Name: Ex vivo Fare neuroepithelium Tek Hücre Bölümler Canlı Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Öğrenin fare embriyonik nöroepiteliumunda tek hücre bölünmelerini canlı görüntüleme yöntemiyle. Zaman atlamalı konfokal mikroskopi kullanılarak hücre dinamikleri gerçek zamanlı gözlemlenir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma projesi bir ARRA Ek, 5 R01 NS056380 tarafından desteklenmiştir. Ek destek Viral vektör Core ve Emory Nörobilim NINDS Çekirdek Hizmetleri hibe, P30NS055077 en Mikroskopi Çekirdek ile sağlanmıştır. Istikrarlı SSTR3-GFP IMCD3 hücre hattı için Greg Pazour,, Biz GENSAT gelen fare hattı türetmek için Emory Transgenik Fare ve Gen Hedefleme Çekirdek teşekkür ve Sstr3-GFP lentiviral için Bradley Yoder inşa. Monoklonal antikorlar NICHD himayesinde geliştirilen Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası, elde edilen ve Iowa Üniversitesi, Biyolojik Bilimler Bölümü, Iowa City, IA 52242 tarafından muhafaza edildi. Tüm hayvan prosedürleri IACUC ve Emory Üniversitesi Biyogüvenlik Komitesi tarafından kabul edildi.

