Name: Tüm ex vivo ekimi ise, Gelişmekte Drosophila Brains (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Öğrenin Drosophila beyninin gelişimini ex vivo kültür sistemiyle incelemeyi. Bu yöntem, mantar cismi oluşumunu yüksek çözünürlükle analiz etmeyi sağlar ve nörobilim araştırmalarında değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz el yazması üzerine tavsiye, yararlı tartışmalar ve yorumlar için laboratuarımızda tüm üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Biz de özellikle biz yeniden deneylerde yetiştiricilik için beyinlerini parçalayıp önce 1.5 saat APF kadar beklemeniz mükemmel bir öneri için Marta Koch ve Bassem Hassan teşekkür etmek istiyorum. Biz de onların konfokal mikroskop kullanımı için NHGRI görüntüleme tesisi teşekkür ederim. Bu çalışma NINDS İntramural Araştırma Programı, Ulusal Sağlık Enstitüsü (Z01 NS003106) Temel Nörobilim Programı tarafından desteklenmiştir.

Ortam hazırlanışı <ol><li> Filtre-sterilizasyon Schneider&#39;in Drosophila Medya% 10 Fetal Bovine Serum ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş tarafından eksiksiz bir medya hazırlayın. </li><li> Medya her zaman taze hazırlanmalıdır. Alternatif olarak, önceden dondurulmuş ortam taze bir alikotu her kullanımdan önce çözülür edilebilir. </li><li> Kültür öncesinde, 10 mikrogram / ml insülin ve medyaya 2 mcg / ml ecdysone ekleyin. Uyuşturucu konsantre stok olarak hazırlanır ve küçük hacimde de donduruldu. Çözülmüş alikotları tekrar dondurulmamalıdır değildi. </li><li> Tüm çalışma çözeltileri 25 ° C&#39;de muhafaza edilmelidir </li></ol> Larva Brains kültürünün 1. Larva Brains Seçimi ve Diseksiyon <ol><li> 12 mm Millicell hücre kültürü yazısına medya 500 ul ekleyin. Disseke beyinler kolay immun kolaylaştırmak için bu ekler yerleştirilir. </li><li> Diseksiyon bir saat camı ile hazırlanmış ortam küçük bir miktar ekleyin. </li><li> U, küçük bir spatula şarkı dolaşıp Üçüncü dönem larva almak ve saat camı koyun. (Biz ex vivo kültür yöntemi ilk veya ikinci Larvalar için eşit derecede geçerli olacağını tahmin, ama biz bunu test edemedim.) </li><li> , Forseps bir çift ile larva posterior ucundan tutarak dikkatle # 5 forseps ikinci bir çift ile ön sonuna kadar açın. </li><li> Hızla ventral sinir kordonu korunarak, beynin incelemek. </li></ol> Dissected Larva Brains 2. Ex vivo kültür <ol><li> Ön ıslak pipet uçları kullanarak, hücre kültürü ekler, medya ile önceden doldurulmuş dikkatle beyin aktarın. </li><li> 25 küvözde medya Transfer beyinleri, ° C kadar zaman istenilen noktaya ulaşılır. Bu yöntem, kültürde 48 saat için verimli çalışır. </li><li> 8 saat ortamı değiştirin. Bunun ötesinde, medya her 5-6 saatte yarısı değiştirin. </li></ol> 3. Farmakolojik ManipülasyonLarva Brains Ex vivo kültürleme Bu yöntem, farmakolojik olarak daha önce laboratuar 1 &#39;de gösterilmiştir genetik etkileşimler teyit etmek için kullanılabilir. <ol><li> 100 uM roscovitine ve hazırlanmış medya 100 uM olomoucine ekleyin. </li><li> Bu medya disseke beyinleri aktarın. </li><li> 25 de kültüre beyinleri ° C&#39;de 24 saat boyunca. </li><li> 8 saat ortamı değiştirin. Bunun ötesinde, medyanın yarısı (uyuşturucu ile) her 5-6 saat değiştirin. </li></ol> Pupa Brains kültürünün 1. Diseksiyon için Pupalar Seçimi <ol><li> Şişe / şişe beyaz pupa işaretleyin. </li><li> Sadece tamamen beyaz pupa seçin. Renklenme herhangi bir sıralama ile pupa dahil edilmemelidir. </li><li> Bu aşama Puparium Formasyonu (APF) sonra 0 saattir. </li><li> Bu pupa 1.5 saat işaretleme sonrası diseksiyon için hazır olacak. Bu adım, bu gelişimsel budama ex vivo meydana sağlamak için çok önemlidir </em&gt; kültürü. </li></ol> 2. Pupa diseksiyonu <ol><li> 12 mm Millicell hücre kültürü yazısına medya 500 ul ekleyin. (Disseke beyinler kolay immun kolaylaştırmak için bu ekler yer alacak). </li><li> İstenilen zaman noktaya ulaşıldığında, bir diseksiyon saat camı için hazırlanmış medya küçük bir miktar ekleyin. </li><li> Küçük, ıslak spatula kullanarak, pupa önce diseksiyon için işaretlenmiş pick up ve saat camı koyun. </li><li> Forseps bir çift ile pupa arka sonuna Holding, dikkatle # 5 forseps ikinci bir çift ile pupa halinde ön ucunu açmak. </li><li> Hızla ventral sinir kordonu sağlam ve bağlı tutmak, beynin incelemek. </li></ol> Dissected pupa Brains 3. Ex vivo Kültürleme <ol><li> Hücre kültürü ekler, medya ile önceden doldurulmuş dikkatle beyin aktarın. </li><li> İstediğiniz zaman p kadar 25 inkübatör ° C ortam Transfer beyinleri,oint ulaşılır. Biz gösterilen deney için kültürde 10 saat için bu yöntemi kadar kullanılan, ancak gerekirse, gözlem ve tedavi daha uzun süre için uzatılabilir. </li><li> 