Zebra balığı Larva yılında Dissemine Kandidiyazis non-invaziv Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, mantar patojeni candida albicans kullanarak zebra balığı larvalarını enfekte etme tekniklerini göstermektir. İlk olarak, bir floresan mantar kültürü hazırlanır ve balık embriyoları kaplanır. Daha sonra, balıklar bir aros enjeksiyon kabına dizilir.

Candida albicans, her balığın kulağından arka beyin ventrikül balıkçısına mikro enjekte edilir, daha sonra düşük eriyik aerolara gömülür ve epi floresan mikroskobu ile görselleştirilir. Sonuç olarak, bu yöntem, Petri kabının basitleştirilmiş sisteminden ziyade, konakçının karmaşık ortamındaki konak patojen etkileşimini non-invaziv olarak görüntülemek için kullanılabilir. Bu tekniğin coddle ven enjeksiyonu gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, ölümcül yayılmış hastalıkla sonuçlanan lokalize bir enfeksiyon oluşturmanızdır.

Ayrıca, bu teknik, doğası gereği büyük C bucan hücrelerinin küçük zebra balığı larvalarına verimli bir şekilde enjekte edilmesine izin verir. Bir maya pone üzerine bir candida albican stoğu çizerek başlayın. Dekstroz agar plakası: Kolonilerin büyümesine izin vermek için plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Koloniler görünür hale geldikten sonra, izole edilmiş bir koloniyi seçmek için steril bir tahta dübel kullanın ve mayayı beş mililitre taze maya Ekstraktı Pepto dekstroz suyunu 16 x 150 milimetre kültür tüplerinde çözün. Kültürü, bir test tüpü tekerleği ve inkübatörlerle donatılmış bir doku kültürü silindiri tamburu üzerine yerleştirin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübatörler. Ertesi gün, kültürün bir mililitresini 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve hücreleri peletlemek için bir dakika boyunca 14.000 kez, G'de santrifüjleyin, ardından sırtı atın ve gevşetmek için peleti girdaplayın.

Hücreleri bir mililitre PBS girdabında yeniden süspanse edin ve tekrar santrifüjleyin. Sonra supinatı atın ve bu yıkamayı tekrarlayın. Herhangi bir kalıntı kültür ortamını çıkarmak için üç kez adım atın.

Hücreler yıkandıktan sonra, bunları PBS'de bir ila 100 seyreltmede bir hemo sitometrede sayın. 12 saatlik bir kültür için, mililitre başına üç ila dört kez 10 ila sekiz hücre beklemelisiniz. Reese, mayayı mililitre başına 10 ila yedi hücrelik bir son konsantrasyonda büküyor.

Enjeksiyondan bir gün önce bir yumurtlama tankından zebra balığı embriyolarını toplamak için bir elek kullanın ve bunları steril deiyonize suda mililitre başına 60 miligram anlık okyanus tuzu içeren bir yumurta suyu çözeltisinde saklayın. Daha sonra embriyoları 12 saatlik açık karanlık bir döngü ile 24 saat boyunca 33 derece SIU'ya yerleştirin. Bu, embriyonun, enfeksiyonun olduğu gün enfeksiyon için en uygun aşama olan ilk 25 larva aşamasına kadar gelişmesine izin verir.

Embriyoları bir transfer pipeti ile 60 mililitre yumurta suyuna ekstra derin bir Petri kabına aktarın. Daha sonra embriyoları kaplamak için kullanıcı diseksiyon mikroskobu ve dumont cımbız. Bu, Corian'ı balık dışarı çıkana kadar bir torba patates cipsi gibi nazikçe çekerek elde edilebilir.

Tüm embriyolar kaplandıktan sonra. Bu yüzden Petri kabı balığı merkeze doğru hareket ettirirken, balığı tabağın kapağına aktarın, ortamı çıkarın ve taze yumurta suyu ile değiştirin. Balıkları taze yumurta suyuna ekleyin.

Bir transfer pipeti kullanarak balığı uyuşturmak için mililitre başına 200 mikrogramlık bir trica metan sülfonat çözeltisi hazırlayın. 20 ila 50 embriyo toplayın ve bunları bir ila iki dakika veya hareket etmeyi bırakana kadar anestezik solüsyonda yerleştirin. Bu arada, enjeksiyon ünitesini açın, basıncın darbeyi açtığından ve geri basınç ünitesi için üç PSI ile darbe süresinin dokuza ayarlandığından emin olun.

Enjeksiyon basıncı 30 PSI'ye ulaşana kadar nitrojen tankındaki valfi kademeli olarak açın. Ardından, havuzlanmış mikro pipeti beş mikrolitre vorteks candida albican çözeltisi ile yükleyin ve mikro pipet tutucusuna yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu aşamasına su içeren ekstra derin bir Petri kabı yerleştirin ve mikropipetlerin konumunu, görüş alanına girene ve ucu sadece kısmen suya batırılana kadar ayarlayın.