Yetişkin fareler, mekanik servikal dislokasyon tarafından ötenazi. Tüm hayvan prosedürleri IACUC ve Emory Üniversitesi Biyogüvenlik Komitesi tarafından kabul edildi. 1. Embriyo Üretimi <ol><li> Çapraz Tamoksifen-indüklenebilir Cre çizgi, CAGGCreER ve dsRedCre muhabiri hattı (Tg (CAG-Bgeo,-DsRed * MST) 1Nagy) (Şekil 1) 5,6. Kızı hücreler, çapraz CAGGCreER ve Olig2-eGFP BAC transgenik farelerin (Tg (Olig2-EGFP) EK23Gsat) (Şekil 1) 7,8 ile DsRed doğrultusunda Sus yanıt göreli zamanlama izlemek için. </li><li> % 100 etanol tamoksifen çözülür ve Cre ifade ve hücrelerin bir kısmında DsRed etiketleme ikna etmek için embriyonik 6.5 (E6.5) hamile kadın içine vücut ağırlığı 40 g başına 2.5 mg tamoksifen intraperitoneal gerçekleştirin. </li><li> 48 saat sonra, embriyolar incelemek floresan mikroskop kullanılarak DsRed olumlu embriyolar tespit, kültür çanak aktarmak ve gözlemlerEx vivo görüntüleme sırasında E tek hücre bölünmesi (aşağıya bakınız). </li></ol> 2. Tüm Fare Embriyo Kültürü <ol><li> % 10 yeni doğmuş buzağı serumu ve% 1 Penisilin / Streptomisin (P / S) 9 ile desteklenmiş DMEM/F12 (1:1) içeren, önceden ısıtılmış yıkama ortamı içinde E8.5 embriyolar incelemek. </li><li> Doğrudan floresan mikroskop altında 37 ° C ısıtma sahnede diseksiyonu, yer embriyo sonra GFP ve / veya DsRed pozitif (bkz. aşağıda) olarak tanımlar. </li><li> Sonra bir L-glutamin ile takviye edilmiş fenol kırmızısı olmadan en az% 50 bir erkek Sprague-Dawley sıçan alınan serum ve% 50 DMEM/F12 (1:1) ihtiva eden önceden-dengelenmiş kültür ortamı 500 ul damla ve% 1 içine 2 embriyolar kadar veri transferi 0.85% NaCl ve P / S 9 1 M HEPES. </li><li> Buharlaşmasını önlemek ve kültür kabına 37 ° C,% 5 CO2 inkübatör embriyolar içeren transfer ortamı üzerinden dengelenmiş hafif mineral yağ ince bir tabaka (0,1 cm) uygulanır. </li></ol> 3.Viral Enfeksiyon <ol><li> Nöroepitelyumda etiket kirpikler amacıyla, bir E8.5 embriyo içeren kültür ortamı içinde bir 500 ul dengelenmiş bir düşüş Sstr3-GFP lentivirüs 5-10 ul, yaklaşık 2.000.000 virionlar ekleyin. </li><li> Kültür 18 saat sonra, virüs yıkayın ve nöral tüp dilim hazırlamak için yıkama orta birkaç damla içine enfekte embriyo transferi. </li></ol> 4. Canlı Görüntüleme Nöral Tüp Dilim Hazırlık <ol><li> % 1 agar kaplı çanak, bir mikro-bıçak boyutu 0.025 mm kullanarak önceden ısıtılmış yıkama ortamda E8.5 embriyo nöral tüp parçalara ayır. </li><li> 35 mm poli-L-lisin kaplı cam alt çanak fenol kırmızısı olmadan dengelenmiş kültür ortamı bir 150 ul damla izole nöral tüp ventral yüzü aşağı yerleştirin. </li><li> Için cam lamel dar bir parça% 100 saf vazelin ve monte nöral tüp etrafında erimiş mum (IKEA mum), ve hafifçe basın yapılmış 1:1 karışımının az miktarda koyunörnek hareketsiz. </li><li> Dengelenmiş hafif mineral yağ ince bir tabaka (~ 0.1 cm) (Şekil 2) ile çanak Kapak. </li></ol> 5. Görüntüleme ve Time-lapse Konfokal Mikroskop Canlı <ol><li> Sıcaklık düzenleyen bir çevre odası ile donatılmıştır Konfokal Ters Mikroskop Tarama Nikon A1R Lazer altında yer çanak, 37 ayarlı ° C ve% 5 CO 2. </li><li> 40x yağ immersiyon objektif kullanımı Olig2-GFP ve DsRed pozitif hücreler izlemek için ise, GFP etiketli kirpikler ve DsRed pozitif hücreler kaydetmek için 60x yağ immersiyon objektif kullanın. </li><li> Zaman atlamalı görüntüleme koşulları kurmak için NIS Elements yazılımı açın. Her 10 dakika 1.5 mikron (40x objektif) ve 0.4 mikron (60x objektif) bir aralığı ile en fazla 8 mikron bir aralığı ile z-yığınları 25 mikron kadar kazanır. Gerekirse 488 ve 561 nm uyarma dalga boyları ve iletilen kanal kullanın. 512 x 512 boyutunda görüntüler elde. Int birden fazla kullanıcı tanımlı bölgeler kurmakerest aynı anda kayıt yapmak için. , Tarama hızı 1, çizgi ortalama 2 ve iğne deliği boyutu (61, görüntünün lazer gücü ve parlaklık için en iyi poz kullanımı düşük lazer yoğunluğu (4.5 kadar% EGFP 405/488 mCherry 561 için en fazla 11%) tarafından ayarlandı DsRed için mikron; Olig2 için 28.1 mikron, SSTR3GFP için 72 mikron, DsRed ve SSTR3GFP için 61.3 mikron, DsRed ve Olig2 için 58 mikron). Genetik olarak kodlanmış floresan gazetecilere kullanımı bize düşük lazer gücü ile parlaklık tespit sağladı. </li><li> Imaris 3D rekonstrüksiyon yazılımı kullanılarak kaydedilen verileri analiz. </li></ol> 6. İmmünofloresan <ol><li> Bir cam tabak içinde 1 saat boyunca buz üzerinde% 4 paraformaldehid / 0.1 M fosfat tampon (4 ° C) içinde izole edilmiş embriyolar ya da nöral tüp düzeltildi. </li><li> Örnekler buz üzerinde PBS 2 saat (4 ° C) (değiştir PBS birkaç kez) ve gece boyunca ya da embriyoların lavabo kadar% 30 sakaroz / 0.1 M Fosfat Tampon koymak yıkayın. </li><li> -80 Kuru buz ve mağaza ° C üzerinde, OCT dondurma Embed Pkriyostat (10 mm) üzerinde kesit erform. </li><li> % 1 ısı ile inaktive edilmiş koyun serumu ihtiva eden yıkama çözeltisi içinde 10 dakika karıştırıldı ve PBS içinde% 0.1 Triton X-100 için slayt yıkayın. </li><li> Konsantrasyonlarda takip de yıkama çözeltisi içinde primer antikorlar inceltilir Rat monoklonal anti-RFP (5F8,) 1:200; Tavşan anti-Arl13b serum 1:1500 ve fare monoklonal anti-Arl13b 01:05 (295B/54); Tavşan anti-Olig2 1:300; Fare monoklonal Pax6, Şşş ve Nkx2.2-tüm 01:10 ve Ki67 1:500 poliklonal Tavşan. Düz nemlendirilmiş bir odasında slayt başına 150 ul yaklaşık ekle, kurumasını önlemek ve 4 gece boyunca terk ° C&#39;ye parafilm kapağı </li><li> Üç kez, 20 dakika, her zaman oda sıcaklığında yıkama çözeltisi içinde slaytlar yıkayın. </li><li> 1:200 konsantrasyonda yıkama çözümleri sekonder antikor Alexa Fluor 488, 568, 350 sulandırmak. Çekirdekleri leke Hoechst 1:3,000 veya TO-PRO-3 1:500 kullanın. Slayt başına 150 ul, ışıktan koruyarak, nemlendirilmiş bir odasında, oda sıcaklığında 1 saat bekletin. </li><li> Yıkama solüsyonu tw slaytlar yıkayıno zaman, oda sıcaklığında 30 dakika, her zaman. </li><li> Dağı 24 saat içinde Altın anti-solmaya reaktif ve görünüm uzatmak% 80 kayar. </li></ol>

