Name: Sivrisinek Gut Metagenomic RNA-seq Ribozomal RNA tükenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Öğrenin, sivrisinek bağırsak örneklerinden ribozomal RNA'yı %90-99 oranında tüketerek mRNA'yı zenginleştirme yöntemini. Bu protokol, metatranskriptom analizi ve mikrobiyal ekoloji araştırmaları için RNA-seq veri kalitesini artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH hibe 1SC2GM092789-01A1 tarafından desteklenen, ve MS NMSU Howard Hughes Tıp Enstitüsü Lisans Araştırma Programları bir araştırma bilim adamı oldu. Video yönetmen ve yapımcı Amy Lanasa tarafından NMSU de Creative Media Enstitüsü ile Dr Philip Lewis tarafından koordine edilmiştir.

Prosedür 1. Sivrisinek Yetiştirme <ol><li> 27.5 bir insectary Arka sivrisinek Anofel gambiae G3 zorlanma ° C / karanlık ışığın% 80 nem ve 12:12 saat döngüsü ile. </li><li> Oranı 1:1 bira mayası ile zemin kedi maması ile larva besleme. </li><li> 3. gün yumurta üretimi için post-ortaya Farelerde kan yetişkin sivrisinekler besleyin. </li></ol> 2. Sivrisinek Gut Diseksiyon <ol><li> Otoklav diseksiyon araçları (slaytlar ve forseps). </li><li> Bir aspiratörü kullanarak 50 sivrisinek toplayın ve CO 2 akış yatağı (Ultimate Flypad) üzerine koyun. Sivrisinek vücut yüzeyi temizlemek için% 70 etanol içeren üç petri sırayla bir sivrisinek örneği durulayın. </li><li> Bir stereomikroskobi altında bir cam slayt üzerine numune yerleştirin. Gut çıkarın. </li><li> Metagenomic DNA izolasyonu için koşul başına 50 cesareti toplayın. Metagenomic RNA izolasyonu için koşul başına 50 cesareti toplayın. </li></ol&gt; 3. Metagenomic DNA İzolasyonu Not: Metagenomic DNA aşağıda açıklanan değişiklik ile Meta-G-Nome DNA izolasyon kiti (Epicentre Biotechnologies) kullanılarak izole edilir. <ol><li> 300 ul TE 50 sivrisinek bağırsaklar yerleştirin. Buz üzerinde hız 2.000 rpm Bio-Gen PRO200 homojenizatör (PRO Bilimsel Inc, ABD) kullanılarak 1 dk için onları homojenize. </li><li> Hazır-Lyse Lizozim Çözüm 2 ul RNaz hücre süspansiyonu A 1 ul ekleyin. 30 dakika 37 ° C&#39;de vorteks ve inkübe Mix by. </li><li> Meta-Lizis çözeltisi (2X) ve tüp ile Proteinaz K ve 1 ul 300 ul ekle. Vorteks ile karıştırın. Kısaca çözeltinin her tüpün tabanında olduğundan emin olmak için tüp darbe santrifüjden, ve 3-5 dakika için buz üzerinde daha sonra oda sıcaklığına kadar soğutulur 15 dak, yer için 65 ° C sıcaklıkta inkübe edilir. </li><li> 10 saniye boyunca kuvvetlice vorteks tüpü ve karıştırın MPC Protein yağış reaktifi 350 ul ekleyin. </li><li> Pelet t4 azından 12,000 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj ile çöpleri ° C. </li><li> Temiz bir 2 ml tüp için supernatant aktarın ve pelet atın. </li><li> Süpernatant ile izopropanol 570 ul ekle. Ters tüp birkaç kez karıştırın. </li><li> Pelet 4 12,000 x g&#39;da 10 dakika için santrifüjleme ile DNA ° C. DNA pelet oradan çıkarmadan izopropanol çıkarın. </li><li> Pelet yıkamak için% 75 etanol 500 ul ekleyin. 4 ° C&#39;de 12,000 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje DNA pelet bozmadan etanol çıkarın. 