarda, sivrisinekler, Aedes aegypti ve Culex quinquefasciatus iki türü ile gerçekleştirildi. Enjeksiyon sonrası ilk bir saat içinde atılım oranı yüzde olarak verilmiştir. <table border="1"><tbody><tr><td> Grup </td><td> TARA (G) </td><td> enjekte değil (G) </td><td> enjeksiyon sonrası (G) </td><td> 1s sonrası enjeksiyon (G) </td><td> ortalama ağırlığı (mg) </td><td> miktarda enjekte (Ul) </td><td> miktarda atılır (Ul) </td><td> % Atılır </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 7.5938 </td><td> 7.6057 </td><td> 7.6104 </td><td> 7.6096 </td><td> 2.38 </td><td> 0.94 </td><td> 0.16 </td><td> 17.0 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 7.8252 </td><td> 7.8349 </td><td> 7.8415 </td><td> 7.8403 </td><td> 1.94 </td><td> 1.32 </td><td> 0.24 </td><td> 18.2 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 7.8896 </td><td> 7.9026 </td><td> 7.9077 </td><td> 7.906 </td><td> 2.6 </td><td> 1.02 </td><td> 0.34 </td><td> 33.3 </td></tr></tbody></table> In vivo diürez test sonuçları Tablo 1. Aedes aegypti. 4 de Aedes aegypti dişi sivrisinekler ile yapılan in vivo diürez tayininde ° C den Ham veri

