Bir In vitro Co-enfeksiyon Modeli Plasmodium falciparum-HIV-1 Etkileşimleri

Biz geliştirdik

Bu prosedürün genel amacı, plazmodium fpar ile enfekte olmuş eritrositlerin insan primer monosit türevi makrofajlarda HIV birin replikasyonu üzerindeki etkilerini incelemek için bir in vitro model geliştirmektir. Bu, önce plazmodyum, yanlış para ile enfekte olmuş kırmızı kan hücrelerinin veac sistemi kullanılarak izole edilmesi ve daha sonra insan monositinden türetilmiş makrofajların enfekte hücrelere maruz bırakılmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, kırmızı kan hücresine maruz kalan monosit türevli makrofajlar, tamamen replikatif HIV veya tek replikasyonlu lusiferaz kodlaması, HIV ile enfekte edilir.

Son olarak, kültür süpernatantları, lusiferaz kodlama virüsü için tamamen replikatif virüs için enfeksiyondan sonraki 3, 6, 9 ve 12. günlerde hasat edilir. Enfekte hücreler enfeksiyondan 72 saat sonra yalan söyler. Sonuç olarak, viral replikasyon, Eliza tarafından süpernatanlardaki HIV bir P 24 kapsid proteini miktarının ölçülmesiyle izlenebilir ve viral transkripsiyon, hücre lizatlarının lusiferaz kantitasyonu ile izlenebilir.

Bu yöntem, sıtma, HIV ko-enfeksiyonları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, plazmodyum paraziti ile enfeksiyon HIV replikasyonunu nasıl etkiler? Bu yöntem, makrofajlarda plazmodyum ve HIV arasındaki etkileşimleri incelemek için geliştirilmiş olsa da, diğer hücre tiplerine de uygulanabilir.

Örneğin, dendritik hücreler, monositler veya CD dört T hücresi prosedürü gösteren Guadalupe Andreani olacaktır. Laboratuvarda doktora sonrası bir araştırmacı Kültür plakasından kırmızı kan hücrelerini toplayarak başlayın, geri kazanılan hücreleri 10 mililitre monosit türevi makrofaj ortamında yıkayın ve daha sonra peleti 12 mililitre monosit türevli makrofaj kültürü ortamında yeniden süspanse edin. Şimdi hücre süspansiyonunu yavaşça bir Milton ECS kolonuna ekleyin ve kolonu bir kez taze ortamla yıkadıktan sonra süspansiyonun akmasına izin verin, mıknatıstan çıkarın ve 12 mililitre monositten türetilmiş makrofaj kültürünü yıkayın.

Monosit türevli makrofajları enfekte veya enfekte olmamış kırmızı kan hücrelerine maruz bırakmak için enfekte olmuş kırmızı kan hücrelerini steril bir tüpe atlatarak kolon boyunca orta. Monosit türevli makrofajlar içeren önceden hazırlanmış 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna uygun kırmızı kan hücresi süspansiyon hacmini ekleyin. Ko kültürlerini dört saat sonra% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede inkübe edin, kırmızı kan hücrelerini içeren ortamı çıkarın ve daha sonra her birine 600 mikrolitre endotoksin içermeyen PBS ekleyin, her yıkamadan hemen sonra PBS'yi üç kez aspire edin.

Şimdi 200 mikrolitre buzda, soğuk, steril su ile her kuyucuğa kırmızı kan hücreleri aspire edilerek 20 saniye sonra su aspire edilir. Daha sonra her bir kuyucuğa 600 mikrolitre monosit türetilmiş makrofaj kültür ortamı türetilmiş ve kültürleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 24 saat inkübe edin. Plasmodium false parem'in HIV üzerindeki etkisini değerlendirmek için, bu şekilde gösterilen protokole benzer şekilde, P 24, NL, dört üç BO, IV, bir virüs içeren 300 mikrolitre monosit türevli makrofaj ortamında monosit türevli makrofajlarda bir replikasyon.