2 dakika için oda sıcaklığında pelet Hava kurutun. Not: DNA pelet aşırı kuru etmeyin. </li><li> TE tamponu 50 ul DNA pelet yeniden süspanse edin. </li><li> Bir% 1 agaroz jeli üzerinde jel elektroforezi yolu ile, kitte sağlanan; Fosmid Kontrol DNA (100 ng / ml &#39;den 40 kb) ile kıyasla izole edilmiş DNA&#39;nın boyutu ile doğrula. </li></ol> 4. Toplam RNA İzolasyonu Not: çalışma alanı temizleyinRNaz kontaminasyonu en aza indirmek için RNaseZap ile. Metagenomic RNA, küçük bir değişiklik ile TriPure İzolasyon Reaktif (Roche) kullanılarak sivrisinek gut örneklerden izole edilmiştir. <ol><li> 500 ul TriPure İzolasyon Reaktifi ile 2 ml tüp içinde 50 sivrisinek cesaretlenin. Bir homojenizer kullanarak, buz üzerinde hızlı 2.000 rpm&#39;de 1 dakika için homojenize edilir. Nükleoprotein komplekslerin dissosiyasyon imkan vermek üzere 5 dakika oda sıcaklığında bekletin. </li><li> 12 sn için 100 ul kloroform ve vorteks ekleyin ve 2 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. </li><li> 10 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de santrifüjleyin. Dikkatlice rahatsız ayrılmış aşamaları olmadan tüpü çıkarmak. </li><li> Yeni bir tüp ile sulu faz transfer, 250 ul izopropanol eklemek iyice karıştırılır, ve 20 dakika süre ile -20 ° C&#39;de koydu. </li><li> 4, 10 dakika için 12,000 x g&#39;de santrifüjleyin ° C&#39;de çökelti RNA için. </li><li> Pelet oradan çıkarmadan Süpernatantı atın. 750 ul% 75 etanol ile pelet yıkayın. </li><li> Pelet bozmadan süpernatant kapalı pipet. Air 2 dakika süreyle tüp kurulayın. </li><li> 30 ul nükleaz ücretsiz su ile RNA tekrar. </li><li> 20 dk için 37 ° C &#39;de DNaz ile tedavi edilen toplam RNA ve daha sonra 75 ile inkübe ederek DNase inaktive 15 dakika için ° C. 30 ul nükleaz ücretsiz su etanol ve tekrar süspansiyon RNA ile Çökelti RNA. </li><li> Bir Nanodrop kullanılarak toplam RNA miktarını belirleyin. </li></ol> 5. Ribozomal RNA tükenmesi Not: Bu protokol daha önce tarif edilen yöntemler 12,13,15 üzerinde geliştirilmiştir. <ol><li> Ribozomal RNA gen fragmanlarının PCR amplifikasyon Bu adım, toplam RNA örnek rRNA için ücretsiz olan anti-sense RNA (arRNA) probları üretmek için in vitro transkripsiyon için şablon olarak kullanılacak örnek özgü rRNA havuzları, oluşturur. <ol><li> RRNA fragmanı PCR (Tablo 1) primer setleri tasarlayın ve sentez. </li><li> 50 PCR Çalıştır50 ng DNA şablonu, 1 x PCR tamponu, 1.5mM Mg 2 ile Taq DNA polimeraz (Qiagen) kullanılarak ul reaksiyon, Cl, denaturasyon, 94 ve 35 döngü ile 0.2 uM primerler ° C&#39;de 10 saniye, 40 saniye, 15 ° C&#39;de tavlama için bakteri 23S amplikon, ve 50 ° C diğer amplikonlar ve 72 uzatılması için 1 dk (72 nihai uzatma ° C de 5 dakika) için ° C. </li><li> % 1 agaroz jel üzerinde PCR ürünleri görün. </li><li> 50 ul yıkama tamponu ile elüsyon QIAquick PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünleri temizler. Nanodrop kullanılarak konsantrasyon ölçülmesine imkan verirler. </li></ol></li><li> Biotin-etiketli anti-sense rRNA probları (arRNA) in vitro transkripsiyon olarak. Not: Bu basamakta, çeşitli rRNA gelen amplikonlar örnek özel problar MEGAscript T7 kiti kullanılarak sentezlenmiştir. <ol><li> Aşağıdaki maddeleri (Tablo 2) karıştırılması ile her bir örnek için özel rRNA amplikon bir 20 ul reaksiyon ayarlayın. 