Name: Bir In vitro Co-enfeksiyon Modeli Plasmodium falciparum-HIV-1 Etkileşimleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Keşfedin, Plasmodium falciparum'ın insan monosit kaynaklı makrofajlarda HIV-1 replikasyonu üzerindeki etkilerini incelemek için geliştirilmiş bir in vitro ko-enfeksiyon modelini. Bu yöntem, sıtma ve HIV etkileşimlerini araştırmak için kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Catalyst Co-enfeksiyonlar ve Co-morbiditeler hibe yoluyla Sağlık Araştırması Kanada Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. İnsan eritrosit Merkezi Hospitalier de l&#39;Université Laval kan bankası tarafından temin edildi.

Not: HIV-1 ve Plasmodium falciparum ile deneyler uygun biyogüvenlik düzeyi laboratuarlarda yapılmalıdır (parazitler için BSL2 ve BSL3 HIV-1 ve ko-enfeksiyon) ve potansiyel enfekte insan kanı kullanırken özel önlem alınmalıdır. 1. Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) Arınma (8 ve 9 dayanarak) <ol><li> Antikoagülan (heparin, sitrat, asit sitrat, dekstroz ya sitrat fosfat dekstroz) ile muamele sağlıklı donörlerden (500 ml) taze insan kanı ile başlar. Arındırıcı ve tecrit PBMC ve protokol geri kalanı boyunca ne zaman endotoksin ücretsiz reaktifler kullanın. </li><li> % 70 etanol ile tüp dahil olmak üzere kan torbası, dezenfekte, tüpü kesip dikkatli bir T150 balona kan aktarın. </li><li> 50 ml konik tüp (Ficoll oda sıcaklığına ulaştığını emin olun) başına 15 ml Lenfositler Ayırma Orta (Ficoll) 16 tüpleri hazırlayın.Üstüne taze kan dikkatlice tabakası 30 ml. </li><li> 20 30 dakika için 400 xg&#39;de Santrifüj ° off sonları ile C. </li><li> Santrifüj içinde, tüp başına oda sıcaklığında Hank&#39;in dengeli tuz Çözelti (HBSS) 25 ml ile 8 x 50 ml konik bir tüp hazırlanır. </li><li> Dikkatle HBSS (tüp başına havuzu 2 hücre halkalar) içeren 50 ml tüp için arayüzünde bulutlu hücre halkası (PBMC içerir) aktarın. HBSS ile 50 ml&#39;ye birimleri tamamlayın. </li><li> 20 az 15 dakika boyunca 150 xg&#39;de Santrifüj ° molalar C. </li><li> Bulanık hücre halkasının santrifüjleme sırasında, Ficoll adımı, bir 50 ml konik bir tüp doldurmak için havuz plazmadan sarı bir üst katman toplayabilir. ° C&#39;de 30 dakika süre ile 1800 x g&#39;de 10 dakika dönmeye 56 at 50 ml tüp ısıtarak plazmada tamamlayıcı inaktive. Supernatant (aşamadan sonra orta takviyesi olarak kullanılabilir içeren seyreltilmiş otolog plazma) tutun. </li><li> Dikkatle süpernatan ve resuspen kaldırmakd 50 ml tüp başına HBSS ve havuz 2 pelet 25 ml adım 1.7 &#39;den hücre peleti. 20 ° C&#39;de 8 dk boyunca 300 xg&#39;de Spin </li><li> Dikkatle süpernatantı ve bir 50 ml tüp içinde 10 ml HBSS ve havuzdaki peletler tekrar süspansiyon. </li><li> , Bir kısım atın ölüm değerlendirmek için tripan mavi dışlama gerçekleştirmek ve sonra PBMC sayarız. </li><li> HBSS ve 300 x g hızında 10 dakika döndürme ile 50 ml tam hacim. Süpernatant kaldırmak ve (bir 500 ml kan 400-500 x 10 6 PBMC yaklaşık almalıdır) 5x10 6 hücre / ml &#39;de RPMI 1640 içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li></ol> 2. Monositler-Türetilmiş Makrofajlar (MDM) Farklılaşma (8 ve 9 dayanarak) <ol><li> RPMI 1640 (25 ml / çanak) ile 15 cm yemekleri Tohum yaklaşık 1.25 x 10 8 PBMC. </li><li> Hücreler% 5 CO2 atmosfer ile 37 ° C&#39;de 1-2 saat boyunca izin yapışır. </li><li> Yeni bir balon içerisinde olmayan yapışık hücreleri aktarın ve 15 ml endotoksin içermeyen PBS iki kez (5 plaka yıkayındak, 300 x g). Yapıştırılır hücreler izole monositler vardır. </li><li> Taze izole monositler MDM içine ayırt etmek için izin vermek için,% 5 otolog plazma (adım 1.8) ilave edilmiş RPMI 1640 ortamında, 20 ml ekleyin. Rekombinant insan makrofaj koloni stimüle edici faktör (M-CSF, 25 ng / ml) ve penisilin / streptomisin çözeltisi (PS, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin) eklenir. 2 gün boyunca inkübe, orta değiştirmek ve 37% 5 ° C CO 2 atmosferinde 2-3 ekstra gün inkübe edin. </li><li> Eski orta çıkarın ve endotoksin içermeyen PBS bir kez yıkayın, PBS yavaşça ekleyin ve hemen emdiriniz. Tamamen ayırt MDM ayırmak için, bir% 5 CO 37 ° C&#39;de 15-20 dakika için ~ 7 ml Accutase (Accutase, plastik çanak gelen hücrelerinin ayrılması izin proteaz ve kollajenolitik aktivitesinin bir ticari olarak temin karışımı) ile muamele hücreleri 2 atmosfer, orta zaman hafifçe sallayın. </li><li> (Hücrelerin korunmasına yardımcı olmak için ise her plaka 3-5 ml otolog plazma (Adım 1.8) ekle) kazıma. </li><li> Yavaşça orta 50 ml&#39;lik bir tüp içinde her zaman ve transfer / havuzda hücrelerini kapsayan emin hücreleri kazıyın. </li><li> Mümkün olduğunca çok hücre kurtarmak için endotoksin içermeyen PBS ile plakalar durulayın. </li><li> Süpernatant atmak, 200 xg&#39;de 5 dakika Spin. </li><li> 5 ml MDM kültür ortamı (RPMI 1640% 10 tamamlayıcı-inaktive edilmiş fetal bovin serumu (iFBS), PS, 25 mM HEPES ile desteklenmiş) ve sayım hücreleri (MDM toplam PBMC genellikle 2-8 verim:%) içinde Pastör pipetiyle pelet. Not: MDM bir kısım akım sitometri ile hücre popülasyonu saflık değerlendirmek için bu adımı alınabilecek; genellikle% 99 MDM ekspres CD14 aldı. </li><li> 24-iyi plaka iyi başına MDM kültür ortamı 600 ul Tohumculuk 1x10 5 MDM. </li><li> Enfeksiyonların önce bir% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de bir gece boyunca inkübe edilir. </li></ol> 3. HIV-1 viral Stoklar Üretim ve kantitasyonu <ol><li> HEK293T hücreleri Follo kalsiyum fosfat transfeksiyon kullanarak viral stoklar üretinFortin ve ark kanat protokolü. 