8 saat APF fazla zaman noktaları daha uzun süre, medya her 5-6 saat değiştirin. </li></ol> Bu adımdan, protokol larva ve pupa hem de değişmeden kalır. B. Dissected Brains Tespit <ol><li> İstediğiniz zaman noktaya ulaşıldığında, medya çıkarın ve 1x PBS içinde% 4 formaldehit 500 ul eklemek% 0.5 Triton 15 dakika sonra taze formaldehit ile değiştirerek 30 dakika boyunca X-100 (PBST). </li><li> Sabitleştirici ile medya değiştirirken beyinleri kuruması için değil emin olun. </li><li> % 0.5 TritonX-100 (PBST) ile 1x PBS dört adet 10 dakikalık yıkar ile formaldehit yıkayın. </li></ol> C. Sabit Brains Boyama <ol><li> Formaldehit yıkanıp sonra,% 1 ile Normal 1x PBS bir bloke edici çözelti içinde 1 saat süreyle beyinleri blokeKeçi serum ve% 1 Bovine Serum Albumin. </li><li> Çözümü engelleme kadar yapılan birincil antikor ekleyin. </li><li> 4 gece boyunca inkübe beyinleri ° C </li><li> Ertesi sabah, PBST dört 10 dakikalık yıkama primer antikorlar yıkayın. </li><li> Çözümü engelleme kadar yapılan sekonder antikor ekleyin. </li><li> 4 saat için oda sıcaklığında bırakın. </li><li> PBST dört 10 dakikalık yıkar ile sekonder antikorlar yıkayın. </li></ol> D. Mikroskopi Sabit ve Vitray Brains Montaj <ol><li> 1 saat Vectashield montaj medya beyinleri dengeye. </li><li> Vectashield yarığına kullanılarak cam slaytlar üzerine kafa monte edin. </li><li> Kapak kayma monte edilmeden önce beyinleri her iki tarafında da cam yongaları yerleştirin. Bir konfokal mikroskop ile tüm odak uçakları taramak için yeterli örnek ince tutarken, ezilmiş olmaktan beyinleri engeller. Brains ilgi özelliklerini inceleyen kolaylaştırmak için montaj üzerine kabaca odaklı idi. Gerektiğinde,beyin görüntüleri dokümantasyon ve ölçüm için optimal bir görünüm sağlamak için Imaris yazılımı ile döndürüldü. </li><li> Net tırnak cilası ile kayar kapağı kapatın. </li><li> Mağaza ışıktan uzak slaytlar. </li></ol> E. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1 (A) vahşi tip sineklerin üçüncü evre larva beyinleri bir panel gösterir ve (B) Cdk5 bir baskın-negatif türevi (Cdk5DN) (Connell-Crowley ve ark., 2000) ifade sinekler. MB gama nöronlarda hem ekspres aktin-GFP (yeşil). Daha önce açıklandığı gibi (Trunova ve ark., 2011), bu nedenle bir &quot;açık bölgesi&quot; (A, dirseği) olarak gösteren, ve, aktin-GFP birikmesine başarısız yaban-tip gamma nöronların proksimal akson bir bölgenin olduğu fasciclin 2 protein (kırmızı) sadece yukarı bu bölgenin ventral sınır (beyaz yatay çizgi) aksonlar birikir. Şekil 1 (A) üçüncü panelinde noktalı çizgi hareket öne, MB konumunu gösterir&quot;açık bölge&quot; ve ventral sınırında. Cdk5DN ifade sinekler ise, aktin temiz zon yoktur (B) ve Fasciclin 2 (FasII) immünreaktivite o bölge üzerinden dorsal yayılır. (Yatay MB arasında FasII pozitif aksonları değişken sayıda unutmayın; bu fenotipi ile ilgili değildir). Ölçek bar 20 mikron temsil eder. Ex vivo kültürleme bizim yöntemi kullanarak, roscovitine ve olomoucine, Cdk5 aktivitesinin inhibitörleri farmakolojik bir kombinasyonu ile vahşi tip sinekler muamele. Şekil 2, bir kontrol üçüncü evre larva beyinleri (A) paneli ve (B ilaçla işleme tabi tutulmuş gösterir ) vahşi tip sinekler. 24 saat Cdk5 inhibitörleri ile tedavi beyinleri baskın bir olumsuz Cdk5 yapı ifade sinekler benzer karakteristik aktin açık alan kaybı ve FasII sınırında shift (köşeli parantez) göstermektedir. Beyaz çizgiler vahşi tip FasII sınır konumunu göstermektedir. Ölçek bar 20 mikron temsil eder. Figuyeniden 3 mCD8-GFP (yeşil) membran hedefli etiketli 0-10 saat APF gelen Drosophila mantar organlarının temsilcisi dizi gösterir. Braketler kaliks, yani MB dendritik projeksiyonları göstermektedir. Önceden metamorfoz üzere, bir kalınlıkta demetler yanı sıra, yoğun dendritik mili (taşıyıcı) kaynaklanan flüoresan sinyalinin bir &#39;pus&#39; in dorso-ventral akan MB aksonlardan görebiliriz. Zamanda parçalanmış panel A gösterir beyinleri göstermiştir. Bölgede dendritlerin budama (akson sinyali etkilenmemiş olsa da) 6-8 saat ile APF, dendritik sinyal pus gitti öyle ki, parantez ile gösterilir unutmayın. Panel B Brains iç ecdysone başak (Truman ve Riddiford, 2002) ve belirtildiği gibi kültürlü ex vivo önce, 0 saat APF de diseke edildi. Bu dendritler hiçbir gelişimsel budama göstermek; yerine dendritik sinyal 10 saat APF de devam etmektedir. Bunu aşmak için, pupa 0 saat APF işaretlenmiş, ancak 1,5 saat APF ve kültürlü olarak disseke edilir. Panel C 0-10 saat APF bu Drosophila mantar organlarının temsilcisi dizi gösterir. Non-kültüre örneklerde olduğu gibi, dendritik sinyali 8 saat YGø ile mümkün değildir. Ölçek bar 20 mikron temsil eder.