37 gece inkübe ° C <strong&gt; Not: genellikle reaksiyon verimi&gt; 50 mg RNA. </li><li> DNA şablonu kaldırmak için 20 dakika boyunca 37 ° C de inkübe etmek ve reaksiyon 1 ul DNase I (kitinde) ekleyin. </li><li> 4, 10 dakika için 12,000 x g&#39;da reaksiyon için 100 ul% 100 etanol, santrifüj ekleme ° C arRNA sentezlendi çökeltilir. Süpernatantı atın ve 750 ul% 75 etanol ile pelet yıkayın. 50 ul nükleaz ücretsiz su süspanse RNA problar. </li><li> Bir Nanodrop kullanarak RNA konsantrasyonu niceliğini. -80 Mağaza probları ° C </li></ol></li><li> biotinlenmiş arRNA ile rRNA çıkarma. Not: Bu adım, toplam RNA örnek rRNA için melezleşme biotinlenmiş arRNA kullanır. RRNA arRNA melezler streptavidin kaplı manyetik boncuk tarafından yakalanır. Prosedür küçük değişiklik ile referans 13&#39;de tarif edilen protokole dayanmaktadır. <ol><li> Reaktifler <ol><li> 0.1 N NaOH, 20X sodyum klor hazırlayınide-sitrat (SSC) ve% 20 formamid 1 X SSC. </li></ol></li><li> Melezleme <ol><li> Bakteriyel 16S ve 23S probları (0.75 mikrogram her), sivrisinek 18S ve 28S probları (0.75 mikrogram adet) 1 mg total RNA karıştırın, 1 ul RNaz inhibitörü, 2.5 ul 20X SSC tamponu, 200 ul PCR tüp 10 ul% 100 formamid , 50 ul ekleyin nükleaz ücretsiz su. </li><li> 70, bir termal döngü cihazı ve inkübe reaksiyon tüpü yerleştirin ° C de 5 dakika ikincil yapı açmak ve 25 aşağı rampa ° C rRNA ve arRNA hibridizasyon probları izin vermek için 1 dakika her biri ° C de 5 ° C lik artışlarla kullanarak. </li></ol></li><li> RRNA Kaldırma <ol><li> 1.7 ml tüp içine 300 ul streptavidin kaplı boncuklar aktarın. Boncuk hareketsiz bir manyetik ayırma raf tüp yerleştirin. Süpernatantı. 0.1N NaOH ve mil ve 300 ul içinde süspanse boncukiyi x. Manyetik raf geri tüpü yerleştirin ve süpernatant kapalı Pipeti. Iyice karıştırın, 1X SSC 300 ul boncuklar tekrar süspansiyon, boncuk immobilize ve süpernatant kapalı Pipeti. 1X SSC bir kez daha 300 ul yıkama tekrarlayın. </li><li> Boncuk 3 alikotları, 100 ul, her biri 1.7 ml tüpler olun. Manyetik raf tüp yerleştirin ve pipetleme tarafından süpernatant kaldırmak. Not: boncuk alikotları biyotinile rRNA arRNA melez yakalama 3 tur için kullanılır. </li><li> 50 ul hibridizasyon reaksiyona girerek% 20 formamid 50 ul 1X SSC ekleyin. İlk boncuk kısım tüpüne reaksiyon aktarın ve iyice karıştırın. Biotinlenmiş prob-rRNA melezleri streptavidin boncuk tarafından yakalanan izin vermek için 10 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin. Tüp inkübasyon sırasında karıştırmak için her 2 dakikada Flick. </li><li> Boncuk hareketsiz manyetik raf tüp yerleştirin, ikinci aliq için süpernatant aktarmakboncuk uot, iyice karıştırın ve yukarıdaki gibi kuluçkaya yatmaktadır. Boncuk üçüncü tüp içine Süpernatant aktararak üçüncü yakalama gerçekleştirilmesi. Karıştırın ve inkübe. </li><li> Üreticinin kılavuzunu takip formamid kaldırmak RNeasy MinElute kitini kullanarak yeni bir tüp ve davranış arıtma içine non-rRNA süpernatant aktarın. </li><li> Bir Bioanalyzer (Şekil 4) bir Agilent RNA 6000 Pico yonga seti kullanarak rRNA tükenmesi verimliliğini kontrol edin. </li></ol></li></ol></li></ol> Not: rRNA tüketilmiş RNA numuneleri 8 gerekirse amplifikasyon mRNA tabi tutulur.

