Yetişkin Zebra balığı Myokard İnfarktüsü İndüksiyon Cryoinjury kullanma

İnsanların aksine, zebra balığı yaralanmadan sonra kalplerini yenileyebilir. Aşağıdaki deneyin genel amacı, miyokard enfarktüsüne yanıt olarak zebra balığı kalbinin yenilenmesini karakterize etmektir. Bu, belirli bir iyileşme periyodundan sonra ventrikülün yaklaşık% 20'sini yok eden ağlama yaralanması adı verilen bir teknik kullanılarak kalp enfarktüslerini indükleyerek gerçekleştirilir.

Kalpler toplanır ve sabitlenir ve farklı zaman noktalarında kardiyak rejenerasyonun ilerlemesi değerlendirilir. Daha sonra, sabit kalpler, aynı numunenin farklı analizlerini yapmak için kopyalar halinde bölümlere ayrılır, histolojik, boyama, yerinde hibridizasyon ve immünofloresan kullanılarak rejeneratif sürecin çeşitli hücresel ve moleküler yönlerini gösteren sonuçlar elde edilir. Zebra balıklarında mevcut yöntemlerimizin yeniden yaralanma tekniğinin ana avantajı, ventriküler apeksin kısmi amputasyonu gibi, miyokardın büyük bir bölümünde geniş hücre ölümüne neden olmasıdır.

Aslında, hızlı serbest depolama dokusu, insanlarda gözlenen iskemiye bağlı enfarktüsün fizyolojik tepkilerini taklit eder. Bu yöntem, zebra balıklarında kardiyomiyosit proliferasyonunu hangi faktörlerin uyardığı gibi rejeneratif biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Yaralı kalp, geçici yara izi birikmesini ve kaybedilen kalp kasının yeniden büyümesini içeren kapsamlı doku yeniden şekillenmesi sırasında hayati öneme sahip kasılma aktivitesini nasıl sürdürebilir?

Zebra balıklarında tam kalp rejenerasyonunu sağlamak için fibroz ve yeni miyokard oluşumunun bu zıt hücresel tepkileri nasıl koordine edilir? Bu tekniğin sonuçları, memelilerin zebra balıklarına kıyasla neden zayıf kapasite gösterdiğini daha iyi anlamaya kadar uzanır. Ağlama yaralanması tekniği, laboratuvarımızda bu tekniği kuran doktora öğrencisi Fabian Shale tarafından sunulacaktır. Kalp.

Kesit alma daha sonra kriyocerrahiye hazırlanmak için teknik asistanımız Zimmerman tarafından gösterilecektir. Bir stereo mikroskop, keskin forsepsler, mikrolar, diseksiyon yaylı makas ve plastik bir transfer pipeti hazırlayın. Ek olarak, balığı uyuşturmak için bir beher ve transfer için plastik bir kaşık hazırlayın.

Ameliyatı gerçekleştirmek için kullanılan ana alet, prosedürü gerçekleştirirken donmayı önlemek için paslanmaz çelikten yapılmış kalem benzeri bir alet olan kriyo probudur, balığı sabit bir pozisyonda tutmak için probu tutmak için plastik bir tüp ve bant kullanın. İşlem sırasında nemli bir süngere bir oluk açın. Önce on saniyelik bir geri sayım ve ardından otomatik olarak 24 saniyelik bir geri sayım ile bir çift zamanlayıcı ayarlayın.

Kriyo yaralanma prosedürüne başlamak için. İlk olarak, ucu en az üç dakika boyunca üç ila beş santimetre sıvı nitrojene batırarak kriyo probunu soğutun. Yetişkin zebra balıklarını, balık sırtı ve solungaçları üzerinde dönene kadar %0.02 trica'ya batırarak uyuşturun ve öldürün.

Neredeyse hareket etmeyi bırak. Plastik kaşığı kullanarak, balığı ventral tarafı yukarı bakacak şekilde nemli süngerin oluğuna aktarın. Baskın olmayan el ile balığı forseps ile sabit tutun.

Daha sonra, kalbin arka medial kenarını görsel olarak bulun ve cildi delmek için düz iridektomi makası kullanın. Daha sonra cilt ve kaslar boyunca ön yönde düz bir şekilde keserek kalbin üzerinde küçük bir kesi yapın. Makasın ucuyla, atan ventriküle doğrudan erişim sağlamak için hipodermisin gümüşi epitel tabakasını nazikçe yırtın.

Makası vücut boşluğunun daha derinlerine sokmayın çünkü bu kalbi delecektir. Atan kalp iyi görünmeli ve torakotomi sırasında yoğun kanama olmamalıdır. Programlanan zamanlayıcıyı başlatın İlk 10 saniye boyunca, kriyo probunu sıvı nitrojenden çıkarın ve nitrojeni çıkarmak için hafifçe sallayın.

Daha sonra kesiyi yanal olarak yayarak göğsü açmak için forseps kullanın. On saniyelik zamanlayıcı kapandığında, ventriküle dokunmak için hemen ve nazikçe ön soğutmalı kriyo probunun ucunu kullanın. Ventrikül ile sıkı bir temas sağlamak için prob kalbe tam olarak yerleştirilmelidir.

Bunu başarmak için, ventrikül tam olarak insizyonun merkezine yerleştirilmelidir. Zamanlayıcı 24 saniye sonra çaldığında, kriyo probunu dokudan çıkarmak ve balığı sistem suyuyla tanka aktarmak için göğsün üzerine iki ila üç mililitre sistem suyu dökmek için plastik pipeti kullanın. Nefes almıyorsa, yaklaşık 45 saniye sonra, kendi kendine nefes almaya başlayana kadar solungaçlara su fışkırtmak için plastik bir pipet kullanarak hayvanı uyarın Kalbi toplamak ve düzeltmek için.