<ol><li>Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+pattern+in+the+neural+tube%3A+motor+neuron+induction+by+diffusible+factors+from+notochord+and+floor+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate.</a> Cell. 73, 673-686 (1993).</li>
<li>Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+induces+the+differentiation+of+ventral+forebrain+neurons%3A+A+common+signal+for+ventral+patterning+within+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube.</a> Cell. 81, 747-756 (1995).</li>
<li>Briscoe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeodomain+Protein+Code+Specifies+Progenitor+Cell+Identity+and+Neuronal+Fate+in+the+Ventral+Neural+Tube%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube.</a> Cell. 101, 435-445 (2000).</li>
<li>Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ciliary+localization+sequences+within+the+third+intracellular+loop+of+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors.</a> Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).</li>
<li>Vintersten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+red%3A+red+fluorescent+protein+expression+in+mouse+ES+cells%2C+embryos%2C+and+adult+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals.</a> Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).</li>
<li>Hayashi, S., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recombination+in+diverse+tissue+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre%3A+a+tool+for+temporally+regulated+gene+activation%2Finactivation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse.</a> Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).</li>
<li>Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olig2%2B+neuroepithelial+motoneuron+progenitors+are+not+multipotent+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).</li>
<li>Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+vivo+imaging+of+postimplantation+mammalian+embryos+using+whole+embryo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture.</a> Genesis. 34, 228-235 (2002).</li>
<li>Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+individual+cell+divisions+in+mouse+neuroepithelium+shows+asymmetry+in+cilium+formation+and+Sonic+hedgehog+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response.</a> Cilia. 1 (6), In Press (2012).</li>
<li>Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mouse+development+with+confocal+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bizim ex vivo sistem bize doğrudan gerçek zamanlı olarak gelişmekte neuroepithelium içinde tek bir hücre bölünmeleri gözlemlemek sağlar. Örnek olarak fare embriyonik nöral tüp içinde hücre bölünmeleri incelenmiş ve kirpik oluşumu veya Sus yanıt ya izlenir. Biz teknik fizyolojik ilgili verileri sağlar gösteren sabit bölümleri (n = 178) sonuçları ile uyumlu idi bizim görüntüleme sonuçları (n = 24) doğruladı. Bizim teknik tamoksifen dozu kesin olmalıdır kadar Cre indü...