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing+the+Bemisia+tabaci+Transcriptome+Reveals+a+Highly+Diverse+Bacterial+Community+and+a+Robust+System+for+Insecticide+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing the Bemisia tabaci Transcriptome Reveals a Highly Diverse Bacterial Community and a Robust System for Insecticide Resistance.</a> PLoS One. 7, e35181(2012).</li>
<li>Xie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+the+metatranscriptome+of+the+protistan+community+in+Coptotermes+formosanus+with+emphasis+on+the+lignocellulolytic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Profiling the metatranscriptome of the protistan community in Coptotermes formosanus with emphasis on the lignocellulolytic system.</a> Genomics. 99, 246-255 (2012).</li>
<li>Gosalbes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metatranscriptomic+approach+to+analyze+the+functional+human+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Metatranscriptomic approach to analyze the functional human gut microbiota.</a> PLoS One. 6, e17447(2011).</li>
<li>Urich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+assessment+of+soil+microbial+community+structure+and+function+through+analysis+of+the+meta-transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Simultaneous assessment of soil microbial community structure and function through analysis of the meta-transcriptome.</a> PLoS One. 3, e2527(2008).</li>
<li>Gilbert, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+large+numbers+of+novel+sequences+in+the+metatranscriptomes+of+complex+marine+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Detection of large numbers of novel sequences in the metatranscriptomes of complex marine microbial communities.</a> PLoS One. 3, e3042(2008).</li>
<li>Gifford, S. M., Sharma, S., Rinta-Kanto, J. M., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+a+deeply+sequenced+marine+microbial+metatranscriptome%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of a deeply sequenced marine microbial metatranscriptome.</a> ISME J. 5, 461-472 (2011).</li>
<li>Poretsky, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+day%2Fnight+metatranscriptomic+analysis+of+microbial+communities+in+the+North+Pacific+subtropical+gyre%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative day/night metatranscriptomic analysis of microbial communities in the North Pacific subtropical gyre.</a> Environmental microbiology. 11, 1358-1375 (2009).</li>
<li>Shrestha, P. M., Kube, M., Reinhardt, R., Liesack, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+activity+of+paddy+soil+bacterial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional activity of paddy soil bacterial communities.</a> Environmental Microbiology. 11, 960-970 (2009).</li>
<li>Mettel, C., Kim, Y., Shrestha, P. M., Liesack, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+mRNA+from+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Extraction of mRNA from soil.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76, 5995-6000 (2010).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+two+ribosomal+RNA+removal+methods+for+microbial+metatranscriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Validation of two ribosomal RNA removal methods for microbial metatranscriptomics.</a> Nat. Meth. 7, 807-812 (2010).</li>
<li>Pang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+mRNA+purification+by+magnetic+capture-hybridization+method%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bacterial mRNA purification by magnetic capture-hybridization method.</a> Microbiol. Immunol. 48, 91-96 (2004).</li>
<li>Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+quantitative+analyses+of+a+universal+rRNA-subtraction+protocol+for+microbial+metatranscriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics.</a> ISME J. 4, 896-907 (2010).</li>
<li>Wang, Y., Gilbreath, T. M. 3rd, Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+gut+microbiome+across+life+history+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae+in+Kenya%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya.</a> PLoS One. 6, e24767(2011).</li>
