İnsan Mantar şeklinde Lezzet papilla hücrelerinin izolasyonu ve Kültürü

Bu prosedürün amacı, insan mantarlarının tat Pap pilley hücre kültüründen başarılı bir şekilde kurulduğunu göstermektir. Bu, önce insan gönüllülerden pilley başına mantar formu tadı elde edilerek ve bunları enzimatik bir kokteyl kullanarak ilişkilendirerek gerçekleştirilir. İkinci adım, hücreleri insan mantarlarından pilley başına form tadından bir hücre kültürü kabına aktarmaktır.

Daha sonra, kültürü insan mantarlarına sürdürmek için hücrelerin büyümesine ve ortamı değiştirmesine izin verin. Pilley hücreleri başına formm tadı. Sonuç olarak, tat, hücre belirteçleri ve fizyolojik tepkilerin varlığını göstermek için kalsiyum görüntüleme, konfokal mikroskopi ve ışık mikroskobu kullanılır.

Bu tekniğin temel avantajı, her seferinde taze toplanan doku yerine hücre dizilerinin kullanılmasına izin vermesidir. Biri bir deney yapar. Bu yöntem insan tat alma mekanizmalarının içini sağlayabilse de, diğer türler ve diğer rejenerasyon çalışmaları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Bu yöntem, tat hücrelerinin nasıl yenilendiği ve tat, hücre çoğalması ve olgunlaşması sırasında gen ekspresyonunu hangi faktörlerin düzenlediği gibi tat alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu işleme başlamak için, mikro makas getirmek için bir çift kavisli kullanarak, dilin ön kısmının dorsal yüzeyinden çıkararak hap başına insan mantarlarının tadını elde edin. Bu protokolün detayları daha önceki bir JoVE makalesinde yayınlanmıştı.

Ardından, mantar pap hapını sindirmek için numuneyi hemen izolasyon solüsyonuna yerleştirin. Bunları, 35 santigrat derece su banyosunda sirkülasyon ve 30 dakika boyunca% 95 oksijen,% 5 karbondioksit ile hafif oksijenasyon ile 35 derece Santigrat derece su banyosunda kollajenaz tip bir elastaz ve soya fasulyesi tripsin inhibitörü ile izolasyon solüsyonunda izole edin. İnkübasyondan sonra, papillaları zil çözeltisi ile yıkayın.

Ateşle parlatılmış bir cam makarna pipeti ile 10 kez yedirin, ardından oda sıcaklığında 2.500 RPM olmak üzere üç dakika santrifüjleyin. Bundan sonra, izolasyon çözeltisini çıkarın. Pape'ye bir mililitre tat hücre kültürü ortamı ekleyin.

Sonra sindirilmiş mantarları aktarın, formm papillaları bir cam tabağa koyun. Şimdi mantar formm papillalarını cerrahi bir tıraş bıçağıyla nazikçe inceleyin. Sıçan kuyruğu kollajeni ile kaplanmış kapak fişine 250 mikrolitre disseke papilla ekleyin.

Klonlama silindirine bir tane yazın. Daha sonra, kuyucuğa bir mililitre tat hücresi kültürü ortamı ekleyin. Bu prosedürde, plakayı iki gün boyunca% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 36 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra tam orta tat hücrelerini değiştirin, ilk üç gün içinde görünmeyebilir, ancak sonunda kaplanmış örtü kaymasına bağlanacaklardır. Ardından, klonlama silindirini plakadan ve ortamdan tamamen çıkarın. Kuyuya bir mililitre tat hücresi ortamı ekleyin.

Bundan sonra, her altı ila yedi günde bir ortamın üçte birini değiştirin. Bu arada, hücreleri mikroskopta kontrol edin Her geçen gün, yeni hücrelerin çoğu hücre kümelerinin altında büyür. Hücre kümeleri genellikle, klonlama silindirinin% 40 ila 50'si genişleyen tat hücreleri tarafından kaplandıktan sonra, kültürde iki ila üç hafta sonra yeni oluşturulan hücreleri terk ettikten sonra örtü kaymasının yüzeyinden ayrılır.

Tripsin, EDTA'da 36 santigrat derecede iki ila üç dakika boyunca hacim başına 0.25 ağırlık kullanan hücrelerdir. Daha sonra hücreleri kuyudan 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra, tat hücresi kültürü ortamını, fetal sığır serum santrifüjü içeren ortam ile beş dakikalık oda sıcaklığı için dakikada 3000 rotasyona dört kat seyreltin.

