Substrat bağlı Hücrelerinin Mikropipet Aspirasyon Hücre Rijitlik tahmin etmek

Aşağıdaki deneyin amacı, farklı fizyolojik ve patolojik koşullar altında hücresel viskoelastik özellikleri analiz etmektir. Bu, bir mikro pipet çektirmesi kullanılarak cam kılcal damarlardan yapılmış bir basınç dönüştürücüsüne bağlı aass mikro pipet aracılığıyla hücre zarına negatif basınç uygulanarak elde edilir. Pipet, ters çevrilmiş bir mikroskobun bir aşamasına yerleştirilmiş ince bir mikro manipülatöre monte edilir ve pipetin ucu bir hücrenin yakınına getirilir.

Daha sonra, pipetin ucu arasında bir conta oluşturulur ve daha sonra pipete hücre zarı zarı deformasyonu, uygulanan bir negatif basınç adımına yanıt olarak ölçülür. İyi tanımlanmış kuvvete yanıt olarak membran deformasyonunun derecesine bağlı olarak farklı tedavilerin hücresel biyomekanik özellikler üzerindeki etkilerini gösteren sonuçlar elde edilir. Laboratuvarımızın etkisi, dislipideminin vasküler endotel hücrelerinin biyofiziksel ve biyomekanik özellikleri üzerindeki etkisini araştırmaktır ve bugün size hücre sertliğini ölçmek için kullandığımız mikropipet aspirasyonu adı verilen bir yöntemden bahsedeceğiz.

Bu tekniğin etkileri, anjiyogenez, mekanik algılama ve göç ve daha fazlası gibi çoklu mekanizmalarda hücresel biyomekaniğin temel anlayışına doğru uzanır. Bu yöntem hücresel biyomekanik hakkında bilgi sağlayabilse de, model zarlar, hücre içi organeller veya dokular gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Hücre zarını görselleştirmek ve zarın pipete yansımasını gözlemlemek için, vasküler endotelyal hücresel zarlar lipofilik bir floresan boya ile boyanır.

Başlamak için, stok boya boyasını ısıtılmış bir PBS çözeltisi ile çalışma konsantrasyonuna seyreltin, D agregalarını parçalamak için karışımı beş dakika boyunca sonikleştirin. Mikro santrifüjde beş dakikalık bir dönüşün ardından, 0.5 mililitre PBS ekleyerek supinat yıkama vasküler endotel hücrelerini çıkarın. Beş dakika sonra, çözeltiyi aspire edin ve iki kez daha yıkamaya devam edin.

Daha sonra zar çözeltisini hücrelere ekleyin ve 30 dakika ve 37 santigrat derece inkübatörde inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücreleri daha önce olduğu gibi PBS ile tekrar yıkayın. Mikro pipetler, ortasındaki cam bir kılcal damar ısıtılarak çekilir.

Cam erimeye başladığında, iki mikro pipet oluşturmak için kılcal damarın iki yarısı birbirinden ayrılır. Bu deneylerde kullanılan pipetlerin uçları tipik olarak iki ila altı mikron arasında değişir. Dış çap, hücrenin boyutuna bağlı olarak, ucun şekli, pipet çekicisine yerleştirici cam kılcal damarı başlatmak için silindirik bir tüpe yaklaşmalıdır.

Bu gösterimde, Suter P 97 yatay pipet çekme işlemi optimize edilmiş bir programla kullanılmıştır. Bu çektirme, çekmenin hızını ve diğer parametrelerini değiştirmek için birden fazla programlanabilir seçenek sunar. Çekme programını etkinleştirmek için devam edin.

Her bir mikro pipeti çektikten sonra, mikroskop altında ucun şeklini doğrulayın Ucu ateşle parlattıktan sonra, mikro pipeti PBS veya floresan olmayan büyüme ortamı gibi fizyolojik bir tuzlu su çözeltisi ile doldurun. Daha da önemlisi, çözelti, hücre zarının pipete düzgün bir şekilde hareket etmesini sağlayacak %30'luk serum ile desteklenmelidir. Bu gösteride, bir bilgisayara bağlı bir video kamera, bir basınç dönüştürücü, titreşimsiz bir istasyon ve bir mikro manipülatör ile 3D evrişim giderme özelliklerine sahip ters çevrilmiş bir floresan mikroskop kullanılır

Sığ bir uzunlamasına oda kullanmanın mantığı, bir mikro pipetin hücrelere mümkün olduğunca yataya yakın çok sığ bir açıyla yaklaşmasına izin vermektir. Bu, mikro pipete çekilen zarın tek bir odak düzleminde görüntülenmesini sağlamak için yapılır. Doldurulmuş bir mikro pipeti, sıkı bir şekilde oturması için çapı pipet tutucunun konektörüne ayarlanmış bir çapa sahip, esnek bir boru ile bir güç dönüştürücüsüne bağlı bir pipet tutucusuna yerleştirin.

Her deneyin başında, pipetteki basınç atmosfer basıncına dengelenir, pipeti mikron aralığı aralığındaki pipet hareketlerinin hassas bir şekilde kontrol edilmesini sağlayan bir mikro manipülatöre monte edin. Pipeti haznenin dibine sığ bir açı yapacak şekilde konumlandırın ve pipetin ucunu görüş alanının ortasına getirin. Membranın aspire edildiği pipet ucunun silindirik bir parçası olan pipetin sapı, odak düzlemine yatay olarak hizalanmalıdır.