10. </li><li> R pHCMV-G + ve 10 ug veya NL4.3 Luc 15 ug - ya NL4.3 Luc + Env 20 ug ile lusiferaz kodlama raportör genini içeren tek bir döngü virüsler, ko-transfekte HEK293T hücreler elde etmek için + Env - R + ve pJRFL env 15 g. + Kontrol glikoprotein eksikliği olan virüsler üretmek için Ar - NL4.3 Luc + Env 30 mikrogram kullanın. Tam replikatif virüsü için NL4.3Bal env 30 ug kullanın. Vektörler pHCMV-G ve pJRFL env sırasıyla, veziküler stomatit virüs zarf glikoprotein (VSV-G) kodlamak ve CXCR5-tropik HIV-1 (NL4.3Bal env farklı) bir. Plazmit ile ilgili ek bilgi 8 elde edilebilir. Plazmidler NIH AIDS Araştırma ve Referans Programı (NIAID, NIH) ile elde edilebilir. </li><li> HIV-1 p24 kapsid proteini 11 için ELISA yöntemi ile tüm viral stokları ölçmekVe kullanmadan önce bunların potansiyel bulaşıcı doğrulayın. Biz TZM-bl göstergesi hücrelerin 12 kullanımı yoluyla virüs stoklarının enfektivite değerlendirmek. </li></ol> 4. Plasmodium falciparum Parazitler Kültür (13 dayanarak) Parazitlerin 4.1 Genel kültür ve bakım <ol><li> P. koruyun % 0.5 (w / v) Albumax II, 25 ug / ml gentamisin ile takviye edilmiş RPMI 1640% 4&#39;lük bir hematokrit (25 mM HEPES ve 25 mM NaHCO 3 ile tamponlanmış) de, insan eritrositleri (O kan grubuna +) içinde falciparum 3D7 asexual aşaması parazitler 37 ve at 370μM Hipoksantin azot içinde% 1 oksijen /% 5 karbon dioksit gazı, bir karışımı içinde ° C. </li><li> Parazitemi kültürünün ince yayma yapma ve% 15 Giemsa solüsyonu ile boyanarak izlenebilir. </li><li> Parazitler bir kontrol olarak kullanmak için her zaman olduğu gibi aynı koşullarda bulaşmamış kırmızı kan hücreleri (uRBC) kültürü çanak tutmak. Geç dönem parasit elde etmek içines (trofozoit / erken şizont), aşağıdaki gibi parazitler senkronize: </li></ol> 4.2 Parazit senkronizasyon <ol><li> Sabah, 300 xg&#39;de, spin 5 dk parazit kültürü hasat ve supernatant atın. </li><li> % 5 (a / h) 37 ° D-sorbitol ve inkübe 5 dakika ile 5 ° C hematokrit in Pastör pipetiyle pelet </li><li> 300 x g hızında 5 dakika çevirin, 30 ml kültür ortamı içinde yüzen, Pastör pipetiyle pelet atmak ve inkübatör geri koyun. </li><li> Yaklaşık 8 saat sonra, tekrar sıkıca senkronize parazitleri almak için 4.2.3 4.2.1 adımları yineleyin. Geç evre parazitler (trofozoit / erken şizont) sonra deney gerçekleştirmek için ertesi sabah hasat edilebilir. Önce arıtma için, yaşam döngüsü aşamasında onaylamak için Giemsa boyama gerçekleştirin. </li></ol> 4.3 Plasmodium falciparum bulaşmış kırmızı kan hücreleri (iRBC) arıtma <ol><li> % 70 etanol ve p VarioMacs ayırıcı (stand ve mıknatıs) sterilizebiyolojik başlık altında dantel. </li><li> CS sütunun altına üç yollu Fix. </li><li> Miltenyi özel kesici iğne plastik koruyucusu sonunda kesin ve musluk altına iğne düzeltmek. </li><li> Dikkatli bir mıknatıs içine sütun kilitleyin. </li><li> Yavaş stopcock sol tarafında vidalı kiti-ekteki şırınga ile MDM kültür ortamı 10 ml enjekte edilerek sütundaki tüm hava kabarcıkları çıkarın. </li><li> ~ 20 ml MDM besiyeri ile sütun yıkayın. </li><li> Kültürü plakası ile hasat alyuvar, 10 ml MDM ortamı (300 x g, 5 dakika) ile bir kez yıka, 12 ml MDM kültür ortamında RBC pelletini. Yavaşça sütun eklemek ve (trofozoit veya şizont aşamada parazit içeren enfekte kırmızı kan hücreleri nedeniyle hemozoin kristallerinin varlığı manyetik alan tarafından muhafaza edilecektir) ile süspansiyon akmasına izin ver. </li><li> 20 ml besiyeri ile bir kez yıkayın ve sütun üstüne beyaz disk ulaştığında sıvı akışı durur. </li><li>12 ml MDM kültür ortamı ile temiz bir steril bir tüp içinde manyetik ve elüt edilmesi iRBC den Sütun çıkarın. </li><li> Smear, bir geri iRBC bir tablet ve Giemsa yaşam döngüsü aşamasında onaylamak için boyama gerçekleştirin. </li><li> Bir haemocytometer (izole RBC% 100 iRBC vardır) kullanılarak geri iRBC sayın. </li><li> Pelet hücreleri (300 xg, 5 dk), süpernatant atın ve 500 ul taze AB + insan serum (opsonisation adım 14) ile hücre tedavisi. </li><li> % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de 30 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Istenen konsantrasyonuna iRBC 10 ml MDM kültür ortamına (300 x g, 5 dakika), ve Pastör pipetiyle ile bir kez yıka. Genellikle,% 10 parazitemi 15 cm kültür çanak kabaca ~ 0.5-1x10 8 sıkıca senkronize iRBC verir. </li></ol> 5.. Plasmodium falciparum için MDM Pozlama <ol><li> 75:1 MDM: uRBC ya iRBC için MDM ortaya çıkarmak için, hücreler uRBC / iRBC bir oranı elde etmek için MDM kültür ortamı içinde tekrar süspanse edilmesi gerekir. Daha önce deMDM içeren hazırlanmış 24-iyi plakaları, her kuyuya uygun eritrosit süspansiyonu hacmi ekleyin. Üç nüsha halinde tüm deney yapın. </li><li> % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de 4 saat süreyle inkübe co-kültürler. </li><li> Endotoksin içermeyen PBS 3 kez 600 ul hücreleri yıkayın, hafifçe PBS ekleyin ve hemen emdiriniz. </li><li> Geriye kalan eritrosit lyse için, 20 sn ve aspirasyon için buz steril su, 200 ul ilave edilerek kuyu yıkanır. </li><li> 600 ul kültür ortamı MDM ekleyin ve bir 5% 2 CO atmosferinde 37 ° C &#39;de 24 saat inkübe edilir. </li></ol> 6. Bir Tam Replikatif HIV-1 ile MDM Enfeksiyon <ol><li> P. etkisini değerlendirmek için MDM HIV-1 çoğaltma falciparum, Şekil 1A, uygun kuyulara NL4.3Bal env