İBH DSS-kaynaklı Modeli Bağırsak Enflamasyon incelenmesi

Deneysel modeller inflamatuvar barsak hastalığı patogenezi ile ilişkili karmaşık doğal ve adaptif immün yanıtları incelemek için izin verdiler. Histolojik skorlama, pro-inflamatuar sitokinler ve miyeloperoksidaz aktivitesi ölçümü kullanarak, inflamatuvar barsak hastalığı görülen bu yanıtlar değerlendirmeye başlayabilirsiniz.

Bu prosedürün genel amacı, iltihaplanmaya yanıt olarak üretilen miyelo peroksidaz aktivitesi ve proinflamatuar sitokinlerin miktarlarını belirleyerek dekstron sülfat sodyumun neden olduğu bağırsak bağışıklık tepkisini değerlendirmektir. İlk olarak, DSS koliti, DSS SALT çözeltisinin içme suyuna verilmesi yoluyla farelerde indüklenir. Daha sonra, kolitin hastalık şiddeti makroskopik skorlama ile değerlendirilir ve daha ileri analiz için kolon çıkarılır.

Diseke edilen kolon daha sonra histoloji, sitokin ölçümü ve NPO aktivitesi için üç parçaya bölünür. Son olarak, kolon dokusu homojenize edilir ve süpernatant, MPO aktivitesini belirlemek için kullanılır. Sonuç olarak, MPO aktivitesindeki değişiklikler, bir spektrofotometre kullanılarak toplanan absorbans verileri aracılığıyla belirlenebilir.

Bu yöntem, DSS ve TNBS'nin neden olduğu kolit gibi çeşitli inflamatuar bağırsak hastalığı modellerinin kronik bilgileri hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca işleme başlamadan önce akciğer ve karaciğer gibi diğer organlarda da bu yöntemi kullanabilirsiniz. İltihabı indüklemek için her fare kafesindeki içme suyunu DSS solüsyonu ile değiştirin.

Kontrol farelerine DSS olmadan otoklav içme suyu verin. Daha sonra deney gününde, daha önce Whitham Williams ve Williams'ın JoVE makalesinde gösterildiği gibi kolonu inceleyin. Bir çift bükülmüş cımbız kullanarak dışkıyı tüm kolonu dikkatlice sıkın ve dokuyu steril PBS ile durulayarak bir tartı kağıdına toplayın.

Dışkıdaki kan skorunu belirlemek için kıvamını belirlemek için dışkıya bastırmak için bir çift forseps kullanarak dışkıyı değerlendirin. Dışkının rengini not edin ve dışkıyı hemokült kağıda sürmeyi, geliştirici eklemeyi ve ardından mavi rengin not edilmesini içeren bir hemokült test kullanarak değerlendirmeyi daha da doğrulayın, bu da kan için pozitif bir dışkı testini gösterir. Ardından, koşulların her biri için bir değer belirlemek üzere bu tabloyu kullanın.

Daha sonra, kolonun proksimal ila distal oryantasyonunu korurken, kolonu üç eşit bölüme ayırın. Daha sonra kolonun proksimal ve orta kolon bölümlerinden numune parçaları alın ve numuneleri ayrı ayrı 1.5 mililitrelik eph tüplerine yerleştirin. Kolit şiddetinin histolojik hasarını değerlendirmek için, kolonun en distal doku bölümünü kullanın ve küçük bir yarım ila bir santimetre uzunluğunda bir parça kesin.

Parçayı bir doku kasetine yerleştirin ve kaseti tamponlu% 10 formalin çözeltisine batırın. Daha sonra, doku parçalarının parafin gömülü enine kesitlerini hazırladıktan sonra, kör bir gözlemci tarafından puanlama için bölümleri hematin eoin ile boyayın. Son olarak, proksimal ve orta kolon bölümlerinden alınan numuneleri sıvı nitrojen içinde dondurun ve eksi 70 santigrat derecede kullanılana kadar saklayın.

Kolon örneklerini eksi 70 santigrat derece depodan çıkardıktan sonra buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, görünür dışkı veya yağı çıkarmak için bükülmüş forseps kullanın ve bunları bir homojenizatörde kullanıma uygun iki mililitrelik tüplere yerleştirin. Ardından her bir numunenin ağırlığını belirleyin ve kaydedin.