İlk olarak, bir mikro fuge tüpünde bir mililitre% 2 formin hazırlayın. Ayrıca seçilen günde iki forseps, mikros, diseksiyon makası ve nemli oluklu süngeri hazır bulundurun. Kriyo yaralanmasından sonra, balığı beş dakika boyunca% 0.1 trica içinde ötenazi yapın.

Mikro diseksiyon makasını kullanarak balığın ventral tarafı yukarı bakacak şekilde süngerin içine yerleştirin. Brakiyal kıkırdak boyunca kalbin üzerinde büyük bir kesi yapın. Kesiyi geniş bir şekilde açmak için forseps kullanın.

Daha sonra, ventrikülün önündeki beyaz bir yapı olan bulbus arteriozunu sıkıştırın ve kalbi fiksasyon için çekerek boşluktan çıkarın. % 2 Formin tüpüne en fazla üç kalp yerleştirin. Tüpü birkaç kez nazikçe çevirin ve gece boyunca dört santigrat derecede tutun.

Kalpleri montaja hazırlamak için PBS'de beş dakika durulayın. Daha sonra bunları 10 mililitre önceden soğutulmuş,% 30 sükroz içine aktarın. Kalpleri bir saat 20 dakika kuluçkaya yatırın.

Dört santigrat derecede, kalpler tüpün dibine batacak. Sonra, kuru buz içeren bir kutu hazırlayın. Ardından, bir gömme kalıbının dibine beş milimetrelik bir OCT montaj ortamı tabakası dökün.

Forseps kullanarak, stereo mikroskop altında kalıptaki OCT ortamına bir kalp yerleştirin. Kalbi, ventriküler apeks kalıbın altında olacak ve soğanlı arteryoz yukarı bakacak şekilde yönlendirin. Ardından kalıbı OCT donana kadar birkaç dakika kuru buz üzerine yerleştirin.

Ardından kalıbı doldurmak için daha fazla OCT ekleyin. Kesme boyutu 16 mikron, oda sıcaklığı eksi 24 santigrat derece ve numunenin sıcaklığı eksi 22 santigrat derece olan bir kriyostat kurun. Kriyostatın içine bir numune içeren donmuş bir blok yerleştirin ve yönünü, kesme işlemi bloğun dibine paralel olarak başlayacak şekilde sabitleyin.

Blok başına altı süper don artı slayt hazırlayın ve bunları birden altıya kadar numaralandırın. Dokuya ulaşılana kadar kesmeye başlayın ve ardından numunenin etrafındaki bloğu kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın Bir kalbin altı kopyasını elde etmek için, birinci slayttaki ilk bölümü, ikinci slayttaki ikinci bölümü, üçüncü slayttaki üçüncü bölümü vb. alın. Altıncı bölüm altıncı slayta yerleştirildikten sonra, birinci slayt ile yeniden başlatın ve tüm organ kesilene kadar devam edin.

Slayt başına sekiz bölümden oluşan iki satır toplayın. Slaytları oda sıcaklığında bir saat kurumaya bırakın. Bunları sıkıca kapalı kutularda eksi 20 santigrat derecede bir yıla kadar saklayın, burada gösterilen, kriyo yaralanmasından dört gün sonra diseke edilmiş bir bütün kalpte temsili bir kardiyak yaralanmadır.

Miyokard dokusunu görselleştirmek için, EGFP ve nükleer dazs eksprese eden vivo transgenik balıklar, ikisi kardiyak spesifik CM C kontrolü altında iki promotör kullanıldı. EEG, FP ve DS kırmızısının yokluğu, iki floresan sinyali, kalp rejenerasyonunun yara izine karşı derecesini belirlemek için apikal lateral ventriküler duvar boyunca disk şeklinde bir enfarktüs bölgesini sınırladı. Kardiyak ve fibrotik dokuları diferansiyel olarak etiketleyen asit füzyon turuncu GS boyaması kullanılarak histolojik analiz yapıldı.

Sağlıklı kas hücreleri turuncu renkle etiketlenmiştir. Mavide kollajen ve kırmızıda fibrin içeren skar dokusunun gen ekspresyon analizleri, hibridizasyon içgörüsü kullanılarak gerçekleştirildi. Ventriküler miyozin.

Sağlam miyokarddan gelen ağır zincirli mRNA burada mavi renkte görülmektedir. Yaralı doku, kardiyak gen transkriptinden yoksundur. Bu şekilde, yeşil etiketlerle gösterilen TRO misininin immünofloresan boyaması, bozulmamış kardiyomiyositler ve hasar görmemiş doku

Çekirdekler DPI ile boyanır ve bu panelde genetik olarak etiketlenmiş kardiyomiyositler eksprese mavi ile gösterilir. DS RED çekirdeklerinde iki, DAPI ise tüm çekirdekleri etiketler. Bununla birlikte, enfarktüs bölgesi DS kırmızısı içermez.

İki pozitif hücre. Usta okuduktan sonra, tek bir balığın ağlama yaralanması, düzgün bir şekilde yapılırsa beş dakikadan daha kısa sürede yapılabilir. Bu prosedürü denerken, kriyo yaralanma tekniğinin geliştirilmesinden sonra çağrılan kriyo probunu en uygun süre boyunca tam olarak vle üzerine yerleştirmeyi unutmamak önemlidir.

Bu yöntem, rejeneratif biyoloji alanındaki araştırmacıların doğal kardiyak restorasyonun altında yatan mekanizmaları keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu filmi izledikten sonra, kriyo hasarı kullanarak CPR balıklarında miyokard enfarktüsünün nasıl indükleneceğini iyi anlamış olmalısınız.