<ol><li>Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdk5+regulates+the+size+of+an+axon+initial+segment-like+compartment+in+mushroom+body+neurons+of+the+Drosophila+central+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain.</a> J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).</li>
<li>Nakada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+anchored+proteins+forms+membrane+diffusion+barriers+during+neuronal+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization.</a> Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).</li>
<li>Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+the+p53+tumor+suppressor+protein+family+and+Cdk5%3A+novel+therapeutic+approaches+for+the+treatment+of+neurodegenerative+disease+using+selective+Cdk+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors.</a> Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).</li>
<li>Kahsai, L., Zars, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+and+memory+in+Drosophila%3A+behavior%2C+genetics%2C+and+neural+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system.</a> Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).</li>
<li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies%3A+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126, 4065-4076 (1999).</li>
<li>Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+pruning+during+Drosophila+metamorphosis%3A+evidence+for+local+degeneration+and+requirement+of+the+ubiquitin-proteasome+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system.</a> Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).</li>
<li>Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+requirement+of+the+USP%2FEcR-B+ecdysone+receptor+for+mushroom+body+neuronal+remodeling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila.</a> Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).</li>
<li>Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cyclin-dependent+kinase+Cdk5+controls+multiple+aspects+of+axon+patterning+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo.</a> Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).</li>
<li>Truman, J. W., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+insights+into+the+evolution+of+metamorphosis+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).</li>
<li>Noguchi, T., Miller, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+actin+dynamics+in+individualization+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Development. 130, 1805-1816 (2003).</li>
<li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1%2Fdynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).</li>
<li>Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+time-lapse+imaging+and+dominant+negative+receptors+to+dissect+the+steroid+receptor+control+of+neuronal+remodeling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila.</a> Development. 133, 275-288 (2006).</li>
<li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Developing+and+Adult+Drosophila+Brains+and+Retinae+for+Live+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (37), e1936(2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