Daha sonra, her bir numune tüpüne homojenizatör boncukları ekleyin ve daha sonra az önce belirlendiği gibi dokunun ağırlığına göre tüpe uygun miktarda H sekme tamponu ekleyin, parçaları 30 hertz'de dört dakika boyunca bir doku homojenizatörü ile ayırın. Son olarak, hücre çözeltisini 13, 400 kez G ve dört santigrat derecede altı dakika santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir tüpe toplayın ve ardından homojenizasyon boncuğunu tuttuğunuzdan emin olarak elde edilen peleti atın.

Süpernatan daha sonra kullanıma kadar eksi 70 ° C'de saklanabilir. Bu adıma, önceden hazırlanmış doku homojenatının yedi mikrolitresini 96 oyuklu bir plakaya üç kopya halinde ekleyerek başlayın. Daha sonra taze hazırlanmış OD Dion iyotuna 50 mikrolitre seyreltilmiş hidrojen peroksit ekleyin.

Çok kanallı bir pipet kullanarak, oyukların her birine 200 mikrolitre hidrojen peroksit karışımı ekleyin. Şimdi, bir spektrofotometre kullanarak 550 nanometrenin absorbansını ölçün ve 32. aralıklarla üç okuma yapın. Daha sonra absorbans verilerini, doku ağırlığını ve tampon hacmini kullanarak, bu numune hesaplamasında gösterildiği gibi homojenatlardaki NPO aktivitesini hesaplayın.

DSS tedavisi süresince, hastalık aktivite indeksi, hastalığın klinik ilerlemesini değerlendirmek ve değerlendirmek için kullanılabilir. DSS ile tedavi edilen hayvanlar, başlangıç ağırlıklarına, gevşek dışkılara ve dışkı kanamasına kıyasla önemli kilo kaybı gösterir. Makroskopik sistemlerden ne kadar önemli olursa, hastalık aktivite indeksi o kadar yüksek olur.

Beş gün boyunca içme suyunda% 5 DSS verilen farelerin kolonlarının kurban edilmesi ve incelenmesi üzerine, kolon uzunluğunun kısalması, kolon kanaması, dışkı kanaması, dışkı kıvamının gevşemesi ve rektal kanama belirtilerinin makroskopik skorlamasına dayanan kolit şiddetinin, bu temsili deney için su ile tedavi edilen kontrollerden yaklaşık beş kat daha kötü olduğu belirlendi. Kolonik doku örnekleri, H ve E ile aynı şekilde, suyla tedavi edilen kontrollerden daha yüksek histolojik skorlara sahiptir. Burada, normal mimari ve hücresel infiltrat eksikliği, yalnızca su alan bir kontrol hayvanından toplanan bu h ve e lekeli kesitte yıldız işaretiyle gösterilen alanda not edilebilir. Şimdi, DSS ile tedavi edilmiş bir hayvandan alınan bir numunenin bu h ve e boyamasını önceki şekille karşılaştırın.

Bu hayvandan elde edilen kolon, pound işareti ile gösterildiği gibi daha fazla hücresel infiltrasyon ve daha fazla kadeh hücresi tükenmesi ve daha fazla distorsiyon ile kanıtlandığı gibi daha fazla histolojik hasar sergiler. Yıldız işaretiyle gösterildiği gibi K crypt mimarisinde hasar. DSS ile tedavi edilen farelerde hastalık şiddetinin derecesini daha fazla karakterize etmek için, homojenize kolon dokusu örneklerinden iltihaplanma için bir vekil belirteç olan NPO aktivitesi değerlendirilebilir.

Beklendiği gibi, DSS ile tedavi edilen kolonlar, kontrollerden daha yüksek bir NPO aktivitesine sahiptir. Ek olarak, DSS'nin neden olduğu kolitin şiddeti, IL bir, beta, IL altı ve TNF alfa gibi pro-inflamatuar sitokin seviyelerinin artmasıyla ilişkilidir. Bu prosedürü denerken, MPO aktivitesinin zamanla azalabileceğini hatırlamak önemlidir.

Bu nedenle, MPO testi, bağırsak iltihabının şiddetini belirlerken yapılan ilk testlerden biri olmalıdır.