<li>Su, C., Sordillo, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+enrich+mRNA+from+total+prokaryotic+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A simple method to enrich mRNA from total prokaryotic RNA.</a> Mol. Biotechnol. 10, 83-85 (1998).</li>
<li>Gusmao, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture-dependent+and+culture-independent+characterization+of+microorganisms+associated+with+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29+%28L.%29+and+dynamics+of+bacterial+colonization+in+the+midgut%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Trop%22%5BJournal%5D)">Culture-dependent and culture-independent characterization of microorganisms associated with Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) (L.) and dynamics of bacterial colonization in the midgut.</a> Acta Trop. 115, 275-281 (2010).</li>
<li>Lindh, J. M., Terenius, O., Faye, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((16S+rRNA+gene-based+identification+of+midgut+bacteria+from+field-caught+Anopheles+gambiae+sensu+lato+and+A.+funestus+mosquitoes+reveals+new+species+related+to+known+insect+symbionts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">16S rRNA gene-based identification of midgut bacteria from field-caught Anopheles gambiae sensu lato and A. funestus mosquitoes reveals new species related to known insect symbionts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 7217-7223 (2005).</li>
<li>Simon, C., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+analyses%3A+past+and+future+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Metagenomic analyses: past and future trends.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1153-1161 (2011).</li>
<li>Wang, Y., Qian, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservative+fragments+in+bacterial+16S+rRNA+genes+and+primer+design+for+16S+ribosomal+DNA+amplicons+in+metagenomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies.</a> PLoS One. 4, e7401(2009).</li>
<li>Hunt, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+23S+rRNA+PCR+primers+for+use+in+phylogenetic+studies+of+bacterial+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 23S rRNA PCR primers for use in phylogenetic studies of bacterial diversity.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2221-2225 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Karmaşık bir mikrobiyal topluluk sivrisinek bağırsak ekosistemi 14,16,17 bulunur. Metatranscriptomic sıralama (RNA-seq) tüm mikrobiyal transcriptome 4,18 sorgulayarak bağlam bağımlı işlevsel bilgileri açığa çıkartabilir. Teknik olarak, prokaryotik mRNA oligo-d (T) aracılı zenginleştirme dolayı stabil poli haberciler (A) kuyrukları olmaması için geçerli değildir. Alternatif olarak, rRNA mRNA zenginleştirme tabakasının incelmesi için kullanılmıştır. Burada, sivrisinek bağırsak mikrobiyal topluluk çok...

Gelecek nesil dizileme teknolojisi büyük ölçüde taksonomik kompozisyonu ve mikrobiyal topluluk genetik işlevselliğini değerlendirmek için izin vererek metagenomik çalışmada ilerlemiştir. RNA-Dizileme (RNA-Seq) 1 farklı bağlamlarda 2-5 mikrobiyal metatranscriptomes araştırmak için kültüre dayalı yöntemler atlayabilir. Prokaryotik mRNA türleri stabil polyadenylated değil gibi mikrobik RNA-seq için büyük bir engel, mRNA zenginleştirici güçlüktür. Bu nedenle, oligo d (T) aracılı messenger zenginleşme geçerli değildir. Bol rRNA kaldırılmasını mRNA zenginleştirmek için alternatif bir yaklaşımdır. Böyle Microexpress Bakteriyel mRNA Zenginleştirme kiti (Ambion), RiboMinus transcriptome İzolasyon Kiti (Bakteri) (Life Technologies), ve tercihen bir eksonükleaz ile rRNA alçaltır mRNA-SADECE Prokaryotik mRNA İzolasyon kiti (Epicentre) gibi Ticari rRNA tükenmesi kitleri, kullanılmış rRNA 6-8 kaldırmak için. Microexpress Ancak, yakalama problarıya RiboMinus (imalatçılarının şartnamelerine bakın) tipik Gram-pozitif ve Gram-negatif bakteriler bilinen rRNA kaldırılması için iyi, ama bilinmeyen mikroplardan rRNA ile daha az uyumludur. Sonuç olarak, kaldırma Metagenomic örnekler 8-10 için daha az etkili olabilir. Ekzonükleaz