3D Fibrin hazırlanması Kök Hücre Kültürü Uygulamaları için iskeleleri

Bu prosedürün genel amacı, embriyonik ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler dahil olmak üzere pluripotent kök hücrelerin kültürlenmesi ve ayırt edilmesi için 3D fibrin iskeleleri hazırlamaktır. Bu, önce fibrinojen çözeltileri yaparak ve polimerizasyonu inhibe eden molekülleri uzaklaştırmak için gece boyunca diyalize edilerek gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğunda bir alt taban fibrin tabakasını polimerize etmektir.

İşlemin üçüncü adımı tohum atmaktır. Tek embriyo gövdesi, pluripotent kök hücrelerden iskelenin taban tabakasına türetilir, ardından tam kapsülleme için ikinci fibrin tabakası eklenir. Prosedürün son adımı, uygun hücre kültürü ortamının iskelelere eklenmesidir.

Uygulamaya bağlı olarak, pluripotent kök hücrelerden elde edilen embriyo cisimciklerinin 3D fibrin, biyomateryal bazlı iskeleler içinde başarılı bir şekilde kültürlenebileceğini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin geleneksel 2D hücre kültürü yöntemlerine göre en büyük avantajı, kök hücre davranışını üç boyutta gözlemleyebilmeniz ve manipüle edebilmenizdir. Bu yöntem, kök hücre davranışını etkileyen kimyasal bileşikler ve büyüme faktörleri gibi faktörleri tarayarak kök hücre biyolojisi ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir 3D mikro ortamda, Fibrinojen kandan elde edilen bir proteindir ve bu nedenle kullanımdan önce uygun güvenlik eğitiminin tamamlanması gerekir.

Başlamak için, liyofilize fibrinojeni buzdolabından çıkarın ve oda sıcaklığına gelmesi için 20 dakika bekletin, her 35 milimetrelik Petri kabına üç mililitre tris tamponlu salin ekleyin. Yaklaşık 100 ila 130 miligram fibrinojen tartın ve her tabakta TBS'nin yüzeyine serpin. Fibrinojenin çözeltiye girmeye başlaması için beş dakika bekleyin.

Ardından Petri kabını bir kapakla örtün. Fibrinojenin tamamen çözeltiye girmesini sağlamak için Petri kaplarını 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin. Daha sonra TBS ile ıslak diyaliz tüpü, tüpün alt ucunu katlayın ve ucunu diyaliz kelepçeleri ile kapatın, fibrinojen solüsyonunu bulaşıklardan diyaliz tüpüne pipetleyin.

Ardından üst ucunu katlayın ve bir diyaliz kelepçesi ile kelepçeleyerek kapatın. Fibrinojen çözeltisi içeren diyaliz tüpünü dört litrelik bir TBS kabına yerleştirin. Çözeltiyi karıştırın.

Düşük hıza ayarlanmış bir karıştırma plakası kullanarak, çözeltiyi gece boyunca plaka üzerinde en az 12 saat diyalize edin. T Bs solüsyonunun bu süre zarfında steril bir doku kültürü başlığı altında değiştirilmesine gerek yoktur. Fibrinojen solüsyonunu diyaliz tüpünden çıkarın ve konik bir tüpe yerleştirin.

Solüsyondaki büyük safsızlıkları gidermek için fibrinojen solüsyonunu beş mikronluk bir şırınga filtresi ile filtreleyin. Daha sonra, filtrelemek için 22 mikronluk bir nokta filtre kullanın, fibrinojen çözeltisini 50 mililitrelik konik bir tüpe sterilize edin. Toplam hacmi belirledikten sonra, fibrinojen çözeltisinin emilimini 280 nanometrede ölçün, birinin altında bir emilim elde etmek için genellikle 50'lik bir seyreltme faktörü gereklidir.

Fibrinojen çözeltisinde bulunan protein konsantrasyonunu, mililitre başına miligram cinsinden fibrinojen konsantrasyonunun, 1.55'e bölünen iki 80 kat seyreltme faktörüne eşit olduğu aşağıdaki denklemi kullanarak hesaplayın, burada 1.55, insan fibrinojeni için iki 80'de yok olma katsayısıdır. Daha sonra, çözeltinin konsantrasyonunu başlangıç hacmine bağlı olarak mililitre fibrinojen başına 11.1 miligrama seyreltmek için gereken TBS miktarını hesaplayın. Fibrin iskelelerindeki nihai protein konsantrasyonu mililitre başına 10 miligram olacaktır.

Polimerizasyondan sonra, 24 oyuklu plakanın ilk sırasındaki her bir oyuğun sağ tarafına mililitre başına 40 birim trombin çözeltisinden 15 mikrolitre ekleyin, ardından her birinin sol tarafına 15 mikrolitre 50 milimolar kalsiyum klorür çözeltisi ekleyin. Son olarak, plakaya 270 mikrolitre fibrinojen çözeltisi ekleyin. Çözeltileri karıştırmak için plakayı bir yandan diğer yana ve arkadan öne doğru sallayın.

Karışımları içeren sıranın beş dakika polimerize olmasına izin verin Oda sıcaklığında, iskeleler polimerleştikçe daha opak hale gelir, istenen sayıda fibrin iskelesi elde edilene kadar polimerize fibrinojen sıralarını birer birer yapmaya devam edin. Son beş dakikalık inkübasyondan sonra, iskeleleri tamamen polimerize etmek için plakaları bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir saatlik inkübasyon tamamlandığında.

Tek bir embriyo gövdesi seçmek ve fibrin iskelesinin ortasına yerleştirmek için 20 mikrolitrelik bir pipet adam kullanarak iskeleyi tohumlayın. Her kuyucuğun tek bir embriyo gövdesi içerdiğini mikroskopla kontrol edin. Her embriyo gövdesinin üzerine beş mikrolitre trombin çözeltisi ve beş mikrolitre 50 milimolar kalsiyum klorür çözeltisi ekleyin, ardından her oyuğa 90 mikrolitre fibrinojen çözeltisi ekleyin, çözelti embriyo gövdesini kapsülleyen bir kabarcık oluşturmalıdır.

İnkübasyondan sonra polimerizasyonu sağlamak için plakayı 37 santigrat derecede bir saat daha inkübe edin, her oyuğa uygun hücre kültürü ortamından bir mililitre ekleyin ve plakayı tekrar 37 Santigrat derece inkübatöre yerleştirin. Burada, fare embriyonik fibroblast besleyici katmanları üzerinde kültürlenen fare kaynaklı pluripotent kök hücrelerin temsili görüntüleri gösterilmektedir. Sekiz günlük bir retinoik asit tedavi protokolü kullanılarak, hücreler, burada gösterildiği gibi nöral progenitörler içeren hücre kümeleri olan embriyo gövdeleri oluşturmak üzere indüklenir.

Bu şekil, 3D fibrin iskeleleri içinde üç günlük kültürden sonra IPS'den türetilmiş bir embriyo gövdesinin görünümünü göstermektedir. Daha önce fare embriyonik kök hücreleri kullanılarak benzer sonuçlar elde edilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, bu iki günlük süreci kullanarak embriyo cisimlerini 3D fibrin iskelelerine nasıl tohumlayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.

Fibrinojen ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken kişisel koruyucu giysiler giymek ve uygun atık bertarafı da dahil olmak üzere uygun önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.