virüslerin p24 ve 10 ng (MDM ortam 300 ul içinde) belirtilen şemasına göre, eklemek; kontrolü kuyu sadece orta MDM ekleme . </li><li> Bir 5 içinde 37 ° C&#39;de 2 saat inkübe% 2 atmosfer CO. </li><li> Endotoksin içermeyen PBS 3 kez hücre yıkayın, hafifçe PBS ekleyin ve hemen emdiriniz. De başına taze MDM orta 600 ul ekleyin. </li><li> % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Gün 3, 6, 9 ve 12 hasat daha sonra taze MDM orta 200 ul ekleyerek, her bir 200 ul süpernatan, viral enfeksiyonun başlangıç ​​takiben. Fortin ve ark. 10 takiben, ELISA ile büyük HIV-1 kapsid p24 proteini kantitatif için -20 ° C &#39;de hasat edilmiş süpernatanlar tutmak. </li></ol> 7. Tek Döngü Virüs Kodlama Lusiferaz ile MDM Enfeksiyon <ol><li> R + (- MDM HIV-1 gen ifadesi üzerindeki etkisi parazit belirlemek amacıyla, 10 ng p24 (MDM orta 300 ul içinde) NL4.3 Luc + Env birinin, Şekil 1B özetlenen şemasına göre, ekleme VSV-G), NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env) veya NL4.3 Luc +Env - ilgili kuyularda R + virüsler. </li><li> % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de 2 saat inkübe. </li><li> Endotoksin içermeyen PBS 3 kez 600 ul hücreleri yıkayın, hafifçe PBS ekleyin ve hemen emdiriniz. De başına taze MDM orta 600 ul ekleyin. </li><li> % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Orta 72 saat aşağıdaki enfeksiyonu temizlemek ve lizis tamponu 1X (lusiferaz kit ile birlikte) 200 ul ekleyin. Hücreler nazik çalkalama ile oda sıcaklığında lyse edelim. -20 ° C de saklayınız </li><li> Plaka çözülme ve 96-iyi luminometre plakasına lizatı 40 ul aktarmak; lusiferaz substrat 100 ul (lusiferaz kit ile birlikte) ekleyin ve üreticinin talimatlarına bir luminometreye lusiferaz (Ateşböceği lusiferaz) aktivitesini ölçmek. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar Co-enfeksiyon modeli kullanarak, bu exposur göstermekP. e MDM için falciparum HIV-1 enfeksiyonu onların duyarlılık azalır. Gerçekten de, önemli bir azalma (p &lt;0.05; 2 yönlü ANOVA, günde 12) olarak süpernatant HIV-1 p24 kapsid proteini ile ölçülen viral parçacıkların, sürümünde, parazitler (Şekil 2A) ile ön tedavi MDM görülmektedir. Bu gözlem, bir lusiferaz-raportör gen kodlayan virüsler tarafından enfekte olmuş hücrelerin içinde onaylanır. Eksojen VSV-G veya HIV-1 glikoprotein ya barındıran bu tür virüsleri ile MDM enfeksiyonu P. maruz kalan hücrelerdeki düşük (p &lt;0.05, Student t-testi) daha az lusiferaz üretime yol açar falciparum (Şekil 2B). Bu VSV-G-pseudotyped virüsler bunların JRFLenv muadilleri den çok daha büyük lusiferaz aktivitesi vermiştir dikkati çekmektedir; Bu VSV parçacıkları-G pseudotyped 15 arasında daha büyük verimlilik enfeksiyonu nedeniyle. Parazit fuar MDM etkileri virüsler, her iki tür, bu viral gen eski bazı adımı etkilediğini düşündürmektedir göz önüne alındığındapression (Şekil 2B). Bu kadar hücre canlılığı gözlenen inhibisyon hücre ölüm nedeniyle belli değil, belirten, iRBC (veriler gösterilmemiştir) MDM fuar etkilenmedi söz etmek de önemlidir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig1.jpg" /> Şekil 1.. Tam replikatif virüs MDM enfeksiyonu için) Levha şeması Mock:. Olmayan hücrelerde. uRBC: Enfekte olmayan kırmızı kan hücreleri maruz kalan hücreler. iRBC: Plasmodium falciparum bulaşmış kırmızı kan hücrelerinin maruz kalan hücreler. Bal:. NL4.3Bal env Bal / uRBC ile enfekte hücreler: Hücre uRBC maruz kalan ve NL4.3Bal env Bal / iRBC ile enfekte:.. MDM enfeksiyon için iRBC ve NL4.3Bal env B ile enfekte maruz kalan hücreleri) Levha şeması ile tek çevrim lusiferaz kodlama virüs Mock:. olmayan hücrelerde. uRBC: Enfekte olmayan kırmızı kan hücreleri maruz kalan hücreler. iRBC: hücreleri Plasmodium falciparum-i maruzkırmızı kan hücreleri nfected. Δenv: NL4.3 Luc + Env ile enfekte olmuş hücreler - R + JRFL:. NL4.3 Luc + Env ile enfekte olmuş hücreler - R + (env JRFL). vsv-g: NL4.3 Luc + Env ile enfekte olmuş hücrelerin - R + (vsv-g) Δenv / uRBC:.. hücreleri uRBC maruz kalan ve NL4.3 Luc + Env-R + Δenv / iRBC ile enfekte: hücreleri iRBC maruz ve NL4.3 Luc + Env ile enfekte - R + JRFL / uRBC: uRBC maruz kalan ve NL4.3 Luc + Env ile enfekte olmuş hücrelerin - R + (JRFL env.). JRFL / iRBC: iRBC maruz kalan ve NL4.3 Luc + Env ile enfekte olmuş hücrelerin - R + (JRFL env). vsv-g/uRBC: uRBC maruz kalan ve NL4.3 Luc + Env ile enfekte olmuş hücrelerin - R + (vsv-g) vsv-g/iRBC:. hücreleri iRBC maruz kalan ve NL4.3 Luc + Env ile enfekte - R + (VSV-g). <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig2.jpg"/&gt; Şekil 2. . 4 saat MDM) ve yaygın yıkanmış: A MDM HIV-1 viral üretim Plasmodium falciparum ile) Etkisi MDM bir oran 75:1 (uRBC / iRBC az uRBC veya iRBC maruz bırakıldı. Hücreler 2 saat boyunca p24 NL4.3Bal env 10ng ile enfekte edilmiştir. Viral üretimi başlangıç ​​viral enfeksiyon sonrası farklı zaman noktalarında hücre içermeyen yüzer kısım, HIV-1 p24 için ELISA ile takip edildi. . Bir temsilci deney MDM HIV-1 viral transkripsiyon üzerine Plasmodium falciparum B) etkisi gösterilmiştir MDM bir oran 75:1 (uRBC / iRBC az uRBC veya iRBC ile enfekte edildi. MDM). Luc + Env R + (JRFL env) veya NL4.3 - - R +, NL4.3 Luc + Env - Hücreler daha sonra tek çevrim virüs p24 ile 10ng (ya NL4.3 Luc + Env ile enfekte olan R + (vsv- g)). Lusiferaz ifade hücre ilk virüs enfeksiyonunu takiben 72 saat lizatları değerlendirildi. Temsili bir deneyde gösterilmiştir.