<ol><li>Drake, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Aquaporin+gene+family+of+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The Aquaporin gene family of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> PloS one. 5, e15578(2010).</li>
<li>Shepard, A. R., Jacobson, N., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+quantitative+PCR+primer+location+for+short+interfering+RNA+efficacy+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Importance of quantitative PCR primer location for short interfering RNA efficacy determination.</a> Analytical biochemistry. 344, 287-288 (2005).</li>
<li>Altschul, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gapped+BLAST+and+PSI-BLAST%3A+a+new+generation+of+protein+database+search+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.</a> Nucleic acids research. 25, 3389-3402 (1997).</li>
<li>Garver, L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+RNAi+Assays+in+Adult+Mosquitoes+%28A.+gambiae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae).</a> J. Vis. Exp. (5), e230(2007).</li>
<li>Clements, A. N. Volume 1 Development, Nutrition, and Reproduction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClements%2C+AN+%22The+Biology+of+Mosquitoes%22">The Biology of Mosquitoes</a>. 2, Chapman & Hall. London. (1992).</li>
<li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+of+rapamycin-mediated+amino+acid+signaling+in+mosquito+anautogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10626-10631 (2004).</li>
<li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+of+rapamycin-dependent+activation+of+S6+kinase+is+a+central+step+in+the+transduction+of+nutritional+signals+during+egg+development+in+a+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 20565-20572 (2005).</li>
<li>Pannabecker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+the+Malpighian+Tubule%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+entomology%22%5BJournal%5D)">Physiology of the Malpighian Tubule.</a> Annual review of entomology. 40, 493-510 (1995).</li>
<li>Dow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+Malpighian+tubule+function+from+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Phys+A%22%5BJournal%5D)">New insights into Malpighian tubule function from functional genomics.</a> Comp Biochem Phys A. 150, S135(2008).</li>
<li>Dow, J. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+Malpighian+tubule+from+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Insights into the Malpighian tubule from functional genomics.</a> Journal of Experimental Biology. 212, 435-445 (2009).</li>
<li>Lawson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VectorBase%3A+a+data+resource+for+invertebrate+vector+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">VectorBase: a data resource for invertebrate vector genomics.</a> Nucleic acids research. 37, 583-587 (2009).</li>
<li>Beyenbach, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+mechanisms+of+diuresis+in+Malpighian+tubules+of+insects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transport mechanisms of diuresis in Malpighian tubules of insects.</a> J. Exp. Biol. 206 (Pt 21), 3845-3856 (2003).</li>
<li>Coast, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+recording+of+excretory+water+loss+from+Musca+domestica+using+a+flow-through+humidity+meter%3A+hormonal+control+of+diuresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+insect+physiology%22%5BJournal%5D)">Continuous recording of excretory water loss from Musca domestica using a flow-through humidity meter: hormonal control of diuresis.</a> Journal of insect physiology. 50, 455-468 (2004).</li>
<li>Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+Aedes+aegypti+%28L.%29+leucokinin+receptor+is+critical+for+in+vivo+fluid+excretion+post+blood+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding.</a> FEBS letters. 585, 3507-3512 (2011).</li>
<li>Hays, A. R., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+protein+produced+by+the+vitellogenic+fat+body+and+accumulated+in+mosquito+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">A novel protein produced by the vitellogenic fat body and accumulated in mosquito oocytes.</a> Development Genes and Evolution. 199, 114-121 (1990).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Kullanılan RNAi protokolü California Riverside 6,7 Üniversitesi&#39;nde Alexander Raikhel laboratuvarında geliştirilen ve Garver ve Dimopoulos 4 tarafından yayınlanan bir protokol benzer olmuştur. Bu video protokolü gösterildiği deneysel yaklaşım in vivo ortamda bir böcek diürez ilgili genler incelemek için kullanılabilir. Böcekler, Malpighi tüpleri tübüller, ve boşaltım organları diürez için &#39;basit&#39; bir model sistem olarak araştırmacıların nesillerin ilgi çekmiştir. Bu organ D...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif ya da ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 Yüksek Kapasiteli Kiti </td><td> Ambion, Inc </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> PBS tamponu </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> Plastik boru </td><td> Yerel satıcı </td><td></td><td> PVC </td></tr><tr><td> 1 ml plastik pipet </td><td> VWR </td><td> 83007-376 </td><td> Mavi ucu </td></tr><tr><td> 1 ml şırınga </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 309602 </td><td></td></tr><tr><td> Makas </td><td> Yerel satıcı </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Metal iğne </td><td> Carolina Biologicals </td><td> 654307 </td&gt; <td> Boyut 5 </td></tr><tr><td> Pad Fly </td><td> Genesee Bilimsel </td><td> 789060 </td><td></td></tr><tr><td> Pille aspiratör w / tahsilat flakon </td><td> UPMA Labs </td><td> ESYM 2000 </td><td></td></tr><tr><td> İnce uçlu forseps </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 14095 </td><td></td></tr><tr><td> Cam kılcal iğneler </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 1B200-6 </td><td></td></tr><tr><td> Stereo diseksiyon mikroskobu </td><td> Leica Microsystems </td><td> S6D </td><td></td></tr><tr><td> Analitik hassas denge </td><td> Mettler Toledo </td><td> AB54S </td><td></td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 84097 </td><td></td></tr><tr><td> Bir bardak bira kaplı karton bardak mumlu </td><td> Yerel satıcı </td><td></td><td> Üretici çorba bardak </td></tr><tr><td> Mesh net </td><td> Yerel satıcı </td><td></td><td> plastik sinek gazlı bez </td></tr></tbody></table>

rnai-aracılı gene nakavt ve<em&gt; in vivo</emyetişkin kadınlar&gt; diürez testi<em&gt; aedes aegypti</em&gt; sivrisinekler