tedavi 11 verildiğinde yanı sıra, mRNA bolluk aslına uygunluk sorgulanabilir. Genel olarak, çıkarma tabanlı rRNA tükenmesi az önyargılı ve Metagenomic ayarları 10-13 mRNA zenginleştirme daha etkili olmuştur. Sivrisinek gut dinamik mikrobiyal topluluk 14 barındırmaktadır. Biz RNA-Seq kullanarak sivrisinek bağırsak mikrobiyomları fonksiyonunu karakterize ilgilendi. Sivrisinek bağırsaklar izole edilen bir RNA örnek olarak, her ikisi de mikrobiyal sivrisinek ve RNA bulunmaktadır. Burada, biz verimli eksiltici hibridizasyon ile sivrisinek ve mikrobiyal rRNA tüketmek topluluk belirli rRNA probları kullanmak üzere değiştirilmiş bir protokol açıklar. Elde edilen mRNAzenginleştirilmiş örnekleri RNA-Seq için uygundur. Genel akışı Şekil 1 &#39;de tasvir edilmiştir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material </td></tr><tr><td>Meta-G-Nome DNA izolasyon kiti</td><td>Epicentre</td><td>MGN0910</td><td>Metagenomik DNA izolasyonu</td></tr><tr><td>TriPure </td><td>Roche</td><td>11667165001</td><td>Mdetagenomik RNA izolasyonu</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 kiti</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td>RNA problarının in vitro sentezi</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td>RNase Serbest çalışma alanı </td></tr><tr><td>Biotin-16-UTP</td><td>Roche</td><td>11388908910</td><td>RNA'nın in vitro sentezi</td></tr><tr><td>Biotin-11-CTP</td><td>Roche</td><td>4739205001</td><td>RNA'nın in vitro sentezi</td></tr><tr><td>Streptavidin manyetik boncuklar</td><td>NEB</td><td>S1420S</td><td>rRNA hibritlerinin yakalanması</td></tr><tr><td>Manyetik ayırma rafı</td><td>NEB</td><td>S1506S</td><td>rRNA hibritlerinin yakalanması</td></tr><tr><td>RNeasy mini kiti</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td>Çıkarılmış RNA</td></tr><tr><td>RNaz İçermeyen DNaz Seti</td><td>QIAGEN'in</td> saflaştırılması <td>79254</td><td>Uzaklaştırma DNA kontaminasyonu </td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico Kiti</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>5067-1513</td><td>RNA</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment elektroferogramı </td></tr><tr><td>Bio-Gen PRO200 Homojenizatör</td><td>PRO Scientific</td><td>01-01200</td><td>Sivrisinek bağırsak dokusu homojenizasyonu</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spektrofotometre</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>DNA & RNA kantitasyonu</td></tr><tr><td>2100 Biyoanalizör</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>G2940CA</td><td>RNA elektroferogramı</td></tr></tbody></table>

sivrisinek gut metagenomic rna-seq ribozomal rna tükenmesi

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

Sivrisinek gut böceğin yaşam döngüsünün farklı aşamaları boyunca dinamik mikrobiyal topluluklar barındırmaktadır. Gut toplumun genetik kapasite ve işlevselliğe Karakterizasyonu sivrisinek hayatı özellikleri üzerine gut mikrobiyotasına etkileri içgörü sağlayacaktır. Metagenomic RNA-Seq bir mikrobiyal topluluk bulunan çeşitli mikroplardan transcriptomes analiz için önemli bir araç haline gelmiştir. RRNA yaklaşık% 90&#39;ını oluşturmaktadır ise mesajcı RNA genellikle total RNA sadece% 1-3 oluşmaktadır. Çoğu prokaryotik mRNA türleri istikrarlı poli (A) kuyrukları eksikliği nedeniyle bir Metagenomic mikrobiyal RNA örnek mesajcı RNA zenginleştirmek için zordur. Bu oligo d (T) aracılı mRNA izolasyon önler. Burada, rRNA bir Metagenomic toplam RNA örnek rRNA kaldırmak için problar yakalamak türetilmiş örnek kullanan bir protokol açıklar. Başlamak için, sivrisinek ve mikrobiyal küçük ve büyük alt ünite rRNA parçaları hem Metagenomic topluluk DNA örneğinden güçlendirilir. Daha sonra, CommuSon veriler özel biyotinli antisense RNA probları T7 RNA polimerazı kullanılarak in vitro olarak sentezlenir. Biotinlenmiş rRNA probları toplam RNA melezi. Melez streptavidin kaplı boncuklar tarafından yakalanır ve toplam RNA kaldırılır. Bu çıkarma tabanlı protokol verimli total RNA örnek sivrisinek ve mikrobiyal rRNA hem kaldırır. MRNA, zenginleştirilmiş bir numune, RNA amplifikasyonu ve RNA-Seq için işleme tabi tutulur.