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22World+Malaria+Report%22">World Malaria Report</a>. , (2005).</li>
<li>Kublin, J. G., Patnaik, P., Jere, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Plasmodium+falciparum+malaria+on+concentration+of+HIV-1-RNA+in+the+blood+of+adults+in+rural+Malawi%3A+a+prospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study.</a> Lancet. 365, 233-240 (2005).</li>
<li>Cuadros, D. F., Branscum, A. J., Crowley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-malaria+co-infection%3A+effects+of+malaria+on+the+prevalence+of+HIV+in+East+sub-Saharan+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">HIV-malaria co-infection: effects of malaria on the prevalence of HIV in East sub-Saharan Africa.</a> Int. J. Epidemiol. 40, 931-939 (2011).</li>
<li>Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+antigen-induced+human+immunodeficiency+virus+type+1+replication+is+mediated+through+induction+of+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha.</a> J. Infect. Dis. 177, 437-445 (1998).</li>
<li>Froebel, K., Howard, W., Schafer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+by+malaria+antigens+renders+mononuclear+cells+susceptible+to+HIV+infection+and+re-activates+replication+of+endogenous+HIV+in+cells+from+HIV-infected+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activation by malaria antigens renders mononuclear cells susceptible to HIV infection and re-activates replication of endogenous HIV in cells from HIV-infected adults.</a> Parasite Immunol. 26, 213-217 (2004).</li>
<li>Diou, J., Tardif, M. R., Barat, C., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+derived+from+hemozoin-loaded+monocytes+display+a+partial+maturation+phenotype+that+promotes+HIV-1+trans-infection+of+CD4%2B+T+cells+and+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells derived from hemozoin-loaded monocytes display a partial maturation phenotype that promotes HIV-1 trans-infection of CD4+ T cells and virus replication.</a> J. Immunol. 184, 2899-2907 (2010).</li>
<li>Diou, J., Tardif, M. R., Barat, C., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+hemozoin+modulates+susceptibility+of+immature+monocyte-derived+dendritic+cells+to+HIV-1+infection+by+inducing+a+mature-like+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Malaria hemozoin modulates susceptibility of immature monocyte-derived dendritic cells to HIV-1 infection by inducing a mature-like phenotype.</a> Cell Microbiol. 12, 615-625 (2010).</li>
<li>Diou, J., Gauthier, S., Tardif, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingestion+of+the+malaria+pigment+hemozoin+renders+human+macrophages+less+permissive+to+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Ingestion of the malaria pigment hemozoin renders human macrophages less permissive to HIV-1 infection.</a> Virology. 395, 56-66 (2009).</li>
<li>Davies, J. Q., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human macrophages.</a> Methods Mol. Biol. 290, 105-116 (2005).</li>
<li>Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-derived+ICAM-1+glycoproteins+incorporated+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+are+biologically+active+and+enhance+viral+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity.</a> J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).</li>
<li>Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+host+ICAM-1+in+laboratory+and+clinical+strains+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+increases+virus+infectivity+and+CD4%28%2B%29-T-cell+depletion+in+human+lymphoid+tissue%2C+a+major+site+of+replication+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo.</a> J. Virol. 76, 1004-1014 (2002).</li>
<li>Wei, X., Decker, J. M., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+resistant+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+patients+receiving+fusion+inhibitor+%28T-20%29+monotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).</li>
<li>Trager, W., Jensen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+malaria+parasites+in+continuous+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human malaria parasites in continuous culture.</a> Science. 193, 673-675 (1976).</li>
<li>Turrini, F., Ginsburg, H., Bussolino, F., Pescarmona, G. P., Serra, M. V., Arese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-infected+human+red+blood+cells+by+human+monocytes%3A+involvement+of+immune+and+nonimmune+determinants+and+dependence+on+parasite+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected human red blood cells by human monocytes: involvement of immune and nonimmune determinants and dependence on parasite developmental stage.</a> Blood. 80, 801-808 (1992).</li>
<li>Akkina, R. K., Walton, R. M., Chen, M. L., Li, Q. X., Planelles, V., Chen, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+CD34%2B+cells+with+a+human+immunodeficiency+virus+type+1-based+retroviral+vector+pseudotyped+with+vesicular+stomatitis+virus+envelope+glycoprotein+G%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into CD34+ cells with a human immunodeficiency virus type 1-based retroviral vector pseudotyped with vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein G.</a> J. Virol. 70, 2581-2585 (1996).</li>