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

Bu video protokolü bir böcek belirli bir gen devirme ve atılım hızı ölçmek için yeni bir biyoassay yapmak için etkili bir teknik gösterilmiştir. Bu yöntem, böceklerin diürez işlemi daha iyi anlaşılmasını sağlamak için kullanılan ve tek bir kan unu sıvı büyük miktarlarda kadar alabilmesi için olan bir kan-besleme eklem bacaklıların in diürez çalışmada özellikle yararlıdır edilebilir. In vivo diürez tayininde birlikte bu RNAi-aracılı gen Knockdown Aedes aegypti sivrisinek diürez 1 aquaporin genlerin RNAi aracılı Knockdown etkilerini incelemek için Hansen laboratuar tarafından geliştirilmiştir. Protokol iki bölüm halinde kurulum: ilk gösteri basit bir sivrisinek enjeksiyon cihazı nasıl oluşturacağını ve RNAi-aracılı gen devirme için sivrisinek toraks içine dsRNA hazırlamak ve enjekte nasıl göstermektedir. İkinci gösteri nasıl belirleneceği gösterilmektedirin vivo biyoassay bir kullanarak sivrisinekler atılımı oranları.

Bu protokolü biz bir ile RNAi-aracılı gen susturulması birleştirmek<em&gt; In vivo</emIlgi genlerin etkilerini demonte çalışma&gt; diürez testi sivrisinek sıvı atılımı vardır.

RNAi-aracılı Gene Nakavt ve<em&gt; In Vivo</emYetişkin Kadınlar&gt; diürez Testi<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Sivrisinekler

Bu video protokolü, bir böcekte belirli bir geni susturmak (knockdown) ve boşaltımı ölçmek için yeni bir biyolojik analiz gerçekleştirmek adına etkili bir tekniği göstermektedir...