Ko kültürleri iki saat inkübe ettikten sonra, hücreleri 600 mikrolitre endotoksin içermeyen PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra 600 mikrolitrede her bir oyuğa taze bir monosit türetilmiş makrofaj ortamı ve 3, 6, 9 ve 12. günlerde kokültürleri inkübe etmeye devam edin İlk viral enfeksiyondan sonra, geri kazanılan hücre süspansiyonunu 200 mikrolitre taze monosit türevli makrofaj ile değiştirerek her bir snattan 200 mikrolitre hasat edin. Orta. Daha sonra, hasat edilen süpernatanları daha sonra Eliza tarafından analiz edilmek üzere eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Parazitlerin HIV üzerindeki etkisini belirlemek için, burada gösterilen protokollere benzer şekilde, ilgilenilen lusiferaz ENC kaplı virüsün P 24'ünü içeren 300 mikrolitre monosit türevli makrofaj ortamında monosit türevli makrofajlarda bir gen ekspresyonu. Kod kültürlerini lusiferaz olmayan ENC kaplı virüs için gösterildiği gibi inkübe ettikten ve yıkadıktan sonra, enfeksiyondan 72 saat sonra ortamı çıkarın ve 200 mikrolitre lusiferaz testi ekleyin. Hit lizis tamponu şimdi hücreleri oda sıcaklığında hafifçe çalkalayarak lys ve daha sonra kokültürleri eksi 20 santigrat derecede saklar.

Plaka çözüldükten sonra, her bir kuyucuktan 40 mikrolitre lizatı 96 kuyulu bir luminometre plakasındaki ilgili kuyucuğa aktarın. Daha sonra her birine 100 mikrolitre lusiferaz test kiti lusiferaz substratı ekleyin. Sonunda ateşböceği lusiferaz aktivitesini bir luminometrede ölçün.

Üreticinin bu deneydeki talimatlarına göre, monosit türevli makrofajlar, enfekte olmuş veya enfekte olmamış kırmızı kan hücrelerine maruz bırakıldı ve daha sonra NL dört üç blen ile enfekte edildi. Az önce gösterildiği gibi, viral protein P 24'ün üretimi daha sonra ELIZA tarafından HIV için bir P 24 hücresiz süpernatanlarda ilk viral enfeksiyonu takiben farklı zaman noktalarında izlendi. Parazitlerle önceden muamele edilmiş monosit türevli makrofajların süpernatında HIV bir P 24 kapsid proteini ile ölçüldüğü gibi, 12. günde viral partiküllerin salınımındaki önemli azalmaya dikkat edin.

Bu deneyde, monosit türevli makrofajlar, enfekte olmuş ve enfekte olmamış kırmızı kan hücrelerine maruz bırakıldı ve daha sonra gösterildiği gibi lusiferaz kodlu virüs ile enfekte edildi Luciferase ekspresyonu daha sonra enfeksiyondaki ilk virüsü takip eden 72 saat sonra hücre lizatında değerlendirildi. Monosit kaynaklı makrofaj enfeksiyonu, ekzojen VS barındıran bu tür virüslerle birlikte. VG veya HIV bir glikoproteinler, p yalancı sparına maruz kalan hücrelerde önemli ölçüde daha az lusiferaz üretimine yol açtı. VSSVG psödotipli partiküllerin daha yüksek enfeksiyon etkinliği nedeniyle, VSVG psödotipli virüslerin, muadillerinde JRFL'lerinden çok daha fazla lusiferaz aktivitesi vermesi dikkat çekicidir.

Bu teknik, sıtma, HIV ko-enfeksiyonları alanındaki araştırmacıların, bu iki patojen arasındaki etkileşimleri, çeşitli bağışıklık hücresi tiplerinin çalışmasına uyarlanabilen bir in vitro modelde keşfetmelerine olanak sağlayacaktır.