Daha sonra cımbız kullanarak, havuzlanmış pipetin iğnesini uçtan yaklaşık üç milimetre kırpın. İğne başarılı bir şekilde klipslendiyse, enjeksiyon ünitesinin ayak pedalına basmak sıvının dışarı atılmasına izin vermelidir. Dereceli bir slayt kullanarak, dağıtılan hacmi ölçün, ardından basıncı, dağıtılan sıvının hacmi 0,21 milimetre çapında veya bir zebra balığı embriyosunun göz bebeğinin boyutunun hemen altında olacak şekilde ayarlayın.

Mikroskop kurulduktan ve balıklar uyuşturulduktan sonra, balığı merkeze çekmek için tabağı şişirin ve bir transfer pipetine alın. Balığın ucuna yerleşmesi için pipetin kenarına dikkatlice vurun. Daha sonra mümkün olduğunca az hacim kullanarak, balığı nazikçe 28 santigrat dereceye kadar ısıtılmış bir larva aose enjeksiyon kabına koyun.

Pürüzsüz bir cam çubuk kullanarak balıkları dikkatlice hizalayın. Sonra bir kağıt havluyla, tabaktan mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarın. Balıklı aros tabağını hem iğne hem de ilk balık net bir şekilde görünene kadar mikroskop altına yerleştirin.

Görünür bir kalp atışının varlığını gözlemleyerek her balığın hala hayatta olduğundan emin olun. Ölmüşse, atın ve bir sonrakine geçin. Cam iğneyi balığa doğru hareket ettirin, yakınlaştırın.

Bunu yaparken, iğneyi gözün hemen arkasında bulunan iki kulak taşı ile balığın kulağının dairesel yapısına dikkatlice sokun. İğne yerine oturduğunda, ayak pedalını kullanarak mayayı enjekte edin. İğne doğru bir şekilde yerleştirilirse, balık arka beyin ventrikülü enjeksiyondan sonra hafifçe sallanır, iğneyi geri çeker ve işlemi bir sonraki balıkla tekrarlayın.

Tüm işlem 15 veya 20 dakikadan fazla sürmemelidir, aksi takdirde balıklar bu süreden sonra kurur ve ölür. Maya ayrıca mikropipetin dibine yerleşecek ve eşit olmayan enfeksiyona, dozlara ve/veya havuzlanmış mikro pipetin tıkanmasına yol açacaktır. Tüm balıklar enjekte edildikten sonra, onları aroslardan yıkamak için yumurta suyu kullanın ve 60 mililitre yumurta suyu içeren taze bir Petri kabına koyun.

Ardından çanağı 28 santigrat dereceye getirin. Nitrojen valfini kapatın, tank hattındaki basıncı tahliye etmek için enjeksiyon anahtarını sürekli olarak ayarlayın. Ardından basınç sıfıra düştüğünde, anahtarı tekrar darbeye getirin ve enjeksiyon ünitesini kapatın.

Enfekte balığı daha önce tarif edildiği gibi trica metan sülfat içinde uyuşturarak başlayın. Balıklar uyuşturulduktan sonra, her seferinde bir balığı %0,4 düşük eriyik agar içeren bir Petri kabına aktarmak için bir pipet kullanın. Daha sonra bir transfer pipeti kullanın ve mümkün olduğunca az agros taşıyın.

Her bir balığı Petri kabından yaklaşık 0,2 mililitre ve %0,4 oranında bir cam tabanlı görüntüleme kabının bir kuyusuna aktarın, balığın üstüne mililitre başına 200 mikrogram anestezik ile desteklenmiş düşük eriyik ortaya çıktı, böylece iç halkalar doldurulur ve kuyunun dibine ince bir aros tabakası yayılır. Balıklar artık lazer taramalı konfokal sistemli ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılarak 24 saate kadar görüntülenebiliyor. Zebra balıklarını kırmızı floresan candida albicans ile enfekte ettikten beş saat sonra.

Maya, FL I bir EGFP balığında balığın arka beyninde görülebilir, bunlar gibi, balığın vücudundaki vasküler endotel ve makrofaj benzeri hücreler floresandır. Enfeksiyondan beş saat sonra burada yeşil renkte gösteriliyorlar. Maya, makrofaj benzeri hücreler içinde 24 saat içinde görülebilir.

Enfeksiyon, mayanın FTIC hücreleri içinde tekrar tespit edilebildiği dorsal kuyruk dokusu boyunca yayılmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, biri mantar kültürünü hazırlayan, ikisi uyuşturan zebra balığı larvaları da dahil olmak üzere, Prim 25 aşamalı zebra balığının arka beyin ventrikülüne candida albicans'ın nasıl mikro enjekte edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Arka beyin ventrikülüne üç mikro enjeksiyon.

Ve dördüncüsü, enfekte larvaları konfokal görüntüleme için hazırlamak.