<li>Zhao, C., Papadopoulou, B., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+infantum+enhances+human+immunodeficiency+virus+type-1+replication+in+primary+human+macrophages+through+a+complex+cytokine+network%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunol%22%5BJournal%5D)">Leishmania infantum enhances human immunodeficiency virus type-1 replication in primary human macrophages through a complex cytokine network.</a> Clinical Immunol. 113, 81-88 (2004).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz viral gen ekspresyonu veya monosit kökenli makrofajlar döl virüs üretim ve çoğaltma ya da analiz ederek, HIV-1 viral döngüsü, yani üzerinde sıtma parazit etkisini analiz etmek için burada iki farklı yaklaşım gösterdik. Bu yaklaşım, diğer HIV-1-parazit co-enfeksiyonların 16 için kullanılmıştır. Ancak, bu yeni veriler sıtma, HIV-1 co-enfeksiyonların soruşturma ileri bir adımdır. . Nitekim, Diou ark 8 HIV-1 çoğaltma hemozoin etkisi, canlı değil parazitler, okudu; bizim sonuçlarımız ile anlaşarak, onlar MDMs hemozoin MDM viral üretimini önlemek için tek başına yeterli olduğu gözlendi, değil. Açıklanan deney düzeni kullanarak, gözlenen P. falciparum makrofajlarda HIV-1 replikatif döngüsü net bir zararlı etki gösterir: viral üretimin önemli bir inhibisyon makrofajlar parazitleri için önceden maruz görülmektedir (Figüre 2A) ve viral transkripsiyon üzerine parazit belirli bir etkisi Şekil 2B &#39;de gösterilmiştir. Ancak, viral giriş veya füzyon üzerinde parazit Ek etkileri (decapsidation), ya da protein sentezi veya viral partikül montaj ve tomurcuklanma gibi post-entegrasyon mekanizmalarının üzerinde terk edemez. Dahası, parazit virüs ile de aynı zamanda ya da aşağıdaki MDM enfeksiyon ya da ilave edildi halinde HIV-1 replikasyon üzerinde farklı bir etki elde edilebilir olasıdır. Bizim in vitro ko-enfeksiyon modelinde HIV-1 / P. detaylı incelemeler gerçekleştirmek için güçlü bir araç sağlar konak hücre içinde falciparum etkileşimleri. Örneğin, hedef ve viral retrotranscription ve konak hücrenin genomu için viral genomun entegrasyon spesifik basamakları ölçmek için niceliksel gerçek zaman PCR, diğer teknikler ile, bu deney düzeni kombinasyonu oldukça mümkün olan ve daha da insi vermelidirco-enfeksiyonları dahil mekanizmalarına ghts. Ayrıca, özel testler ile viral replikasyon üzerindeki etkisini analiz etmek için bu temel protokolü uygulanabilir viral döngüsü (viral füzyon, decapsidation, giriş kantitatif) erken adımları değerlendirmek. Hatta çok standart HIV-1 revers transkriptaz kantitatif testler tasavvur HIV-1 p24 için ELISA yerini alabilir trityum etiketli nükleotidleri kullanarak: Bu değişiklikler bu protokol, HIV-1 kantitatif ve algılama ile ilgili nasıl esnek göstermektedir. MDM ek olarak, bizim sistemin diğer hücre türleri, monositler ve dendritik hücreler gibi HIV-1-sıtma etkileşimleri, ilgili adapte olmasını bekliyoruz. MDM yapışmış olan hücrelerin olması, herhangi bir makrofajlar ortadan kaldırmadan, içinde alınmadığı veya MDM ile temas halinde olduğunu iRBC dışarı yıkama kolay izin veren, onların manipülasyon kolaylaştırır. Böyle bir avantaj se komplike, süspansiyon kültürlenmiştir dendritik hücreler ve monositler için geçerli değildirBu tür hücre ve şu anda bu sorunu ele alıyor ile uRBC ve ücretsiz iRBC elde edilmesine. Sistemimizde, aynı zamanda bu gibi co-kültürü deneylerinde CD4-pozitif T-hücreleri gibi diğer bağışıklık hücreleri, HIV-1 viral döngüsünde Plasmodium-maruz monosit-türetilmiş hücrelerden etkiler gibi daha karmaşık etkileşimler incelemek için yararlı olabilir. Son olarak, iletişim kuralı P. etkisini bakarak deneyler için uygun olabilecek HIV-1 ile enfekte bireyler için PBMC HIV-1 reaktivasyonu üzerine falciparum iRBCs. Etik beyanı İnsan PBMC Merkezi Hospitalier de l&#39;Université Laval Araştırma Merkezi Biyoetik Komitesi kurallarına uygun olarak, sağlıklı donörlerin kan elde edildi. Bir yazılı izni tüm kan vericilerden elde edildi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Çok hücreli </td><td> 350-000-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS-endotoksin ücretsiz </td><td> Sigma </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Wisent </td><td> 080-150 </td><td> 30 dakika boyunca 56 ° C&#39;de ısıyla inaktive edilmiş </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4555-56 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax II </td><td> Gibco </td><td> 11021-037 </td><td> RPMI 1640 içinde çözülmüş, filtre ile sterilize </td></tr><tr><td> Lenfosit ayırma orta </td><td> Çok hücreli </td><td> 305-010-CL </td><td></td></tr><tr><td> Beyaz luminometre plakaları </td><td> Promega </td><td> Z3291 </td><td></td></tr><tr><td> CS Mac&#39;ler ayırma columms </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-041-305 </td><td></td></tr><tr><td> VarioMacs ayırıcı </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-090-282 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin solüsyonu </td><td> Wisent </td><td> 450-201-EL </td><td></td></tr><tr><td> D-sorbitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S1876 </td><td></td></tr><tr><td> Hücre kazıyıcı (25 cm) </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1830 </td><td></td></tr><tr><td> 24-İyi Hücre Kültür Tabaklar </td><td> BD Falcon </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 150 x 20 mm kültür kaplarına </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td></td></tr><tr><td> M-CSF </td><td> Genscript </td><td> Z02001 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan serum AB + </td><td> Vadi Biyomedikal </td><td> HP1022 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Wisent </td><td> 311-505-CL </td><td></td></tr><tr><td> Gentamisin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1397 </td><td></td></tr><tr><td> Hipoksantin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9636 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> Lusiferaz Test Sistemi </td><td> Promega </td><td> E1500 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan kırmızı kan hücreleri </td><td></td><td></td><td> Elde edilen Chul kan bankası arınmış. </td></tr></tbody></table>