Bu video protokolü, bir böcekte belirli bir geni susturmak (knock down) ve boşaltım hızını ölçmek için yeni bir biyolojik analiz gerçekleştirmek adına etkili bir tekniği göstermektedir. Bugün uygulamalı olarak göstereceğimiz teknik, RNAi aracılı gen susturma ile in vivo diürez analizini birleştirmektedir. Bu yöntem, farklı türlerde diürezi incelemek için kullanılabilir; biz bu tekniği aslında iki farklı sivrisinek türünde aquaporin su kanallarının işlevini incelemek için geliştirdik.Bugün sunacağım protokol iki bölümden oluşmaktadır. İlk gösterimde, basit bir sivrisinek enjeksiyon cihazının nasıl kurulacağı ile RNA aracılı gen susturma işlemi için çift zincirli RNA'nın nasıl hazırlanacağı ve sivrisinek göğüs boşluğuna nasıl enjekte edileceği örneklendirilmektedir. İkinci gösterimde ise, RNAi aracılı gen susturmanın ilk adımı olarak, in vivo bir biyolojik analiz kullanarak sivrisineklerdeki boşaltım hızlarının nasıl ölçüleceği örneklendirilmektedir. İlgilenilen genlere karşı spesifik çift zincirli RNA'lar ve kontrol çift zincirli RNA'lar sentezlenir. Gerekecek ek ekipman ve malzemeler arasında sivrisinek toplamak için toplama tüplü bir aspiratör yer almaktadır.İnce uçlu pens, CO2 gaz tüpüne bağlı CO2 sinek pedi, sinek pedini temizlemek için etanol, ışık kaynaklı stereo mikroskop ve gerekirse iğne çekici. Bir milimetrelik işaretli artışlara sahip cam kılcal iğneler, sivrisinekleri enjekte etmek için bir mikro enjektör, enjeksiyondan sonra sivrisineklerin yerleştirileceği bir kap ve enjeksiyon sonrası sivrisinekler için %20 sükroz emdirilmiş pamuk topu veya suya batırılmış kuru üzüm gibi bir besin kaynağı. Basit bir mikro enjektör, makas kullanılarak yapılabilir.Metal bir iğne, cam bir kapiler, bir mililitrelik bir şırınga, bir mililitrelik plastik pipet ucu ve yaklaşık 40 santimetre uzunluğunda kesilmiş boru. Şırınga iğne göbeğinin ucu 0,2 mililitre ölçek işaretinden kesilir ve kauçuk piston başı çıkarılır. Piston başına delik açmak için metal bir iğne kullanılır.Cam bir kılcal boru deliğe yerleştirilir ve başlık şırıngaya geri takılır. Ardından şırınganın ucu tüpün bir ucuna, bir mililitrelik plastik pipet ucu ise diğer ucuna yerleştirilir. Bu uç, ağızlık olarak kullanılacaktır.Alternatif olarak, enjeksiyon için gerekli hava basıncını oluşturmak amacıyla 10 mililitrelik bir şırınga kullanılabilir. Ardından, kauçuk piston başındaki deliğe cam bir kapiler iğne yerleştirin ve sıvının akabileceği kadar geniş bir açıklık oluşturmak için iğnenin ucunu kırın. Enjeksiyon iğnesini hazırlanmış D-S-R-N-A örneğine daldırın ve bir ağızlık veya şırınga yardımıyla sıvıyı çekerek sıvı örneği enjeksiyon iğnesinin içine alın.Sivrisinekleri pilli bir aspiratör yardımıyla bir toplama tüpüne toplayın. Tüpün üzerine bir kapak kapatın ve sivrisinekleri anesteziye almak için tüpü temiz bir CO2 pedinin üzerine yerleştirin. Alternatif olarak, sivrisinekler buz üzerinde de anesteziye alınabilir.Enjeksiyon işlemine başlamadan önce tüm erkekleri ayırın. Bunlar, bir tüy veya resim fırçası kullanılarak CO2 pedi üzerinde yönlendirilebilir. Yaralanmaları önlemek için sivrisinekleri forseps ile bacaklarından veya kanatlarından tutun.İlk sivrisineğe enjeksiyon yapmaya hazır olduğunuzda, pens ile toraksın bir yanını nazikçe destekleyin ve iğnenin ucunu toraksın diğer yanından yerleştirin. Kütikülün ince bir kısmına enjeksiyon yapmak ve iğneyi toraksın içine çok derin itmekten kaçınmak daha uygundur. İğne yerleştiğinde, sıvıyı sivrisineğe püskürtün.Çift zincirli RNA hemolenf içinde dağılır ve hücreler tarafından alınarak hedeflenen genlerin RNAi aracılı susturulmasını tetikler. Enjeksiyondan sonra sivrisinekler, saklama için bir kaba yerleştirilir.Örneğin, tek pintlik balmumu hatlı, karton kapakla sabitlenmiş ağ kaplı karton bardak kullanılabilir. Tüm sivrisinekler kaba yerleştirildikten sonra, kap inkübasyon için çevre kontrollü bir hazneye yerleştirilmeli ve sivrisineklere nesiller boyunca besin kaynağı olarak ağ örtüsünün üzerine yerleştirilmiş sabunlu %20 sukroz yüklü pamuk topları sağlanmalıdır. Böcek diürezi, günümüzde bu çalışmaları yürütmek için basit bir model sistem olarak araştırmacıların ilgisini çekmektedir.RNAi gibi teknikler, diürezin moleküler düzeyde incelenmesi için kullanılabilir. Bu videoda gösterilen teknikler, in vivo diürez çalışmaları için basit bir yöntem sunacaktır. Dişi sivrisinekler, PBS tamponu enjeksiyonundan sonra iki dakika içinde idrar boşaltmaya başlarlar, bu nedenle boşaltım başlamadan önce ağırlık ölçümlerinin yapılması önemlidir.Bu protokolün ikinci bölümünde, Jedi sivrisineklerinde in vivo diürez deneyi nasıl gerçekleştirilir göstereceğim. Nakavt (knockdown) protokolünde gerekli olmayan ancak bu protokolde ihtiyaç duyulacak ek materyal ve ekipmanlar; RPBS tampon çözeltisi ve ağırlık ölçümleri için analitik hassas terazi olup, terazinin 10 miligram hassasiyete sahip olması gerekir. Sivrisineklerin toplanmasından önce, kapaklı boş bir toplama tüpünün ağırlığını analitik hassas terazi kullanarak kaydedin. Bu tüp, sonraki tüm ölçümler için kullanılacaktır.Sivrisineklerin bulunduğu flakonu kapağı kapalı halde hassas teraziye yerleştirerek beş dişinin başlangıç ağırlık ölçümünü yapın. Beş dişi sivrisineği anestezi altına aldıktan sonra, mikro enjektör ile daha kolay erişim sağlamak için onları CO2 pedine yan yana dizmelisiniz. İğne toraksa yerleştirildiğinde, sivrisineğin içine PBS tamponu üfleyeceksiniz.Enjeksiyondan sonra, sivrisinekleri nazikçe toplama tüpüne yerleştirin ve kapağını kapatın. Kapaklı saha toplama tüpünü hassas teraziye yerleştirerek, enjekte edilen beş sivrisineğin ilk ağırlık ölçümünü yapın. Beş sivrisinekten oluşan grubun ağırlığı, kapaklı saha toplama tüpünün ağırlığından, kapaklı boş toplama tüpünün ağırlığı çıkarılarak hesaplanabilir.Sivrisineklerin ölçümleri 30 dakikalık aralıklarla yapılmalıdır, ancak bu süre boşaltım hızlarına bağlı olarak daha kısa veya daha uzun aralıklara göre ayarlanabilir. 30 dakika sonra, beş sivrisinekten oluşan grubu bir aspiratör yardımıyla kapaklı aynı toplama tüpüne alın. Ardından, kapaklı saha toplama tüpünü hassas teraziye yerleştirerek bir sonraki ağırlık ölçümünü gerçekleştirin.Diürez analizi, iki farklı sivrisinek türü olan ADA aegypti ve kyx kti kullanılarak farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilmiştir. Enjeksiyondan sonraki ilk saatteki boşaltım oranı yüzde olarak verilmiştir. Grafik, sıcaklık arttıkça diürezde güçlü bir artış olduğunu göstermektedir.Ayrıca, iki sivrisinek türü arasında boşaltım hızlarında bir fark gözlemledik. Burada sunulan in vivo diürez analizinin gelecekte çok geniş bir uygulama alanı vardır. RNAI gibi ters genetik yöntemlerin yanı sıra, örneğin sinyal iletim inhibitörleri gibi ilaçların böcek diürezi üzerindeki etkilerini incelemek için de kullanılabilir.Ayrıca, hedef örneklerde ksenobiyotik temizlenme sürecini incelemek için güçlü bir analiz yöntemidir.