<html> Mutasyonlar ve transgenlerin ifadesi de dahil olmak üzere doku yapısı ve fonksiyonları, kronik genetik manipülasyonlar, tipik olarak ayırmak çok zor olabilir ve ani etkilerini ve geç dolaylı sonuçları karışımından oluşur. Farmakoloji ile genetik yöntemler tamamlayan bir fenotip arkasında zaman tabii sorgulama kolaylaştırabilir. Örneğin, bu Drosophila 10 spermatogenezisin sırasında farklı sitoskeletal bileşenlerin katkılarını kesme için güçlü bir yaklaşım olmuştur. Mevcut örnekte, bize Droso...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td> Schneider&#39;in Drosophila Medya </td><td> Invitrogen </td><td> 21720-024 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu (ısıyla inaktive edilmiş) </td><td> Invitrogen </td><td> 10082-147 </td><td> % 10 </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Ensülin </td><td> Invitrogen </td><td> 12585-014 </td><td> 10μg/ml </td></tr><tr><td> Ecdysone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H5142 </td><td> 2μg/ml </td></tr><tr><td> Roscovitine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R7772 </td><td> 100μM </td></tr><tr><td> Olomoucine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0886 </td><td> 100μM </td></tr><tr><td> Normal Keçi Serumu </td><td> Invitrogen </td><td> 50062Z </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumin </td><td> Fisher Scientific </td><td> M9501 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Formaldehit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4551 </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP151 </td><td> % 0.5 </td></tr><tr><td> Fosfat Tamponlu Salin </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vektör Laboratuvarları </td><td> H1000 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Millicell Hücre Kültürü Uçlar </td><td> Millipore </td><td> PI8P01250 </td><td></td></tr><tr><td> Multidish, iyi 4 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 Forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11251-20 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop Slaytlar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-7 </td><td></td></tr><tr><td> Cam Kapak </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-548-5M </td><td></td></tr></tbody></table>