<table><tbody><tr><td>Z/RED hattı (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>005438</td><td></td></tr><tr><td>Olig2-eGFP hattı (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd)</td><td>MMRRC,</td><td>010555-UCD</td><td></td></tr><tr><td>CAGGCreER</td><td>Jackson Laboratory</td><td>003724</td><td></td></tr><tr><td>Tamoksifen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>GIBCO</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>Yeni doğan buzağı serumu</td><td>Lonza</td><td>14-416F</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin/Streptomisin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan Serumu SD erkek</td><td>Harlan Bioproducts</td><td>4520</td><td></td></tr><tr><td>1M Hepes</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>GIBCO</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>Hafif mineral yağ </td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Sstr3-GFP lentivirüsü </td><td>Emory Viral Core</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikro bıçak, boyut 0,025 mm </td><td>Elektron Mikroskopi Bilimleri</td><td>62091</td><td></td></tr><tr><td>35 mm poli-L-lizin kaplı cam tabanlı kap</td><td>MatTek</td><td>P35GC-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>%100 Petrol Jeli</td><td>Kroger</td><td>FL9958c</td><td></td></tr><tr><td>A1R Lazer Taramalı Konfokal Ters Mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements yazılımı</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 3D yazılımı</td><td>Bitplane AG</td><td>Imaris 7.2.3</td><td></td></tr><tr><td>OCT (Optik Koherens Tomografi)</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Kriyostat</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>Isıl olarak inaktive edilmiş koyun serumu</td><td>Invitrogen</td><td>16210-072</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponu</td><td>Laboratuvar yapımı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıçan monoklonal anti-RFP (5F8) </td><td>Chromotek</td><td>110411</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-Arl13b serumu</td><td>NeuroMab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fare monoklonal anti-Arl13b 1:5</td><td>NeuroMab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-Olig2</td><td>Chemicon</td><td>AB9610</td><td></td></tr><tr><td>Fare monoklonal Pax6</td><td>Gelişimsel Hibritoma Bankası</td><td>Pax6</td><td></td></tr><tr><td>Fare monoklonal antikoru Shh</td><td>Gelişimsel Hibridoma Bankası</td><td>5E1</td><td></td></tr><tr><td>Fare monoklonalleri Nkx2.2</td><td>Gelişimsel Hibridoma Bankası</td><td>74.5A5</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan poliklonal Ki67</td><td>Abcam</td><td>AB15580</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Moleküler Problar</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568</td><td>Moleküler Problar</td><td>A11031</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 350</td><td>Moleküler Problar</td><td>A11046</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;Kısaltma olarak kullanılan "chst" terimi, bağlama göre farklı anlamlar taşıyabilmektedir. Ancak bilimsel ve teknik literatürde yaygın olarak şu anlamlara gelebilir:

1. **Kısmi Higrometrik Stabilite Testi (Partial Hygroscopic Stability Test):** Malzeme bilimi veya eczacılıkta nem stabilitesini belirlemek için kullanılan bir test.
2. **Kimyasal Stabilite Testi (Chemical Stability Test):** Bir bileşiğin belirli koşullar altında kimyasal yapısını koruma yeteneğinin ölçülmesi.

Lütfen çevrilmesini istediğiniz tam metni veya terimin geçtiği bağlamı paylaşın; böylece ilgili bilimsel disipline uygun, en kesin teknik karşılığı sağlayabilirim.</td><td>Fisher</td><td>AC22989</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold solma önleyici reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo fare neuroepithelium tek hücre bölümler canlı görüntüleme

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Biz floresan işaretleri ve embriyonik fare neuroepithelium kültür dilim canlı görüntüleme entegre bir sistem geliştirdi. Biz izleme soy genetik hücre için mevcut fare hatları yararlandı: Bir Tamoksifen-indüklenebilir Cre hattı ve Cre-aracılı rekombinasyon üzerine dsRed ifade eden bir Cre muhabir hattı. Tamoksifen nispeten düşük düzeyde kullanarak, bize tek tek hücre bölünmeleri takip etmek izin, hücrelerin az sayıda rekombinasyon neden başardık. Ayrıca, bir Olig2-eGFP transgenik çizgi 1-3 kullanarak Sonic Hedgehog (Sus) sinyal için transkripsiyonel yanıt gözlenen ve kirpikler işaretleyici, Sstr3-GFP 4 ifade virüs kültürlü dilim nüfuz ederek kirpikler oluşumu izlenir. Görüntü için neuroepithelium, biz nöral tüp izole, E8.5 embriyolar hasat, görüntüleme odasına uygun kültür koşullarında sinir dilim monte ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme yapılır. Bizim eskiin vivo canlı görüntüleme yöntemi bize fizyolojik ilgili bir şekilde birincil kirpikler oluşumu ve Sus cevap göreli zamanlama değerlendirmek için tek bir hücre bölünmeleri izlemek için sağlar. Bu yöntem, kolayca farklı floresan işaretleri kullanarak adapte ve alanında yerinde ve gerçek zamanlı olarak hücre davranışlarını izlemek için hangi ile araçları sağlar olabilir.

Burada E8.5 fare neuroepithelium içinde tek bir hücre bölünmeleri ex vivo canlı görüntüleme yapılır. Tek tek hücrelerin etiketlemek için, rekombinasyon 5,6 (Şekil 3A) üzerine dsRed dile bir Cre muhabir satır içeren bir hücre alt grubunda Cre recombinase bağlı. Böylece, 48 saat sonra biz ex vivo görüntüleme (Şekil 4A-D) sırasında tek bir hücre bölünmeleri gözlemlemek mümkün. 1-3; etiketli hücreleri BAC transgenik Olig2-eGFP hattı (Şekil 4G-...

