Tüm ex vivo ekimi ise, Gelişmekte Drosophila Brains

Bu prosedürün genel amacı, gelişmekte olan drosophila, larva ve pupil beyinlerinin tamamını ex vivo bir ortamda kültürlemektir. Bu, önce uygun aşama drosophila, larva ve pupi'nin tanımlanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, beyinler hızlı bir şekilde parçalara ayrılır.

Daha sonra beyinler, 25 santigrat derecede gerekli süre boyunca kültürlenir. Son olarak, kültürlenmiş beyinler sabitlenir, boyanır, monte edilir ve görüntülenir. Sonuç olarak, sonuçlar, oph mantarı gövdesinin in vivo gelişimini bir ex vivo kültür tekniği ile taklit etmenin mümkün olduğunu göstermektedir.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, artık drosophila mantar gövdesindeki in vivo fenotipleri ex vivo kültür ortamında taklit edebilmemiz ve bu da gelişimsel sürecin dinamiklerinin yüksek çözünürlüklü analizine izin vermesidir. Taze hazırladıktan sonra, ortamı insülin ile tamamlayın ve Dyson'ı 500 mikrolitrede ilaç tedavisi için ek parçalı 12 milimetrelik bir hücre kültürü kabına uygulayın. Her biri 100 mikromolar Rosco battin ve oli moin ile komple ortam hazırlayın.

Bir diseksiyona az miktarda orta ekleyin. Küçük bir spatula kullanarak camı izleyin, dolaşan üçüncü instar larvalarını toplayın ve onları saat camına yerleştirin. Daha sonra, forseps kullanarak larvaların arka ucunu tutun.

Daha sonra beş numara forseps ile ön ucu dikkatlice açın, ventral sinir kordonunu sağlam tutarak beyni hızla inceleyin. Önceden ıslatılmış pipet uçlarını kullanarak, beyni önceden hazırlanmış hücre kültürü kabına dikkatlice aktarın. Sonra, ıslak bir oda yapın ve tabağı odanın içine yerleştirin.

Öğrenci beyinlerini kültürlemek için beyni 25 santigrat derecede 48 saate kadar kuluçkaya yatırın. Şişelerde beyaz puy işaretleyerek başlayın. Bu aşamayı ER oluşumundan sıfır saat sonra veya 1.5 saatte bir PF olarak kaydedin.

Bir PF Ekli 12 milimetrelik bir hücre kültürü kabına 500 mikrolitre tam ortam ekleyin. Bir diseksiyon saat camına az miktarda hazırlanmış ortam ekleyin. Ardından, küçük bir ıslak spatula kullanarak, daha önce diseksiyon için işaretlenmiş KKD'leri alın ve saat camına yerleştirin.

Soldaki beyaz pupi sıfır zaman noktasıdır ve sağda 1,5 saatlik A PF gösterilmektedir. Daha sonra puy'un arka ucunu bir çift forseps ile tutarken, pupa kılıfının ön ucunu dikkatlice açmak için beş numaralı forseps kullanın. Ardından, ventral sinir kordonunu sağlam ve bağlı tutarak beyni hızla çıkarın. 20 mikrolitrelik plastik bir ucun üst kısmını kestikten sonra, pipet ucunu ıslatın ve göz bebeği beyinlerini orta dereceli bulaşıklara dikkatlice aktarmak için kullanın.

İstenilen süre boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin. Larva veya öğrenci beyinleri istenen süre boyunca kuluçkaya yatırıldıktan sonra, ortamı çıkarın ve PBST tamponuna 500 mikrolitre% 4 formaldehit ekleyin. 15 dakika inkübe edin, ardından taze tamponlu %4 formaldehit ile değiştirin ve 15 dakika daha inkübe edin.

Beyinleri her biri 0.5 dakika boyunca dört kez yıkamak için Triton X 100 içeren bir XPBS kullanın. Son yıkamadan sonra numuneleri bir saat inkübe edin. Engelleme çözümünde.

Bloke edici çözeltiye birincil antikorlar ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi sabah, numuneleri PBST ile her biri 10 dakika boyunca dört kez yıkayın. Daha sonra ikincil antikorlarda oda sıcaklığında dört saat inkübe edin.

