Substrat bağlı Hücrelerinin Mikropipet Aspirasyon Hücre Rijitlik tahmin etmek

Bu deneyin amacı, farklı fizyolojik ve patolojik koşullar altında hücresel viskoelastik özelliklerini analiz etmektir. Bu işlem, bir mikro pipet çekici kullanılarak cam kapilerlerden oluşturulmuş ve bir basınç dönüştürücüye bağlanan bir mikro pipet aracılığıyla hücre membranına negatif basınç uygulanarak gerçekleştirilir. Pipet, ters bir mikroskobun tablasına yerleştirilmiş hassas bir mikro manipülatöre monte edilir ve pipetin ucu bir hücreye yakınlaştırılır.

Ardından, pipet ucu ile hücre membranı arasında bir sızdırmazlık sağlanır ve ardından uygulanan basamaklı negatif basınca yanıt olarak membranın pipet içerisine doğru deformasyonu ölçülür. İyi tanımlanmış bir kuvvete karşı membranın deformasyon derecesine dayanarak, farklı tedavilerin hücresel biyomekanik özellikler üzerindeki etkilerini gösteren sonuçlar elde edilir. Laboratuvarımızın amacı, dislipideminin vasküler endotelyal hücrelerin biyofiziksel ve biyomekanik özellikleri üzerindeki etkisini araşt히rmaktır ve bugün size hücre sertliğini ölçmek için kullandığımız mikropipet aspirasyonu adı verilen bir yöntemi anlatacağız.

Bu tekniğin etkileri; anjiyogenez, mekanik algılama ve migrasyon gibi birçok mekanizma üzerinden hücresel biyomekaniğin temel düzeyde anlaşılmasına ve daha fazlasına katkı sağlar. Bu yöntem hücresel biyomekanik hakkında içgörü sağlayabilmenin yanı sıra model membranlar, hücre içi organeller veya dokular gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Hücre membranını görüntülemek ve membranın pipet içine doğru uzanımını gözlemlemek için vasküler endotelyal hücre membranları lipofilik floresan bir boya ile boyanır.

Başlangıç için, stok boyayı ılık bir PBS çözeltisi ile çalışma konsantrasyonuna seyreltin ve D agregatlarını parçalamak için karışımı beş dakika boyunca sonikasyona tabi tutun. Mikro santrifüjde beş dakikalık çevirme işleminin ardından supernatantı uzaklaştırın ve 0,5 mililitre PBS ekleyerek vasküler endotel hücrelerini yıkayın. Beş dakika sonra çözeltiyi aspire edin ve iki kez daha yıkama işlemini tekrarlayın.

Ardından dice çözeltisini hücrelere ekleyin ve 37 °C'lik bir inkübatörde 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından hücreleri daha önce olduğu gibi tekrar PBS ile yıkayın. Mikropipetler, bir cam kapilerinin orta kısmının ısıtılmasıyla çekilir.

Cam erimeye başladığında, kapilerleinin iki yarısı iki adet mikro pipet oluşturmak için birbirinden uzaklaştırılır. Bu deneylerde kullanılan pipet uçlarının çapı tipik olarak iki ila altı mikron arasındadır. Hücrenin boyutuna bağlı olarak, cam kapileri pipet çekicisine yerleştirmeye başlarken ucun şekli silindirik bir tüpe yakın olmalıdır.

Bu gösterimde, Suter P 97 yatay pipet çekici optimize edilmiş bir programla birlikte kullanılmaktadır. Bu çekici, çekme hızını ve diğer parametreleri değiştirmek için birden fazla programlanabilir seçenek sunar. Çekme programını etkinleştirme aşamasına geçiniz.

Her bir mikro pipeti çektikten sonra, ucun şeklini mikroskop altında doğrulayın. Ucu ateşle cilaladıktan sonra, mikro pipeti PBS gibi bir fizyolojik salin çözeltisiyle veya floresan olmayan büyüme besiyeriyle doldurun. Önemli bir nokta olarak, çözelti, hücre membranının pipet içine pürüzsüzce hareket etmesini sağlayacak %30 serum ile desteklenmelidir. Bu demonstrasyonda, hücreleri alt tabakalarından kaldırıp ters floresan mikroskoba monte edilmiş sığ bir boylamsal hazneye pipetleyerek hücreleri bir mikro aspirasyon haznesine yerleştirmeye başlamak için, 3D dekonvolüsyon yeteneklerine sahip ters bir floresan mikroskop; bilgisayara bağlı bir video kamera, bir basınç dönüştürücü, titreşimsiz bir istasyon ve bir mikro manipülatör kullanılmıştır.

Sığ bir boylamasına hazne kullanmanın gerekçesi, bir mikro pipetin hücrelere mümkün olduğunca yatay, çok sığ bir açıyla yaklaşmasını sağlamaktır. Bu işlem, mikro pipete çekilen membranın tek bir odak düzleminde görselleştirilmesine olanak tanımak için yapılır. İçi dolu bir mikro pipeti, çapı sığı hale getirmek için pipet tutucu konnektörüne göre ayarlanmış esnek bir tüp aracılığıyla güç transdüserine bağlı bir pipet tutucuya yerleştirin.