Bu ilk konumu gerçekleştirmek için, pipeti mümkün olan en sığ açıyla uygulayın ve ardından pipetin sapını haznenin tabanına doğru esnetin. Sap çok ince olduğu için, bir hücreye yaklaşırken odanın dibinde kayacak kadar esnektir. Hücre için odak düzlemine yakın olana kadar rota manipülatörünü kullanarak mikro pipeti yavaşça tek bir hücrenin yanına indirin.

Ardından, ince manipülatörü kullanarak, pipetin ucu zara hafifçe temas edene kadar mikro pipeti hücrenin kenarına doğru hareket ettirin. Pipetin konumunu gözlemlemek için bir resim çekin. Pipetin tüm ucu hücre yüzeyi ile tam temas halinde olduğunda ve temas stabil olduğunda iyi sızdırmazlıklar oluşturulur.

Ardından, dönüştürücüyü kullanarak bir negatif basınç adımı uygulayın ve membran projeksiyonu stabilize olana kadar koruyun. Membranı pipete aspire etmek için gereken basınç miktarı, hücre tipine ve spesifik deney koşullarına bağlı olarak değişir. İlk deformasyon tipik olarak eksi iki ila eksi 15 milimetre cıva aralığında basınç uygulandığında gözlenir.

Basınç uygulandığında, zar belirli bir uzunlukta stabilize olana kadar pipet içinde kademeli olarak deforme olur. Bu süre zarfında tipik olarak iki ila üç dakika süren bir işlem olan bu işlemde, pipete çekilen zarın ilerlemesini izlemek için her 30 saniyede bir zar deformasyonunun görüntüleri gereklidir. Son olarak, basıncı iki ila beş milimetre cıva adımlarıyla bir sonraki seviyeye yükseltin.

Membran projeksiyonu hücreden ayrılıp pipete girene kadar tüm prosedürü tekrarlayın, bu noktada deney durdurulur. Membran deformasyonunun derecesini ölçmek için, aspire edilen uzunluk, pipetin ucundan membran projeksiyonunun çevresinin tepe noktasına kadar ölçülür. Daha büyük bir pipet, pipetlerin çapları arasındaki değişkenliği hesaba katmak için aynı basınç seviyesinde hücre zarına daha fazla kuvvet uygulayacaktır.

Aspire edilen uzunluk, substrata bağlı hücreler için mikro aspirasyon tekniğinin kullanımını doğrulamak için her deney için ölçülen pipet çapı için normalize edilir, bu yaklaşımla tahmin edildiği gibi sığır aort endotel hücrelerinin hücre sertliğinde bir azalma ile sonuçlanan F aktinin bozulması ile test edilmiştir. Burada, bir mikro pipet aracılığıyla uygulanan negatif basınca yanıt olarak ilerleyici deformasyona uğrayan bir endotel zarının tipik bir floresan görüntüleri dizisi beklendiği gibi gösterilmektedir. Membran kademeli olarak pipete aspire edilir ve uygulanan basınç süresinin bir fonksiyonu olarak aspire edilen uzunluk artar, deformasyonun seyri, f aktinin bozulmasının, tüm basınç koşulları altında çıkıntıların aspire edilen uzunluklarını önemli ölçüde artırdığını gösterir.

Bu yaklaşımı kullanarak, hücre zarları kolesterolden tükendiğinde hücre sertliğinin arttığı, kolesterol zenginleşmesinin ise hiçbir etkisi olmadığı keşfedildi. Burada. Kolesterolden zenginleştirilmiş bir hücre, bir kontrol hücresi ve kolesterolden yoksun bir hücre, eksi 15 milimetre cıvanın maksimum aspirasyon uzunluklarına ulaştıktan sonra gösterilir. Projeksiyonlar tipik olarak eksi 10 milimetre cıvada gelişmeye başladı ve zar deformasyonunun zaman nedenleri 10, 15 ve 20 milimetre cıvanın negatif basınçları için ölçülebildi.

Burada, maksimum aspire uzunlukları, uygulanan basıncın bir fonksiyonu olarak çizilir. Tükenmiş hücrelerdeki maksimum normalleştirilmiş uzunluk, eksi 15 milimetre cıva ve eksi 20 milimetre cıva basınçları için kontrol hücrelerininkinden önemli ölçüde daha düşüktü. 25 milimetre cıvanın üzerindeki negatif basınçların uygulanması, aspire edilen çıkıntının ayrılmasına ve ayrı bir kılıf oluşturmasına neden oldu.

Membran dekolmanı ile sonuçlanan basınç seviyesi, farklı kolesterol koşulları ve beklenmedik gözlemler altında benzerdi. Önceki çalışmalar, membran kolesterolündeki artışın, membran lipid çift katmanlarının sertliğini artırdığını gösterdiğinden, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki ila üç saat içinde yapılabilir. Bu tekniği denerken, bu deneyin tek tek hücreler üzerinde yapıldığını hatırlamak önemlidir.

Bu nedenle, toplam üç deney için deney başına koşul başına üç ila beş hücre analiz edilmelidir.