Burada için gerekli araçları geliştirmek<em&gt; Ex vivo</em&gt; Canlı görüntüleme fare E8.5 neuroepithelium tek hücre bölünmeleri izlemek için

Ex vivo Fare neuroepithelium Tek Hücre Bölümler Canlı Görüntüleme

Floresan işaretleyicilerin canlı görüntülemesi ile embriyonik fare nöroepitelyumu dilimlerinin kültürlenmesini entegre eden bir sistem geliştirdik. Şunlardan yararlandık...

Bu prosedürün genel amacı, floresan markerların canlı görüntülemesini fare embriyonik nöroepitelyum kesit kültürleri ile entegre etmektir. Bu, öncelikle görünür şekilde bölünen hücreleri genetik olarak işaretlemek için indüklenebilir Cre fare hattının Cre raporlayıcı hattı ile çaprazlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, tüm fare embriyoları diseke edilir ve lentivirüs varlığında in vitro olarak kültüre edilir.Ardından embriyo dilimlenir ve nöral tüp kesiti canlı görüntüleme için hazırlanır. Son olarak, nöral tüp dilimi zaman serili konfokal mikroskopi ile görüntülenir. Nihayetinde, ex vivo canlı görüntüleme aracılığıyla gelişmekte olan nöroepitel içindeki tek hücreli bölünmelerin gerçek zamanlı doğrudan gözlemini gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu protokolün güçlü yönü, bireysel hücreleri in vivo olarak izleyebilmemizdir; bu da her bir hücrenin davranışının yanı sıra sinyal iletim olayları hakkında sorular sormamıza olanak tanır. Başlamak için, Tamoksifen ile indüklenebilen Cree fare hattını, CAGG CRE ER, DS Red Cree raporcu hattı ile çaprazlayın. Kızı hücrelerde sonic hedgehog yanıtının göreceli zamanlamasını izlemek için CAGG CRE ER ds red hattını OG two EEG ile çaprazlayın.FP back transgenik farelerde, tamoksifen %100 Etanol içinde çözülmüş ve embriyonik hücrelerin küçük bir alt kümesinde CRE ekspresyonu ile DS red markalamasını indüklemek için gebeliğin E 6.5 aşamasındaki dişilere intraperitonal olarak enjekte edilmiştir. 48 saat sonra, embriyolar disseke edildikten sonra, DS red pozitif embriyoları belirlemek için floresan mikroskop kullanın. Embriyoları bir kültür kabına aktarın ve ex vivo görüntüleme sırasında tek hücre bölünmelerini gözlemleyin.E 8.5 embriyolarını, %10 yeni doğmuş dana serumu ve %1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş, D-M-E-M-F 12'nin bire bir çözeltisini içeren önceden ısıtılmış Yıkama ortamında disseke edin. Sahnesi 37 °C'ye ısıtılmış bir floresan mikroskop kullanarak veya 37 derecelik bir ısıtıcı plaka yanında çalışarak, embriyoların GFP ve/veya DS RED pozitif olduğunu hemen belirleyin. En fazla iki embriyoyu, önceden dengelenmiş 500 µL kültür ortamı damlasına aktarın.Buharlaşmayı önlemek için besiyerinin üzerine dengelenmiş hafif mineral yağından ince bir tabaka uygulayın ve embriyoları içeren kültür kabını 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında inkübe edin. Nöroepiteldeki siliya yapılarını işaretlemek için, embriyo içeren 500 µL dengelenmiş besiyeri damlasına, yaklaşık 2 milyon varyant içeren 5 ila 10 µL S sst, R 3G FP lentivirüsü ekleyin. 18 saatlik kültürleme süresinin ardından, virüsü uzaklaştırmak için enfekte olan embriyoyu birkaç damla yıkama besiyerine aktarın ve nöral tüp kesitlerini hazırlayın.Bir embriyoyu %1 agar kaplı bir kaba aktarın ve nöral tüpü diseke etmek için 0,025 milimetrelik bir mikro bıçak kullanın. 35 milimetrelik poli-L-lizini kaplı cam tabanlı bir kaba, fenol kırmızısı içermeyen dengelenmiş kültür ortamından 150 mikrolitrelik bir damla damlatın ve izole edilen nöral tüpü ventral tarafı aşağı gelecek şekilde ortam damlasının içine yerleştirin. Monte edilen nöral tüpün etrafına, petrol jellesi ve eritilmiş mumun bire bir karışımından küçük miktarlarda ekleyin ve örneği sabitlemek için bir lam camını nazikçe jellenin üzerine bastırın.Görüntüleme için kabı, dengelenmiş ince bir hafif mineral yağı tabakasıyla kaplayın. 37 °C ve %5 karbondioksit değerine ayarlanmış bir çevresel oda ile donatılmış ters konfokal mikroskop kullanın. GFP etiketli CLIA ve DS red pozitif hücreleri görüntülemek için 60 x yağ daldırma objektif ve bir 40 x yağ daldırma objektif kullanın.LIC iki GFP ve DS red pozitif hücrelerini izlemek için, zamanlapse görüntüleme koşullarını ayarlamak amacıyla NIS elements yazılımını açın. Her 10 dakikada bir, 1.5 mikron aralıklarla 25 mikrona kadar kalınlıkta z-stack'ler edinin. 40x objektif kullanırken ve 60x objektif için 0.4 mikron aralıklarla sekiz mikrona kadar stack'ler alırken, daha fazla talimat için metin protokolüne bakın.Dokuyu sabitleyip OCT içine gömdükten sonra, kesitler hazırlamak için bir kriyostat kullanın ve metin protokolüne uygun olarak immünofloresan uygulama yapın. Burada, bireysel hücreleri etiketlemek için E 8.5 fare nöroepitelindeki tek hücre bölünmelerinin ex vivo canlı görüntülemesini gerçekleştirdik. Rekombinasyon sonrası DS red eksprese eden bir Cree raporlayıcı hattı içeren hücrelerin bir alt kümesinde CRE rekombinazı indükledik; burada görüldüğü üzere, 48 saat sonra, modifiye edilmiş geri transgenik oli two EGFP hattı olan bir sonic hedgehog transkripsiyonel raporlayıcısı eklenerek ex vivo görüntüleme yoluyla tek hücre bölünmeleri gözlemlenmiştir.Hücrelerin sonic hedgehog'a ne zaman yanıt verdiğini izlemek amacıyla CLIA oluşumunu gözlemleyebildik; SST R 3G FP lentivirüsleri üretildi ve kültürdeki embriyoları enfekte etmek için kullanıldı. EG iki EGFP eksprese eden veya in vitro kültür sırasında SSTR 3G FP lentivirüsü ile enfekte edilen DS Red Cree raporcu embriyolarının zamanla seyreden konfokal görüntüleme sonuçları burada gösterilmektedir. Bu yaklaşımın güçlü yanlarından biri, mutant genetik alelleri arka plana dahil edebilmemizdir; bu da belirli genlerin bireysel hücre davranışı ve sinyalizasyon olayları üzerindeki etkilerini sorgulamamıza olanak tanır.