, (2) numune belirli bir yakalama rRNA probları yaratılması; rRNA (3) azalması eksiltme hibridizasyon ile total RNA rRNA PCR Metagenomic DNA şablonları (1) Hazırlık: Protokol üç bölümden oluşmaktadır. Yüksek kalite Metagenomic DNA ve RNA İzolasyonu tüm süreci esastır. Değiştirilmiş Meta-G-Nome DNA izolasyon protokol olarak Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi sivrisinek bağırsaklar yüksek kaliteli Metagenomic DNA, elde edilir. Sivrisinek cesareti yüksek kalitede toplam RNA izole etmek zor olabilir. Bu, büyü...

A ribozomal RNA (rRNA) azalması protokolü sivrisinek bağırsak metatranscriptome RNA-seq mesajcı RNA (mRNA) zenginleştirmek için geliştirilmiştir. Çıkarma yoluyla rRNA kaldırmak için kullanılan örnek belirli rRNA probları, sivrisinek ve onun bağırsak mikropları oluşturulmuş. Protokol performans rRNA yaklaşık olarak% 90-99 arasında kaldırma neden olabilir.

Sivrisinek Gut Metagenomic RNA-seq Ribozomal RNA tükenmesi

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Herkese merhaba. Bu, New Mexico Eyalet Üniversitesi Biyoloji Bölümü'nden Dr. Xenon Zu'nun laboratuvarından Fana Kla. Sivrisinek bağırsak ekosisteminin metagenomiği üzerinde çalışıyoruz.Bugün, haberci RNA-Seq için RNA'yı zenginleştirmek için toplam RNA örneklerinden ribozomal RNA'yı tüketmek için A sürecinizi göstereceğiz. RNA-Seq, mikrobiyal topluluğun işlevlerini incelemek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. İlk olarak, size toplam RNA ve metagenomik DNA'yı kas bağırsağından nasıl izole edeceğinizi göstereceğim.Analys Gambiya sivrisinekleri bir insectory'de tutulmaktadır. Sivrisinekler önce şekerli un ile beslenir, daha sonra dişi sivrisinekler ACHE üretimi için fareler üzerinde beslenir. Bu sivrisinekler şekerle beslenir ve bunlar fare kanı ile beslenir.İşlem öncesi tüm diseksiyon aletleri ve lamlar sterilize edildi. Sivrisinekler, bir Petri kabında üç kez% 70 etanol ile yüzey temizlenir ve etanolü kurutmak için bir cam slayta geri yerleştirilir, sivrisinekleri farklı bir cam slayta yerleştirin ve bir damla steril bir XPBS çözeltisi koyun. Sonra yavaşça bağırsağı dışarı çekin.Sivrisinek bağırsakları sırasıyla metagenomik DNA ve toplam RNA elde etmek için kullanılacaktır. RNA çalışmasına başlamadan önce, eldiven giyerken ribonükleaz içermeyen bir ortamı koruyarak RNA bozulmasını önlemek için standart önlemler almak, çalışma alanı pipetlerini ve gerekli tüm aparatları r nay özsuyu ile temizlemek önemlidir. İşlemden önce 50 bağırsak toplayın ve bunları pu reaktifleri içeren 1.5 mililitrelik bir einor tüpüne yerleştirin.Toplam RNA izolasyonu genomik için, DNA, bir metagenomik izolasyon kiti kullanılarak 50 bağırsaktan oluşan başka bir partiden izole edilir. RNA veya DNA konsantrasyonu NanoDrop kullanılarak ölçülür. Toplam RNA örneğinden ribozomal RNA'yı çıkarmak için RNA çıkarmamızı kullandık.