tüm ex vivo ekimi ise, gelişmekte drosophila brains

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Biz bütün Drosophila beyinleri ex vivo kültürlenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu akut farmakolojik ve hücresel süreçlerin canlı görüntüleme izin vererek hücre biyolojisi ve merkezi beyin yapılarının gelişimini araştırmak için kronik genetik manipülasyonlar için bir kontrpuan olarak kullanılabilir. Tekniğinin bir örneği olarak, önce bizim laboratuar 1 ile çalışmak, daha önce tanınmayan Subselüler bölmesi Drosophila merkezi beynin akson aksonal ve somatodendritik bölmeler arasında yattığını göstermiştir. Aksonun ilk segmenti (AIS) 2 olarak adlandırılan bu bölmeye gelişimi, nöron spesifik siklin-bağımlı kinaz, Cdk5 bağlı genetik olarak gösterildi. Biz Cdk5-spesifik farmakolojik inhibitörleri roscovitine ve olomoucine 3 ile yabani tip Drosophila larva beyinleri ex vivo tedavi aktin örgütü akut değişikliklere neden olur, ve burada göstermekGenetik olarak Cdk5 aktivitesi eksikliği görülen mutantlarının değişiklikler taklit hücre yüzey proteini Fasciclin 2, lokalizasyonunu. Ex vivo kültürü tekniği ikinci bir örneği, embriyonik mantar gövdesi (MB) larva yetişkine kadar metamorfoz sırasında gamma nöronların bağlantıların remodeling için sağlanmıştır. Mantar vücudu koku öğrenme ve sinek 4 bellek merkezidir ve bu gama nöronlar yetişkin innervasyon desen 5 kurmak için bir sonraki timepoint yeniden uzatması dalları daha sonra pupa gelişimi sırasında aksonal ve dendritik dalları budamak ve. MB Bu nöronların budama ecdysone reseptör B1 7 de hareket ederek, ecdysone, bir steroid hormon tarafından tetiklenen bir mekanizma ile, nörit dalları 6 lokal dejenerasyonu ile meydana gösterilmiştir ve bu aktivite bağımlı olmuştur ubikuitin-proteazom sistemi 6. Ex vivo kültür Bizim yöntemi b yapabilirsinize daha da gelişimsel yeniden mekanizmasını sorgulamak için kullanılır. Biz ex vivo kültür ortamında, MB gama nöronlar in vivo benzer bir zamanlaması ile gelişimsel budama işlemi değinmeyecek bulundu. Bu hücreler başkalaşım geri dönüşümsüz olarak işlemesi amacıyla doku explanting önce 1.5 saat puparium oluşumundan sonra beklemek, ancak, önemli idi; kültüründe çok az veya hiç metamorfoz yol pupariation başlangıcında hayvanların diseksiyonu. Böylece, uygun bir modifikasyonu ile ex vivo kültürü yaklaşımı ve merkezi beyin biyoloji açıdan kararlı şekilde dinamik incelemek için uygulanabilir.

Bu makalede, bir taklit hangi bir yöntem açıklanır<em&gt; In vivo</emBir&gt; gelişme<em&gt; Drosophila</emBir de&gt; mantar vücut<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kültür sistemi.

Tüm ex vivo ekimi ise, Gelişmekte Drosophila Brains

Tüm *Drosophila* beyinlerinin ex vivo kültürlenmesi için bir yöntemi tanımlıyoruz. Bu yöntem, ... için kronik genetik manipülasyonlara karşı bir karşılaştırma noktası olarak kullanılabilir.