bir<em&gt; in vitro</emokumak&gt; co-enfeksiyon modeli<em&gt; plasmodium falciparum</emİnsan İlköğretim monosit kökenli bağışıklık hücrelerde&gt;-hiv-1 etkileşimleri

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, sıtma ölümcül formu etkeni ve insan immün yetmezlik virüsü tip-1 (HIV-1) yılda 1 4 milyon ölümlerin toplam sorumlu olmak, dünyadaki en önemli sağlık sorunları arasındadır. Özellikle gelişmekte olan bölgelerde, Sahra-altı Afrika&#39;da, sıtma ve HIV-1 ile ortak enfeksiyonları sık görülür, ama iki hastalık arasındaki etkileşim içinde onların geniş örtüşme nedeniyle yeterince bilinmemektedir. Epidemiyolojik raporları sıtma enfeksiyonu geçici HIV-1 replikasyonunu artırır ve co-enfekte kişilerde 2,3 HIV-1 viral yükü artırdığını ileri sürmüşlerdir. Bu viremi antimalaryaller tedavisinden sonra birkaç hafta boyunca yüksek kalır çünkü, bu fenomeni hastalığın ilerlemesini ve şanzıman üzerinde bir etkisi olabilir. Bu gözlemlerin arkasında hücresel immunolojik mekanizmalar güçlükle çalışılmıştır. In vitro çalışmalar investig içinde birkaçHIV-1 sıtma etkisi ating çözünür sıtma antijenlere maruz bağışıklık hücreleri, HIV-1 enfeksiyonu ve reaktivasyonu artırabilir göstermiştir. Ancak bu çalışmalar P. tam hücre ekstreleri kullanılır falciparum şizont sahne parazitler ve periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC), sıtma bileşen (ler) gözlenen etkileri ve ne hedef ana hücreleri 4,5 olduğu için sorumlu olduğu deşifre etmek zorlaşacak. Son çalışmalar bu makrofajların 8 HIV-1 enfeksiyonu azaldığı sıtma pigment hemozoin için olgunlaşmamış monosit türevli dendritik hücreler maruz CD4 + T hücreleri 6,7 HIV-1 aktarabilme yeteneğine arttırdı, ama oldu. Bu karmaşık süreç, sıtma parazit ve farklı ilgili insan birincil hücre popülasyonlarının HIV-1 arasındaki etkileşimin sistematik bir analizini ışık tutacak eleştirel gereklidir. H etkisini araştırmak için çeşitli tekniklerMikro-organizma fagositozunu ve HIV-1 replikasyon böyle patojenlerin etkisi IV-1 tarif edilmiştir. Burada P. etkilerini araştırmak için bir yöntem sunmak insan birincil monosit kökenli makrofajlar HIV-1 çoğaltma falciparum-enfekte eritrosit. Enfekte makrofajlar tarafından yayımlanan virüs miktarına etkisi ölçülerek belirlenir ise, HIV-1 transkripsiyon / translasyon olayları parazit maruz kalmanın etkisi bir lusiferaz raportör gen Env gen yerini aldığı tek çevrim pseudotyped virüsler kullanılarak izlenir Hücre süpernatanlar ELISA ile p24 HIV-1 kapsid proteini.