Bundan sonra, supinatı çıkarın ve hücreleri bir mililitre tat hücresi ortamı ile yeniden askıya alın. Şimdi hücreleri bir T 25 plakasına aktarın. Sonra dört mililitre tat hücresi ortamı ekleyin.

Hücreleri% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 36 santigrat derecede tutun. Daha sonra, tat hücreleri% 100 birleşmeye ulaşana kadar her altı ila yedi günde bir ortamın üçte birini değiştirin. Tat hücrelerinin hasat için etkinleştirilmesini sağlamak için, hücreleri steril PBS ile bir kez yıkayın.

Daha sonra tripsin, EDTA'da 36 derecede iki ila üç dakika boyunca hacim başına %0,25 ağırlık kullanarak onları gözler. Hücre cs, santrifüjlemeyi daha önce tarif edildiği gibi tekrarlayın, daha sonra bunları tat hücresi tam ortamında yeniden askıya alın, hücreleri taze bir T 75 şişesine aktarın ve her altı ila yedi günde bir ortamın üçte birini değiştirin. Hücreler %100'e yakın birleştiğinde, zaman içinde hücrelerin yeterli büyümesini sağlamak için hücreleri bir T 75 şişesinde en fazla bir ila dört seyreltmeye bölün.

Birincil tat hücrelerinin stoğunu dondurmak için. Tripsin'den sonra, üç mililitre tam tat hücresi ortamı ekleyin, hücreleri 15 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne aktarın, ardından beş dakikalık oda sıcaklığında 2.500 RPM'de santrifüjleyin. Supinatı dikkatlice çıkarın ve hücreleri% 95 fetal sığır serumu ve% 5 DMSO içeren uygun bir hacimde dondurma ortamı ile nazikçe yeniden süspanse edin.

Ardından, hücreleri etiketli bir steril kriyo şişesine aktarın. Şişeyi sıkıca kapatın, ardından izopropanol içeren bir dondurma kabına koyun ve kabı, hap hücreleri başına donmuş birincil insan mantarlarının formm tadı olan sıvı nitrojen tura şişesine aktarmadan önce en az bir gün eksi 80 santigrat derece dondurucuya koyun. 37 santigrat derece su banyosuna, sadece çözülene kadar lamina akışlı hücre kültürü davlumbazına yerleştirin.

Bundan sonra, hücreleri ve dondurma ortamını steril 50 mililitrelik konik bir santrifüj tüpüne aktarın. Buna beş mililitre tat hücresi kültürü ortamı ekleyin. Daha sonra, hücreleri beş dakika boyunca 2.500 RPM'de santrifüjleyin.

Oda sıcaklığında, snat'ı dikkatlice atın ve hücreleri tam bir tat ile nazikçe yeniden süspanse edin. Hücre kültürü ortamı. Daha sonra steril bir T 25 doku kültürü şişesine aktarın.

Bu kültürlerdeki hücreler, olgun tat hücrelerinin karakteristik özelliği olan birçok moleküler ve fizyolojik özellik gösterir. Ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu ile Gus din ve fosfolipaz C beta iki mRNA tespit edildi ve ürünler sekanslama ile doğrulandı. Gus Din ve fosfolipaz C beta iki ekspresyonu, tip iki benzeri hücrelerin varlığını gösteren İmmüno kimyasal olarak tespit edildi.

Kültürlenmiş hücreler ayrıca, çeşitli tat uyaranlarının uygun konsantrasyonlarına yanıt olarak hücre içi kalsiyumda güçlü artışlar sergiledi. Bu çalışmalarda, tatlı ve acı uyaranlar, depolarizasyona karşılık gelebilecek hücre içi kalsiyumda bir artışa neden olur. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu prosedür sonrasında uygun şekilde yapılırsa bu teknik bir ila iki saat içinde yapılabilir.

Kalsiyum görüntüleme ve immünokimya gibi diğer yöntemler, hangi tat reseptörlerinin mevcut olduğu veya belirli büyüme faktörlerine yanıt olarak proliferasyon hızının ne olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, insan tat hücrelerini nasıl ayrıştıracağınızı ve büyüteceğinizi iyi anlamış olmalısınız.