Her deneyin başlangıcında, pipetteki basınç atmosferik basınçla dengelenir; pipeti, mikron düzeyinde hassas kontrol sağlayan bir mikro manipülatöre monte edin. Pipeti, bölme tabanına sığ bir açıyla yerleştirin ve pipet ucunu görüş alanının merkezine getirin. Membranın aspire edildiği pipet ucunun silindirik kısmı olan pipet gövdesi, odak düzlemine yatay olarak hizalanmalıdır.

Bu ilk konumu sağlamak için, pipeti mümkün olan en sığ açıyla yerleştirin ve ardından pipetin gövdesini hazne tabanına doğru bükün. Gövde çok ince olduğu için, bir hücreye yaklaşırken haznenin tabanı üzerinde kayabilecek kadar esnektir. Kaba manipülatörü kullanarak mikro pipeti, hücrenin odak düzlemine yaklaşana kadar yavaşça tek bir hücrenin yanına indirin.

Ardından, hassas manipülatörü kullanarak, pipet ucu membrana hafifçe değene kadar mikro pipeti hücrenin kenarına doğru hareket ettirin. Pipetin konumunu gözlemlemek için bir görüntü alın. Pipetin tüm ucunun hücre yüzeyiyle tam temas halinde olduğu ve temasın stabil olduğu durumlarda iyi sızdırmazlıklar oluşur.

Ardından, transduserü kullanarak bir negatif basınç adımı uygulayın ve membran projeksiyonu stabilize olana kadar bu basıncı koruyun. Membranı pipete aspire etmek için gereken basınç miktarı, hücre tipine ve spesifik deneysel koşullara göre değişiklik gösterir. İlk deformasyon genellikle eksi iki ile eksi 15 milimetre cıva aralığında basınç uygulandığında gözlemlenir.

Basınç uygulandığında, membran belirli bir uzunlukta sabitlenene kadar kademeli olarak pipet içine doğru deforme olur. Genellikle iki ila üç dakika süren bu işlem sırasında, pipete çekilen membranın ilerlemesini takip etmek için her 30 saniyede bir membran deformasyon görüntüleri alınmalıdır. Son olarak, basıncı iki ila beş mmHg adımlarla bir sonraki seviyeye çıkarın.

Membran çıkıntısı hücreden ayrılıp pipetin içine girene kadar tüm prosedürü tekrarlayın; bu noktada deney durdurulur. Membran deformasyon derecesini nicelleştirmek için, aspire edilen uzunluk pipet ucundan membran çıkıntısının çevresinin tepe noktasına kadar ölçülür. Pipet çapları arasındaki değişkenliği hesaba katmak için, daha büyük bir pipet aynı basınç seviyesinde hücre membranına daha fazla kuvvet uygulayacaktır.

Substrata bağlı hücreler için mikro aspirasyon tekniğinin kullanımını doğrulamak amacıyla, aspire edilen uzunluk, her deney için ölçülen pipet çapına göre normalize edilmiştir; bu yöntemle tahmin edilen sığır aortik endotelyal hücrelerinin hücre sertliğinde, F aktin yıkımının bir azalmaya yol açtığı test edilmiştir. Burada, mikro pipet aracılığıyla uygulanan negatif basınca yanıt olarak kademeli deformasyona uğrayan bir endotelyal membranın tipik floresan görüntü serisi, beklendiği üzere gösterilmiştir. Membran kademeli olarak pipet içine aspire edilir ve aspire edilen uzunluk, uygulanan basıncın bir fonksiyonu olarak artar; deformasyonun zaman seyri, F aktin yıkımının tüm basınç koşulları altında projeksiyonların aspire edilen uzunluklarını önemli ölçüde artırdığını göstermektedir.

Bu yaklaşım kullanılarak, hücresel membranlardaki kolesterol tükendiğinde hücre sertliğinin arttığı, kolesterol zenginleştirmesinin ise herhangi bir etkisinin olmadığı keşfedilmiştir. Burada, -15 mmHg maksimum aspirasyon uzunluklarına ulaştıktan sonra kolesterolce zenginleştirilmiş bir hücre, bir kontrol hücresi ve kolesterolü tüketilmiş bir hücre gösterilmektedir. Projeksiyonlar tipik olarak -10 mmHg değerinde gelişmeye başlamıştır ve membran deformasyonunun zaman seyri -10, -15 ve -20 mmHg negatif basınçlar için ölçülebilmiştir.

Burada, maksimum aspirasyon uzunlukları uygulanan basıncın bir fonksiyonu olarak grafiğe dökülmüştür. Boşaltılmış hücrelerdeki maksimum normalize edilmiş uzunluk, -15 mmHg ve -20 mmHg basınçlar için kontrol hücrelerininkinden anlamlı derecede düşükdü. 25 mmHg'nin üzerindeki negatif basınçların uygulanması, ayrı bir yapı oluşturan aspire edilmiş projeksiyonun kopmasıyla sonuçlanmıştır.

Membran kopmasıyla sonuçlanan basınç seviyesi, farklı kolesterol koşulları altında benzerdi ve beklenmedik bir gözlemdi. Önceki çalışmalar, membran kolesterolündeki artışın membran lipid çift tabakasının sertliğini artırdığını göstermektedir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde iki ila üç saat içinde tamamlanabilir. Bu tekniği uygularken, bu deneyin tekil hücreler üzerinde gerçekleştirildiğini hatırlamak önemlidir.

Bu nedenle, toplam üç deney için, her deneyde ve her koşulda üç ila beş hücre analiz edilmelidir.