Biz geliştirdik<em&gt; In vitro</emEtkisini incelemek için&gt; sıtma, HIV-1 ko-enfeksiyon modeli<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Insan birincil monosit kökenli makrofajlar HIV-1 replikatif çevrimi. Bu çok yönlü sistem kolayca HIV-1 enfeksiyonu duyarlı diğer birincil hücre tiplerine adapte edilebilir.

Bir<em&gt; In vitro</emOkumak&gt; Co-enfeksiyon Modeli<em&gt; Plasmodium falciparum</emİnsan İlköğretim Monosit kökenli Bağışıklık Hücrelerde&gt;-HIV-1 Etkileşimleri

Sıtmanın en ölümcül formuna neden olan etken Plasmodium falciparum ve insan immün yetmezlik virüsü tip-1 (HIV-1), en önemli ... arasındadır.

Bu prosedürün genel amacı, plasmodium falciparum enfekte eritrositlerin, insan primer monosit kaynaklı makrofajlarda HIV-1 replikasyonu üzerindeki etkilerini incelemek için bir in vitro model geliştirmektir. Bu işlem, öncelikle veac sistemini kullanarak plasmodium falciparum enfekte kırmızı kan hücrelerinin izole edilmesi ve ardından insan monosit kaynaklı makrofajların bu enfekte hücrelere maruz bırakılmasıyla gerçekleştirilir. Sonrasında, kırmızı kan hücrelerine maruz kalmış monosit kaynaklı makrofajlar, tam replikatif HIV veya tek replikasyonlu lüsiferaz kodlayan HIV ile enfekte edilir.Son olarak, tam replikatif virüs ve lusiferaz kodlayan virüs için enfeksiyondan sonraki 3, 6, 9 ve 12. günlerde kültür süpernatantları toplanır. Enfekte hücreler, enfeksiyondan 72 saat sonra lize edilir. Nihayetinde, viral replikasyon süpernatantlardaki HIV-1 p24 kapsid proteini miktarının ELISA ile belirlenmesiyle; viral transkripsiyon ise hücre lizatlarının lusiferaz kantifikasyonuyla takip edilebilir.Bu yöntem, sıtma ve HIV koenfeksiyonları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, plasmodium paraziti enfeksiyonu HIV replikasyonunu nasıl etkiler? Bu yöntem, makrofajlarda plasmodium ve HIV arasındaki etkileşimleri incelemek için geliştirilmiş olsa da, diğer hücre tiplerine de uygulanabilir.Örneğin, dendritik hücreler, monositler veya CD4 T hücreleri kullanılarak prosedürün gösterimi, laboratuvarda doktora sonrası araştırmacı olan Guadalupe Andreani tarafından gerçekleştirilecektir. Kültür plağından eritrositleri toplayarak başlayın, geri kazanılan hücreleri 10 mL monosit türevli makrofaj ortamında yıkayın ve ardından pellet'i 12 mL monosit türevli makrofaj kültür ortamında yeniden süspanse edin. Şimdi hücre süspansiyonunu bir Milton ECS kolonuna yavaşça ekleyin ve süspansiyonun akmasına izin verin; kolonu taze ortamla bir kez yıkadıktan sonra mıknatıstan ayırın ve 12 mL monosit türevli makrofaj kültür ortamı ile yıkayın.Enfekte eritrositleri steril bir tüpe süzerek monosit kaynaklı makrofajları enfekte veya enfekte olmamış eritrositlerle karşı karşıya getirmek için besiyerini kolondan geçirin. Daha önce hazırlanmış, monosit kaynaklı makrofajlar içeren 24 kuyucuklu plakadaki her bir kuyucuğa uygun eritrosit süspansiyon hacmini ekleyin. Ko-kültürleri 37 °C'de %5 karbondioksit içeren ortamda inkübe edin; dört saat sonra eritrositler içeren besiyerini uzaklaştırın ve ardından her bir kuyucuğa nazikçe 600 µL endotoksin içermeyen PBS ekleyip her yıkama sonrası PBS'yi hemen aspire ederek bu işlemi üç kez tekrarlayın.Şimdi, eritrositleri liz etmek için her kuyucuğa 200 µL buz gibi soğuk, steril su ekleyin ve 20 saniye sonra suyu aspire edin. Ardından, her kuyucuğa 600 µL monosit türevli makrofaj kültür ortamı ekleyin ve kültürleri 37 °C ve %5 CO2 ortamında 24 saat inkübe edin. Plasmodium falciparum'un monosit türevli makrofajlarda HIV-1 replikasyonu üzerindeki etkisini değerlendirmek için, bu şekilde gösterilen protokole benzer şekilde, uygun kuyucuklara NL4-3 BO HIV-1 virüslerinden p24 içeren 300 µL monosit türevli makrofaj ortamı ekleyin.Ko-kültürleri iki saat boyunca inkübe ettikten sonra, hücreleri üç kez 600 µL endotoksin içermeyen PBS ile yıkayın. Ardından, her kuyuya 600 µL taze monosit kaynaklı makrofaj medyumu ekleyin ve ko-kültürleri 3, 6, 9 ve 12. günlerde inkübe etmeye devam edin. İlk viral enfeksiyondan sonra, her kuyucuktan 200 µL süpernatant toplayın ve toplanan hücre süspansiyonunu 200 µL taze monosit kaynaklı makrofaj medyumu ile değiştirin. Daha sonra, toplanan süpernatantları ELISA ile daha sonra analiz edilmek üzere -20 °C'de saklayın.Parazitin monosit türevli makrofajlarda HIV-1 gen ekspresyonu üzerindeki etkisini belirlemek için, burada gösterilen protokollere benzer şekilde, ilgili kuyucuklara luciferase ENC kaplı hedef virüsün P 24'ünü içeren 300 µL monosit türevli makrofaj besiyeri ekleyin. Luciferase ENC kaplı olmayan virüs için gösterildiği gibi ko-kültürleri inkübe edip yıkadıktan sonra, enfeksiyondan 72 saat sonra besiyerini uzaklaştırın ve 200 µL luciferase assay hit lizis tamponu ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında hafifçe çalkalayarak lizleyin ve ardından ko-kültürleri -20 °C'de saklayın.Plaka çözündürdükten sonra, her kuyucuktan 40 µL lizatı 96 kuyucuklu bir lüminometre plakasındaki karşılık gelen kuyucuğa aktarın. Ardından, her birine lüsiferaz analiz kiti lüsiferaz substratından 100 µL ekleyin. Son olarak, ateş böceği lüsiferaz aktivitesini bir lüminometrede ölçün.Bu deneydeki üretici talimatlarına göre, monosit türevli makrofajlar enfekte veya enfekte olmamış eritrositlere maruz bırakılmış ve ardından NL4-3 suşu ile enfekte edilmiştir. Az önce gösterildiği gibi, viral protein P24 üretimi, başlangıç viral enfeksiyonunu takiben farklı zaman noktalarında hücre içermeyen süpernatantlarda HIV-1 P24 ELİSA yöntemi ile izlenmiştir. Parazitlerle ön işlem görmüş monosit türevli makrofajların süpernatantında HIV-1 P24 kapsid proteini ile ölçülen viral partikül salınımındaki 12. gündeki belirgin azalmaya dikkat edin.Bu deneyde, monosit kaynaklı makrofajlar enfekte ve enfekte olmamış kırmızı kan hücrelerine maruz bırakılmış ve ardından, az önce gösterildiği gibi lüsiferaz kodlayan virüs ile enfekte edilmiştir. Lüsiferaz ekspresyonu, ilk virüs enfeksiyonundan 72 saat sonra hücre lizatında değerlendirilmiştir. Ekzojen VSVG veya HIV-1 glikoproteinleri taşıyan bu tür virüslerle monosit kaynaklı makrofajların enfekte edilmesi, p-false spar'a maruz kalan hücrelerde anlamlı derecede daha az lüsiferaz üretimine yol açmıştır. VSVG psödotipli virüslerin, VSVG psödotipli partiküllerin daha yüksek enfeksiyon verimliliği nedeniyle, JRFL-1 karşılıklarından çok daha yüksek lüsiferaz aktivitesi sağladığı dikkat çekicidir.Bu teknik, sıtma ve HIV ko-enfeksiyonları alanındaki araştırmacıların, çeşitli bağışıklık hücresi tiplerinin çalışılmasına uygun bir in vitro modelde, bu iki patojen arasındaki etkileşimleri incelemelerine olanak sağlayacaktır.