Bu prosedürün genel amacı, gelişmekte olan tüm drosophila, larva ve pupa beyinlerini ex vivo bir ortamda kültüre etmektir. Bu işlem, öncelikle uygun evredeki drosophila, larva ve pupaların belirlenmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, beyinler hızla diseke edilerek çıkarılır.Ardından beyinler, 25 °C'de gerekli süre boyunca kültüre edilir. Son olarak, kültüre edilen beyinler fikse edilir, boyanır, lam üzerine yerleştirilir ve görüntülenir. Nihayetinde sonuçlar, oph mantar cisimciğinin in vivo gelişiminin, bir ex vivo kültür tekniği aracılığıyla taklit edilmesinin mümkün olduğunu göstermektedir.Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, drosophila mantar cisimciğindeki in vivo fenotiplerini artık ex vivo bir kültür ortamında taklit edebilmemizdir; bu da gelişimsel sürecin dinamiklerinin yüksek çözünürlüklü analizine olanak tanır. Larva beyinlerini kültüre etmek için; insülin ve act Dyson içeren taze, komple medyumu hazırlayıp ilaç uygulaması için insert içeren 12 milimetrelik bir hücre kültürü kabına 500 µL ekleyin. Her birinden 100 µM Rosco battin ve oli moin içeren komple medyumu hazırlayın.Bir diseksiyon saat camına küçük bir spatula kullanarak az miktarda besiyeri ekleyin. Gezen üçüncü instar larvaları toplayıp saat camına yerleştirin. Ardından, bir penset yardımıyla larvanın posterior ucunu tutun.Ardından, beş numaralı pens ile ön ucu dikkatlice açın ve ventral sinir kordonunu bütün halde tutarak beyni hızlıca diseke edin. Önceden ıslatılmış pipet uçlarını kullanarak beyni dikkatlice daha önce hazırlanmış olan hücre kültür kabına aktarın. Sonrasında, bir nemli oda (wet chamber) oluşturun ve kabı bu odanın içine yerleştirin.Pupil beyinlerini kültüre etmek için beyni 25 °C'de 48 saate kadar inkübe edin. Viyalleri beyaz kalemle işaretleyerek başlayın. Bu aşamayı, ER oluşumundan sonraki sıfırıncı saat veya 1,5 saatteki bir PF olarak kaydedin.İnsertli 12 milimetrelik bir hücre kültürü kabına 500 µL komple besiyeri ekleyin. Hazırlanan besiyerinden küçük bir miktar disseksiyon saat camına ekleyin. Ardından, küçük ve ıslak bir spatula kullanarak, daha önce disseksiyon için işaretlenmiş PPE'leri alın ve saat camına yerleştirin.Soldaki beyaz pupa sıfırıncı zaman noktasını, sağdaki ise PF sonrası 1,5 saati göstermektedir. Ardından, pupanın posterior ucunu bir pensle tutarken, pupa kılıfının anterior ucunu dikkatlice açmak için beş numara pens kullanın. Daha sonra, ventral sinir kordonunu sağlam ve bağlı tutarak beyni hızlıca çıkarın. 20 µL'lik bir plastik pipet ucunun üst kısmını kestikten sonra, pipet ucunu ıslatın ve pupa beyinlerini besiyeri kaplarına dikkatlice aktarmak için kullanın.Bunları istenen süre boyunca 25 °C'de inkübe edin. Larva veya pupa beyinleri istenen süre boyunca inkübe edildikten sonra, ortamı uzaklaştırın ve PBST tamponu içinde %4 formaldehit içeren 500 µL ekleyin. 15 dakika boyunca inkübe edin, ardından taze tamponlu %4 formaldehit ile değiştirin ve 15 dakika daha inkübe edin.Beyinleri, %0.5 Triton X 100 içeren bir XPBS kullanarak her biri 10 dakika sürecek şekilde dört kez yıkayın. Son yıkamanın ardından, örnekleri bir saat boyunca bloklama solüsyonunda inkübe edin.Bloklama solüsyonu içindeki primer antikorları ekleyin ve dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah, örnekleri PBST ile her biri 10 dakika sürecek şekilde dört kez yıkayın. Ardından, oda sıcaklığında dört saat boyunca sekonder