GFP etiketli Proteinlerin Görüntüleme Canlı Drosophila Oosit

Bu protokolde, GFP etiketli proteinleri eksprese eden sitler, dişi drosophila'dan diseke edilir ve proteinin canlı hücrelerdeki hareketini incelemek için görüntülenir. İlk olarak, bir kanal oluşturmak için silikon gres kullanarak bir slayta iki lam yapıştırarak bir görüntüleme odası hazırlayın. Kanalın kenarları halo karbon yağı ile kaplanmıştır.

Daha sonra, yumurtalıkları bir dişiden bir kapak fişi üzerinde bir damla halo karbon yağına disseke edin. Daha sonra tek tek sitleri izole edin ve bir görüntüleme odası oluşturmak için hazırlanan slayttaki kanal üzerinde kapak kızağını ters çevirin. Sitleri parlak alan veya DIC optiklerle bulduktan sonra, konfokal mikroskopi ve ilgili yazılımı kullanarak belirlenen zaman aralıklarında dijital görüntüler yakalayın.

Sonuç olarak, oluşturulan görüntülerin hızlandırılmış bir dizisi, proteinlerin veya parçacıkların zaman içinde canlı hücrelerdeki hareketini izlemek için kullanılabilir. Bu yöntem, protein ve mRNA kaçakçılığı gibi hücre ve gelişim biyolojisindeki kilit alanların araştırılmasına ve hücre polaritesinin kurulmasına yardımcı olabilir. İlk olarak, bir haftadan daha eski olan sağlıklı sinekleri uyuşturun ve yuvarlak krem renkli karınları olan 10 ila 15 büyük dişi seçin.

Seçilen sinekleri ve birkaç erkeği yeni hafif mayalı yiyecekler içeren bir şişeye aktarın. Daha sonra sinekleri yağlamak için 25 santigrat derecede iki gün kuluçkaya yatırın. Sineklerin şişmanlatılması, şişmanlatılmamış sineklerin veya zayıf şişmanlatılmış sineklerin görüntülenmesi için özellikle sekizinci aşamadan 12'ye kadar olan çeşitli aşamaların mevcut olmasını sağlar ve genellikle sadece çok erken aşamalar ve olgun sitler içerir Silikon gres kullanarak.

Standart bir cam kızağa yaklaşık bir santimetre aralıklarla iki kapak fişi yapıştırın. Kapak kayma ve kızak arasında iyi bir sızdırmazlık sağlamak için yalnızca yeterli gres kullanın. Gresi ince ve eşit bir şekilde yaymak için her bir kapak kızağına sıkıca bastırın.

Ardından, sonraki adımlarda izole sitlerin yaralanmasını önlemek için kapak kızakları arasındaki birleşim yerine bir miktar kutsal karbon yağı 27 ekleyin ve kaydırın. Şimdi 22 milimetre karelik bir kapak kaymasının yüzeyine iki ila üç damla karbon yağı 27 damlatın. Sonraki ağızda, gıda şişesinden tek bir dişi pipetleyin ve yavaşça halo Caron yağına bırakın.

Keskin diseksiyon forsepsleri kullanarak, sineği kapak kaymasına karşı sabitleyin ve karnın ucunu çekin. Sitlerin kapak kızağına yapışmasını sağlamak için yumurtalıkları kapak kaymasının yüzeyi boyunca yağın altına sürükleyerek çıkarın. Şimdi yumurtalıkları nazikçe ayırın ve en az Oogenesis'in 10 B aşaması olan sitleri arayın.

Bu aşamada, oositin yumurta odasının toplam hacminin en az% 50 ila 60'ını kapladığı yumurta odalarını arayarak oositleri tanımlayın. Forseps kullanarak. Bir ila üç dişi kullanarak tek tek oositleri oval kılıftan çıkarın.

Kapak kaymasında beş ila sekiz hasarsız oositi izole etmeye devam edin. Ardından kullanılamayan dokuları çıkarın. Oositleri içeren kapak fişini, sitler iki Ara Parça arasına yerleştirilecek şekilde önceden hazırlanmış lam üzerine dikkatlice ters çevirin.

Ve unutmayın, gerekirse sitlere zarar verebileceği için lamele üzerine bastırmayın, boşluğun dolduğundan emin olmak için sandviçin kenarlarına az miktarda halo karbon yağı ekleyin. Oogenezin bu noktasında, oositin üzerindeki folikül hücrelerinin, hemşire hücrelerine bağlantıların kaldığı küçük bir bölge dışında, oositi her taraftan çevrelediğine ve çevrelediğine dikkat edin. DIC veya faz kontrast optiği kullanarak bir oositi odaklayın.

Oositi sitoplazma sızıntısı veya folikül hücrelerinin şişmesi gibi herhangi bir hasar belirtisi açısından inceleyin. Yalnızca sağlıklı ve hasarsız görünen oositleri görüntüleyin. Akışı GFP etiketlemesi olmadan doğrudan izlemek için.

Yakalama görüntülerini, GFP etiketli proteinler için kullanılanlardan daha yüksek kazanç ayarlarıyla kapsamın ZI aralığında ayarlayın. Numunenin sürüklenmesini ve hareketini büyük ölçüde en aza indirmek için hava hedeflerinin kullanılması. Oosit yüzeyinin hemen altında optik kesitler elde edin.

İlgilenilen bir bölge netlendiğinde, parlak alan optiklerini kapatın ve yazılımın hızlı tarama önizleme işlevini kullanarak konfokal görüntülemeye geçin, odağı ayarlayın ve gerektiği gibi kazanç elde edin. Ayrıca, uyarma, dalga boyu ve emisyon dalga boyu için parametreleri ayarlayın. Z ekseni yakalama için, kareler arasında 10 saniyelik bir gecikme olan sabit bir Z ekseni seçin.

20 ila 50 karelik tipik bir zaman atlamalı dizi yakaladıktan sonra, video kalitesini hemen gözden geçirin ve değerlendirin. Bu tek zaman atlamalı görüntü, 11. evre bir oositi göstermektedir. GFP etiketli protein R TNL'yi ifade eden bu oosit, güçlü bir sinyal üretebilir.

R TNL, op plazmik akış sırasında mevcut olan uzun mikrotübüllerle birlikte lokalize gibi görünmektedir. Tipik olarak, yabani tip bir yumurta odasındaki op plazmik akış, bir aşama 10 B yumurta odasının beş karelik maksimum projeksiyonunda gösterildiği gibi, otofloresan ylk veziküllerinin gözle görülür hareketi olarak belirgindir. Bu videoyu izledikten sonra, GFP etiketli proteinleri ifade eden sağlıklı dişi sitlerin nasıl izole edileceğini, canlı görüntüleme için örneklerin nasıl hazırlanacağını ve floresan proteinlerin ve partiküllerin hızlandırılmış videolarının nasıl çekileceğini iyi anlamış olmalısınız.