an-vitro-co-infection-model-to-study-plasmodium-falciparum-hiv-1

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Seçimi Plasmodium falciparum İnsan Beyninin endotel hücreleri Cytoadhesion için Parazitler

Bu video, insan rahim mukozal dokusunun insan immün yetmezlik virüsü tip 1, HIV-1 ile ex vivo enfeksiyonunu ve bunların hava-sıvı arayüzünde jelatin süngerlerin üzerinde bakımını göstermektedir. Bu yöntem, insan dokularında HIV-1 replikasyonunun ve patogenezinin izlenmesine izin verir.

Ex Vivo Koşullarda HIV Patogenezini İncelemek için Bir İnsan Servikal Mukoza Enfeksiyonu Modeli

Bu video, in vitro sıtma-HIV ko-enfeksiyon hücre kültürü modelinin oluşturulmasını göstermektedir. Plasmodium falciparum parazitize eritrositlerle birlikte kültürlenen HIV ile enfekte periferik kan mononükleer hücreleri, potansiyel olarak birbirlerinin büyümesini destekler ve HIV ve sıtma ko-enfeksiyonlarında bağışıklık tepkileri ve hastalığın ilerlemesi hakkında bilgi sağlar.

Sıtma-HIV Ko-Enfeksiyonunun İn Vitro Hücre Kültürü Modelinin Oluşturulması

İnsan solunum sinsityal virüsü (HRSV) küçük bebeklerde ciddi bronşiyolite neden olabilir. Şiddetli HRSV hastalığının patogenezinin bir kısmı, konakçı immün yanıtından kaynaklanır. Primer insan bağışıklık hücrelerinin HRSV ile uyarılması, enflamatuar yolların ve enfeksiyonun aktivasyonunu incelemek için hızlı ve tekrarlanabilir bir model sistem sağlar.

İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin İnsan Solunum Sinsityal Virüs Enfeksiyonuna İmmün Tepkilerini İncelemek İçin Bir İn vitro Model

Hücre içermeyen HİV-1 parçacıklarına farklı olarak, enfekte olmuş CD4 + T hücrelerinin etkili bir plazmasitoid dendritik hücreler (PDC) ile algılanır. Bu yazıda tip I IFN serbest bırakılması ile değerlendirilen periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) ya da izole edilmiş bir PDC pDC'lerde ile doğuştan gelen algılamayı değerlendirmek için, HIV-1 ile enfekte edilmiş T hücreleri ile birlikte-kültür, bir yöntem tarif eder.

HIV-1 Enfekte CD4 Doğuştan Algılama Değerlendirilmesi<sup&gt; +</sup&gt; Bir kullanılması plazmositoid dendritik hücreler tarafından T Hücreleri<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-kültür sistemi.

İnsan ko-enfeksiyonunun in vitro olarak çoğaltılması zordur. Bununla birlikte, insan sıtma parazitleri, doğal olarak HIV ile enfekte olmuş taze izole edilmiş insan periferik kan mononükleer hücreleri gibi, in vitro olarak kolayca kültürlenebilir. Bu, HIV ko-enfeksiyonu bağlamında sıtma parazitlerine karşı erken bağışıklık tepkilerini incelemek için mükemmel bir model sağlar.

Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; HIV Co-enfeksiyon Bağlamında Sıtma için Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Modeli

Bu protokol, HIV enfeksiyonuna karşı kök hücre tabanlı tasarlanmış bağışıklığa sahip insanlaştırılmış bir kemik iliği/karaciğer/timus fare modeli oluşturma yöntemlerini açıklar.

Insanlaşmış Fare Modelinde HIV enfeksiyonuna karşı kök hücre Tabanlı Engineered Bağışıklık

İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) ex vivo insan kurcalayarak enfeksiyon virüs Patogenez değerli bir 3D modeli sağlar. Burada, işlemek ve doku örnekleri insan bademcikler ve kadın genital mucosae HIV-1 enfekte ve kültür sıvı-AIR arabirimiyle, proje için bir protokol açıklayın.

Ex Vivo İnsan lenfoid doku ve erkek Genital mukoza insan immün yetmezlik virüsü 1 ve Histoculture ile enfeksiyonun

Burada sunulan izole etmek için optimize edilmiş bir protokoldür, culturing, transfecting, ve HIV enfekte bireyler ve sağlıklı kontroller insan birincil monositayırt.

Birincil İnsan Monositlerinin İzolasyon, Transfeksiyon ve Kültürü

Burada, enfeksiyonun kan aşamasında Plasmodium'a hücresel bağışıklık mekanizmalarını aydınlatmaya yardımcı olacak yeni bir yöntem tarif ediyoruz. Bu, sitotoksik lenfositler tarafından enfekte kırmızı kan hücresi öldürmeyi ölçen in vitro bir testtir.

In Vitro Sitotoksik Lenfositler Tarafından Plazmodyum ile Enfekte Kırmızı Kan Hücresi Öldürme Testi

Bu protokol, EcoHIV enfeksiyonunun Tmem119-EGFP fareleri ile kombinasyonunun, HIV ile ilişkili nörobilişsel bozuklukların kemirgen modellerinde mikroglial değişiklikleri ve viral rezervuarları araştırmak için nasıl değerli bir biyolojik sistem sunduğunu açıklar.

Mikroglia ile Manipüle Edilmiş Transgenik Farelerde EcoHIV ile Enfekte Hücrelerin Tanımlanması

Keşfedin, Plasmodium falciparum'ın insan monosit kaynaklı makrofajlarda HIV-1 replikasyonu üzerindeki etkilerini incelemek için geliştirilmiş bir in vitro ko-enfeksiyon modelini. Bu yöntem, sıtma ve HIV etkileşimlerini araştırmak için kullanılabilir.

Bir

Daha fazla video keşfet