antikorlar içinde inkübe edin.Beyinleri mikroskopi için hazırlamak amacıyla yıkama adımlarını tekrarlayın. Öncelikle, beyinleri ve montaj ortamını bir saat boyunca dengeleyerek başlayın ve örneklerin ezilmesini önlemek için onları cam slaytlara monte edin. Her iki yanına cam parçaları yerleştirin.Ardından, lamelleri oje ile mühürledikten sonra kapatın. Lamları karanlıkta saklayın. Bu şekil, yabanı tip sinekler ile CDK five'ın dominant negatif bir türevini (CDK five dn) eksprese eden sineklerden alınan üçüncü instar larval beyinlerin bir panelini göstermektedir; her ikisi de daha önce açıklandığı üzere mantar gövde veya MB gamma nöronlarında actin GFP eksprese etmektedir, yabanı tip gamma nöronlarının proksimal aksonlarında actin GFP'nin birikmediği, dolayısıyla berrak bir bölge olarak görünen bir alan vardır ve fascially two proteini aksonlarda yalnızca bu bölgenin ventral sınırına kadar birikir.Kesikli çizgiler, aktif berrak bölgeyi ve onun ventral sınırını belirginleştiren MB'nin konumunu göstermektedir. CDK five dn eksprese eden sineklerde, aktin berrak bölge yoktur ve fascially two veya fast two immünoreaktivitesi bu bölge boyunca dorsal yönde yayılır. Burada sunulan yöntem kullanılarak, ex vivo kültürlenen yabani tip sinek beyinleri, CDK five aktivitesinin farmakolojik inhibitörleri olan ROS cottin ve ene kombinasyonu ile işleme tabi tutulmuştur.Burada, kontrol ve ilaç uygulanmış vahşi tip sineklerin üçüncü instar larva beyinlerinden oluşan bir panel gösterilmektedir; dominant negatif CDK five konstrüktü eksprese eden sineklere benzer şekilde, 24 saat boyunca CDK five inhibitörleri ile işlem görmüş beyinler, karakteristik aktin berrak bölge kaybı ve fast. Two sınırında kayma göstermektedir. Beyaz çizgiler, vahşi tip fast. Two sınırının konumunu göstermektedir; burada 0 ile 10 saat arasındaki drosophila mantar cisimciklerinin temsili bir serisi sunulmuştur.Membran hedefli MCD eight GFP ile işaretlenmiş bir PF. Parantezler, metamorfoz öncesinde calyx olarak adlandırılan MB'nin dendritik projeksiyonlarını göstermektedir. MB aksonları kalın demetler halinde dorso-ventral yönde ilerler ve yoğun dendritik arborizasyondan floresan bir sinyal yayılır.Bu sütun, belirtilen zamanlarda diseke edilmiş beyinleri göstermektedir. Köşeli parantezlerle belirtilen bölgedeki dendrit budanmasına dikkat edin; altı ila sekiz saat A PF sonunda, puslu dendritik sinyal kaybolmuştur. Bu sütundaki beyinler, internal akt öncesindeki sıfırıncı saat A PF'de diseke edilmiştir.Dyson spike ve belirtilen zamanlarda ex vivo kültürlenmiş örneklerde, dendritlerin gelişimsel budanması görülmemektedir. Aksine, dendritik sinyal 10 saat boyunca devam etmektedir; bunu aşmak için 0 saat EPF'de işaretlenmiş, ancak 1,5 saat a PF'de diseke edilip kültürlenmiş bir PPR kullanılmıştır. Bu sütun, 0 ile 10 saat arasındaki bu DLA mantar cisimciklerinin temsilci bir serisini göstermektedir.Kültürlenmemiş örneklerde olduğu gibi, bir PF'de dendritik sinyal sekiz saat sonra tespit edilemez hale gelir. Bu videoyu izledikten sonra, rosler beyinlerinin ex vivo olarak nasıl kültüre edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Beyinleri, metamorfoza yönelten hormon artışından önce veya sonra, geç evre larva veya beyaz PrepU'dan izole edebilmelisiniz. Ardından, fikslemiş materyalleri mikroskopi ile analiz edebilmeli veya beyinleri canlı görüntüleme için başlangıç materyali olarak kullanabilmelisiniz.