ex-vivo-live-imaging-of-single-cell-divisions-in-mouse-neuroepithelium

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Gerçek zamanlı görüntüleme embriyonik doku uzun süre boyunca meydan okuyor. Burada yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip uzun süre civciv omurilik hücresel ve alt hücresel değişikliklerin izlenmesi için bir test sunuyoruz. Bu teknik, sinir sistemi ve geliştirme embriyo diğer bölgeleri için adapte edilebilir.

Gelişmekte Neuroepithelium Hücre Davranış Yüksek çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

Kaynak: Daynac, M., et. al. Yetişkin Fare Subventriküler Bölgesinden Nöral Kök ve Progenitör Hücrelerin Hücre Sınıflandırması ve Hücre Döngü Dinamiklerinin Canlı Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2015)Bu video, transgenik bir fare beyninden alınan nöral kök hücrelerin (NSC'ler) konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak hızlandırılmış görüntülemesini göstermektedir. NSC'ler G1 fazı sırasında kırmızı floresan verir ve diğer hücre döngüsü fazlarında floresan değildir. Yapıştırılmış bir NSC kültürü...

Konfokal mikroskopi kullanılarak fare nöral kök hücre bölünmesinin hızlandırılmış görüntülenmesi

Kaynak: Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. Genetik Olarak Hedeflenmiş Retinal Hücre Popülasyonlarının Seyrek Adeno-İlişkili Virüs Etiketlemesini Kullanarak Nöronal Arborizasyonun Hızlandırılmış Görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, canlı fare retinal eksplantlarında dendritik dinamikleri görselleştirmek için konfokal mikroskopi kullanımını göstermektedir. Retinayı konfokal bir mikroskop altında stabilize etmek, yıldız patlaması amakrin internöronlarını görselleştirmek için epifloresan...