rnai-mediated-gene-knockdown-vivo-diuresis-assay-adult-female-aedes

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Ters genetik yaklaşımlar sivrisinek vektör patojenler için hangi genlerin altta ya direncini belirlemek için son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu video protokolü James laboratuar tarafından dsRNA kadın dang virüs limanı A. aegypti sivrisinek, içine enjekte etmek için kullanılan bir yöntem gösteriyor. , Enjeksiyon iğneleri kalibre, enjeksiyon kurulum manipüle ve toraks içine enjekte dsRNA tekniği gösterilmiştir.

Bayan A. aegypti Sivrisinek içine dsRNA enjeksiyon

Ters genetik yaklaşımlar sivrisinek vektör patojenler için hangi genlerin altta ya direncini belirlemek için son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu video protokolü Dimopoulos laboratuar tarafından dsRNA Anofel gambiae sivrisinekler, sıtma paraziti limanın içine enjekte etmek için kullanılan bir yöntem gösteriyor. Enjeksiyon kurulum ve toraks içine enjekte dsRNA manipüle tekniği gösterilmiştir.

Yetişkin Sivrisinekler (A. gambiae) RNAi Tahliller için protokol

RNA-Seq analizleri, model olmayan organizmalarda adaptif özelliklerin moleküler temellerini belirlemek için giderek daha önemli hale geliyor. Burada, diyapoz ve diyapoz olmayan Aedes albopictus sivrisinekleri arasında diferansiyel olarak ifade edilen genleri tanımlamak için bir protokol, sivrisinek yetiştiriciliğinden RNA dizilimine ve RNA-Seq verilerinin biyoinformatik analizlerine kadar açıklanmaktadır.