Mikroskopi için beyinleri monte etmek için yıkama adımlarını tekrarlayın. Bunları ve montaj ortamını bir saat boyunca dengeleyerek başlayın ve numunelerin ezilmesini önlemek için cam kızaklara monte edin. Her iki tarafa da cam parçaları yerleştirin.

Daha sonra kapak fişlerini oje ile kapattıktan sonra kapak fişlerini uygulayın. Slaytları karanlıkta saklayın. Bu şekil, her ikisi de mantar gövdesinde aktin GFP'yi eksprese eden yabani tip sineklerden ve CDK beş dn'nin baskın bir negatif türevini ifade eden yabani tip sineklerden ve sineklerden elde edilen üçüncü instar larva beyinlerinin bir panelini göstermektedir veya daha önce tarif edildiği gibi MB gama nöronları, vahşi tip gama nöronlarının proksimal aksonlarında aktin GFP'yi biriktiremeyen bir bölge vardır, böylece berrak bir bölge olarak ortaya çıkar ve fasyal olarak aksonlarda sadece bu bölgenin ventral sınırına kadar iki protein birikir.

Noktalı çizgiler, hareket eden net bölgeyi ve ventral sınırını vurgulayan MB'nin konumunu gösterir. CDK beş dn ifade eden sineklerde. Aktin berrak bölgesi yoktur ve fasyal olarak iki veya hızlı iki immünoreaktivite bu bölge boyunca dorsal olarak yayılır, burada sunulan yöntem kullanılarak, ex vivo kültürleme için vahşi tip sinek beyinleri, CDK, beş aktivite, ROS, cottin ve en'in farmakolojik inhibitörlerinin bir kombinasyonu ile tedavi edildi.

Burada gösterilen, sineklere benzer şekilde ilaçla tedavi edilen yabani tip sineklerin üçüncü instar larva beyinlerinin bir panelidir, baskın bir negatif CDK beş yapı beyinlerini 24 saat boyunca CDK beş inhibitörleri ile tedavi eden beyinler, hareket eden net bölge ve hızlı kaymanın karakteristik kaybını gösterir. İki sınır beyaz çizgi, vahşi türün konumunu hızlı bir şekilde gösterir. Burada gösterilen iki sınır, sıfırdan 10 saate kadar temsili bir drosophila mantar gövdesi serisidir.

Membran hedefli olarak etiketlenmiş bir PF. MCD sekiz GFP braketi, metamorfozdan önce kaliks olarak adlandırılan MB'nin dendritik projeksiyonlarını gösterir. MB aksonları dorso'yu kalın demetler halinde ventral olarak seyreder ve yoğun dendritik çardaktan bir floresan sinyali ortaya çıkar.

Bu sütun, belirtilen zamanda diseke edilen beyinleri gösterir. Parantez ile gösterilen bölgedeki dendritlerin budanmasına dikkat edin, böylece altı ila sekiz saat bir PF, pus dendritik sinyali gitmiş olur. Bu sütundaki beyinler, iç eylemden önce sıfır saat A PF'de diseke edildi.

Dyson spike ve cultured x vivo zamanlarda bunların dendritlerin gelişimsel budamasını göstermediğini belirtti. Daha ziyade, dendritik sinyal, sıfır saat EPF'de işaretlenmiş bu PPR'yi atlatmak için 10 saatlik bir PF'de devam eder, ancak 1.5 saatlik bir PF'de diseke edilir ve kültürlenir. Bu sütun, bu DLA mantar gövdelerinin sıfırdan 10 saate kadar olan temsili bir serisini göstermektedir.

Kültürlenmemiş numunelerde olduğu gibi bir PF, dendritik sinyal sekiz saatlik bir PF ile tespit edilemez. Bu videoyu izledikten sonra, rosler beyinlerini ex vivo olarak nasıl kültürleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Metamorfoza neden olan hormon artışından önce veya sonra beyinleri geç evre larvadan veya beyaz PrePu'dan izole edebilmelisiniz. Daha sonra ya sabit materyali mikroskopi ile analiz edebilmeli ya da beyinleri canlı görüntüleme için başlangıç materyali olarak kullanabilmelisiniz.