Fare Retinal Eksplantlarında Nöronal Dendritik Dinamiklerin Hızlandırılmış Konfokal Görüntülenmesi

Neuroblast göç postnatal nörojenezindeki temel bir olaydır. Biz akut beyin dilimleri zaman atlamalı görüntüleme kullanarak in vivo doğum sonrası elektroporasyon ve onların göç sonraki görselleştirme tarafından neuroblasts verimli etiketleme için bir protokol açıklar. Biz video izleme tarafından neuroblast dinamiklerinin kantitatif analiz için bir açıklama içerir.

Fare Akut Beyin Dilimleri Neuroblast Göç vivo Doğum Sonrası Elektroporasyonla ve Time-lapse Görüntüleme

Bu protokol, görüntüye Caenorhabditis elegans embriyolarında bir doku içinde bölünen hücreleri açıklamaktadır. Birkaç protokoller embriyonun erken görüntü hücre bölünmesi için, bu protokol nasıl mid geç embriyonik dönemde gelişmekte olan bir doku içinde hücre bölünmesi görüntü açıklar nasıl tarif ederken.

Sırasında Neuroblast Sitokinez görselleştirme<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriyo

Nöral progenitör mitoz nöron kritik bir parametredir. Nöral progenitör mitoz anlayışımızın çok sabit doku analizine dayanmaktadır. Embriyonik beyin dilimleri Canlı görüntüleme, kontrollü bir ortamda, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile mitoz değerlendirmek için çok yönlü bir tekniktir.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Bu protokol, dokunulmamış larva beyin bağlamında canlı hücre görüntüleme yapmak için kullanılan akıcı bir yöntem göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları sürekli daha önce gözardı mekanizmaları ortaya çıkarılması, asimetrik nöral kök hücre bölünmeleri çalışmanın yanı sıra diğer nörolojik ve gelişimsel süreçleri için paha biçilmezdir.

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Nöral kök hücreleri (NSC'ler) ve soylarını yetişkin fare beyninin subventriküler bölgesinden (SVZ) izole etmek için Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) tabanlı bir yöntem bildiriyoruz. Floresan Ubikitinasyon Hücre Döngüsü Göstergesi (FUCCI) transgenik farelere uygulandığında, canlı görüntüleme ile hücre döngüsü ilerlemesinin incelenmesine izin verir.

Hücre Yetişkin Fare subventricular Bölgesinden Nöral Kök ve Progenitör Hücreler Sıralama ve Hücre Döngüsü Dynamics Canlı görüntüleme

Burada, electroporated beyin organotypic dilim kültürler fare embriyo confocal mikroskobu ve canlı görüntüleme teknikleri için uygun oluşturmak için düşük maliyetli ve güvenilir bir yöntem sağlamak.

Eski Utero Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri

Ex vivo canlı görüntüleme, canlı dokulardaki hücresel hareketlerin ve etkileşimlerin dinamik süreçlerini incelemek için güçlü bir tekniktir. Burada, kültürlenmiş tüm yetişkin fare kesici dişlerinde diş epitel hücrelerini canlı izlemek için iki foton mikroskobu uygulayan bir protokol sunuyoruz.

Fare Diş Yenileme Sırasında Hücre Bölünmelerini ve Hareketlerini Araştırmak için Ex Vivo Canlı Görüntülemeyi Kullanma

Serebral korteksin gelişimi sırasında, nöronlar ve glial hücreler ventrikülü kaplayan ventriküler bölgeden kaynaklanır ve beyin yüzeyine doğru göç eder. Bu süreçte birçok gen yer alır. Bu protokol, göç eden nöronların ve glial progenitörlerin hızlandırılmış görüntüleme tekniğini tanıtır.

Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Öğrenin fare embriyonik nöroepiteliumunda tek hücre bölünmelerini canlı görüntüleme yöntemiyle. Zaman atlamalı konfokal mikroskopi kullanılarak hücre dinamikleri gerçek zamanlı gözlemlenir.

Ex vivo Fare neuroepithelium Tek Hücre Bölümler Canlı Görüntüleme

Daha fazla video keşfet