ex-vivo-culturing-of-whole-developing-drosophila-brains

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, geç dönem Drosophila pupa beyinleri primer nöronal kültürlerin hazırlanmasında gösteriyor. Canlı kültürlerin Görüntüleme Fura-2 kullanarak kalsiyum düzeyleri neurite akıbet ve görüntüleme göstermektedir.

Geç Stage Drosophila pupa Brain İlköğretim Nöronal Kültürler

Bu video standart tüm hücre teknolojisini kullanarak tek nöronlar kayıt için hazırlık yetişkin Drosophila tüm beyinleri izole etmek için prosedürü göstermektedir. Bu kayıt sırasında görüntülenen GFP etiketli hücreleri ve nöronlar görüntülerini içerir.

Yetişkin Drosophila Beyin Tüm Hücre Kayıtlar

Geliştirilmesi ve Yetişkin hazırlanması Drosophila Brain ve Canlı Görüntüleme için Retinae

Biz sahnelenen hazırlamak için prosedürü...

Tüm montaj Embriyonik Sinir Sistemi Görselleştirme Drosophila Embriyolar

Bu video, Drosophila beyin nöral kök hücrelerinin hareketsiz durumlarından yeniden aktivasyonunu başlatan eksojen faktörleri tanımlamak için bir protokol göstermektedir. Yumurtadan yeni çıkmış larvalar beyinlerini izole etmek için parçalara ayrılır ve daha sonra hormonun nöral kök hücre reaktivasyonunu ve proliferasyonunu indükleme potansiyelini değerlendirmek için bir test hormonu olan veya olmayan ortamda kültürlenir.

Kültürlenmiş Drosophila Beyin Eksplantlarında Nöral Kök Hücre Reaktivasyonunun Analizi

Kaynak: Ishimoto, H. et. al., Drosophila'da endokrin sinyalizasyona beyin tepkilerini görselleştirmek için ex vivo kalsiyum görüntüleme. J. Vis. Uzm.  (2018) Bu video, çalışmak için kalsiyum görüntülemeyi göstermektedirDrosophila nöropeptitlere beyin tepkileri. Floresan kalsiyum indikatörünü eksprese eden nöronlar, hücre içi kalsiyum dinamiklerini ve sinyal moleküllerine fonksiyonel tepkileri ortaya çıkarır.

Drosophila Beyninin Nöropeptitlere Tepkilerini İncelemek için Ex Vivo Kalsiyum Görüntüleme

Bu protokol, dokunulmamış larva beyin bağlamında canlı hücre görüntüleme yapmak için kullanılan akıcı bir yöntem göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları sürekli daha önce gözardı mekanizmaları ortaya çıkarılması, asimetrik nöral kök hücre bölünmeleri çalışmanın yanı sıra diğer nörolojik ve gelişimsel süreçleri için paha biçilmezdir.

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Yetişkin Drosophila beyin nöronal devreleri, yüksek beyin fonksiyonları ve karmaşık bozuklukları çalışmak için değerli bir sistemdir. Etkin bir yöntem, beyin temelli çalışmalar kolaylaştıracak küçük sinek kafasından tüm beyin dokusu incelemek için. Burada iyi korunmuş morfolojisi ile yetişkin beyinlerinde basit, tek adımlı diseksiyon protokol açıklar.

Basit Bir adım Yetişkin Tüm montaj Hazırlama Diseksiyon Protokolü<em&gt; Drosophila</em&gt; Brain

Bu iletişim kuralının amacı ile uzun vadeli Floresans hızlandırılmış görüntüleme moleküler sirkadiyen ritimler izlemek için en iyi duruma getirilmiş ex vivo Drosophila larva beyin kültür kurmaktır. Bu yöntem uygulamaya farmakolojik deneyleri de ele alınmıştır.

Tek hücreli çözünürlük Floresans canlı görüntüleme Drosophila sirkadiyen saatler larva beyin kültür

Bu kağıt için ex vivo kalsiyum düşsel Drosophila beyin protokolünü açıklar. Bu yöntemde, doğal veya sentetik bileşikler beyindeki belli nöronlar etkinleştirmek için yeteneklerini test için tampon uygulanabilir.

Ex Vivo Endokrin Drosophila içinde sinyal beyin yanıt-e doğru görüntülenmesi için kalsiyum görüntüleme

Kültürlü Drosophila beyin eksplantlarında sessiz nöral kök hücreleri yeniden aktive etmek için bir yöntem oluşturulmuştur. Bu yöntem kullanılarak, nöral kök hücre sessizliğinin, giriş ve çıkışın düzenlenmesinde sistemik sinyallerin rolü doku-intrinsik sinyallerden ayrılabilir.

Kültürlü Drosophila Beyin Eksplantlarında Nöral Kök Hücre Reaktivasyonu

Öğrenin Drosophila beyninin gelişimini ex vivo kültür sistemiyle incelemeyi. Bu yöntem, mantar cismi oluşumunu yüksek çözünürlükle analiz etmeyi sağlar ve nörobilim araştırmalarında değerli bir araçtır.

Tüm ex vivo ekimi ise, Gelişmekte Drosophila Brains

Daha fazla video keşfet