Asya Tiger Sivrisinek içinde Photoperiodic Diapause RNA-seq Analizler Deneysel ve Biyoinformatik Protokolü, Aedes albopictus

Burada larvaları tarafından sindirilen RNA nano-tanecikleri / kitosan kullanımı yoluyla hastalık taşıyıcıları sivrisinek gen fonksiyonunun inhibe edilmesine müdahale için bir prosedür tarif eder.

Hastalık Vektör Sivrisinek Larva içinde Kitosan / Müdahale RNA Nanopartikül Aracılı gen susturma

RNA girişimi (RNAi), gen fonksiyonunu ortaya çıkarmak için son derece değerli bir araçtır. Bununla birlikte, yetişkinlik öncesi aşamalarda RNAi kullanarak genleri hedefleme yeteneği, başlıca insan sıtma vektörü Anopheles gambiae'de sınırlıdır. Pupa gelişimi sırasında doğrudan enjeksiyon yoluyla gen fonksiyonunu azaltmak için bir RNAi protokolü tanımladık.

içine RNAi Tetik Teslimat<em&gt; Anofel gambiae</em&gt; Pupa

Burada, laboratuarda bir ara-germ böceği, Dermestes maculatus (D. maculatus) yetiştirme için protokolleri sunuyoruz. Biz de bu türün gen fonksiyonunu incelemek için embriyonik fenotipleri analiz etmek için embriyonik ve ebeveyn RNAi için protokolleri ve yöntemleri paylaşır.

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı, Dermestes maculatus

Arızalı rekombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) vivo iletim sistemi geliştirmek için yapay bir intronic küçük RNA ifade strateji kullanarak rapor. İnşaat, ambalaj ve larva enfeksiyon gelince de rAaeDV vektörlerin kantitatif analiz için detaylı bir yordam açıklanır.

Sivrisinek larva genlerin fonksiyonel analiz için bir gen teslim vektör olarak rekombinant sivrisinek Densovirus kullanın

Bu iletişim kuralı biz standart ve birkaç yıl boyunca belirli miktarda nükleik asitler, sivrisinekler ve evi sinekler hemolymph doğrudan teslim etmek için kullanılan bir mikroenjeksiyon metodoloji açıklar. Bu iletişim kuralı en az enjeksiyon mortalite sonuçları ve ilişkili doz ölçümleri verimlilik sağlar.

Tekrarlanabilir dsRNA mikroenjeksiyon ve Oviposition Bioassay sivrisinekler ve evi sinekler

Biz sipariş Odonata (yusufçuk ve damselflies) mavi kuyruklu damselfly kullanarak(Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) ve pied skimmer yusufçuk(Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera) kullanarak sipariş Odonata böceklerde elektroporasyon aracılı RNA girişim için ayrıntılı bir protokol sağlar.

Odonata'da Elektroporasyon aracılı RNA Girişim Yöntemi

Caenorhabditis elegans'ta rutin olarak kullanılan RNA girişimi (RNAi) için bir dağıtım yöntemi olan bakteriler tarafından üretilen dsRNA'nın oral yoldan uygulanması, burada yetişkin sivrisineklere başarıyla uygulanmıştır. Yöntemimiz, enjeksiyon kullanmadan sağlam ters genetik çalışmalarına ve iletimi engelleyen vektör çalışmalarına izin verir.

Yetişkin Anofeller gambiae Sivrisineklerine Etkili Oral RNA İnferferi (RNAi) Uygulaması

Öğrenin, Aedes aegypti sivrisineklerinde RNAi aracılı gen susturma ve in vivo diürez testi yöntemini. Bu teknik, akaporin su kanallarının işlevini incelemek ve sıvı düzenlemesini anlamak için entomoloji araştırmalarında kullanılır.

RNAi-aracılı Gene Nakavt ve

Daha fazla video keşfet