İlk olarak, örneğe özgü RRNA fragmanları, bağırsak örneklerinden aldığımız genomik DNA'dan PCR ile amplifiye edilir. PCR ürünleri, bir Qiagen PCR saflaştırma kiti kullanılarak saflaştırılır. Bu adımda, antisens RRNA problarını sentezlemek için T yedi RNA polimeraz kullanılır.Birinci adımdaki PCR ürününü ve Biyotinillenmiş CTP ve UTP'yi kullanarak bir reaksiyon ayarlayın. Daha sonra reaksiyonu gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Artık antisens RRNA probları, RRNA tükenmesi için kullanıma hazırdır.Bu adım, toplam RNA örneğinde, hedef RRNA'da ve RRNA probunda hedef RRNA'yı yakalamak için BİYOTINİLASYONLU RRNA problarını kullanır. Melezler daha sonra strep bölücü kaplamalı manyetik boncuklar ile yakalanır. Hibridizasyon reaksiyonunu bir PCR tüpüne yerleştirin ve 70 santigrat derecede beş dakika boyunca bir termal döngüleyicide inkübe edin.Ardından sıcaklığı 25 santigrat dereceye düşürün. Reaksiyon devam ederken RRNA hibridizasyonuna izin vermek için boncukları hazırlayın. İlk önce, üç alikot yapın.Tüp başına 100 mikrolitre boncuk kullanarak. Boncukları bir XSSC solüsyonu ile üç kez yıkayın. Sonra tüpleri buzun üzerinde bırakın.Reaksiyon hazır olduğunda,% 20 form amid ile 100 mikrolitre bir XSSC eklenerek seyreltilir. Reaksiyon çözeltisini boncuklarla birlikte tüpe aktarın. İyice karıştırın ve ardından oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.Tüpü ara sıra hafifçe vurarak, tüpü kısa bir süre döndürün ve manyetik rafa yerleştirin. Süper natini bir toplama tüpüne aktarın. Boncukları her biri 100 mikrolitre ile iki kez daha yıkayın.Bir XSSC tampon çözeltisi eklendi. İyice karıştırın ve ardından manyetik raftaki boncukları yeniden yakalayın. Süpernatanları toplama tüpüne aktarın.Şimdi tüpte RRNA tükenmiş bir RNA örneğimiz var. Qiagen'in RN easy minikit'ini kullanarak saflaştırma gerçekleştirin. Talimatları izleyerek, şimdi tükenmenin etkinliğini kontrol ediyoruz.RNA örnekleri bir Agilent RNA 6.000 PICO çipine yüklenir ve 2100 biyoanalizörden geçirilir. Çıkarmadan önce. Sırasıyla 16 s ve 23 s olmak üzere iki ribozomal RNA zirvesi vardı.Çıkarmadan sonra, RRNA zirveleri etkili bir şekilde çıkarıldı. Kalan RNA, 200 baz çifti ile dört kilobaz arasındaki boyut aralığındadır. Artık RNA örneği, transkriptom dizilimi için bir CD NA kütüphanesi oluşturmaya hazırdır.Biz sadece haberciyi, RNA'yı RNA için zenginleştirme prosedürü boyunca size yol gösteriyoruz. Aramak. Bizi izlediğiniz için teşekkür ederiz.

depletion-of-ribosomal-rna-for-mosquito-gut-metagenomic-rna-seq

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kaynak: Liu, X. ve diğerleri. Antibiyotikle aranmış sivrisineklerle bakteriyel ağız beslenme testi. J. Vis. Exp. (2020)Bu video, antibiyotik içeren bir sukroz çözeltisi kullanarak sivrisineklerde doğal bağırsak mikrobiyotasının tükenmesini göstermektedir. Bunu izlemek, sivrisinek bağırsağında tanımlanmış bir bakteri popülasyonu oluşturmak için membran besleme sistemi aracılığıyla bakteriyel askıma ile kontrollü yeniden kolonizasyon yapılır.

Yetişkin sivrisineklerde tanımlanmış bir bağırsak bakteri popülasyonu oluşturmak

RNA-Seq analizleri, model olmayan organizmalarda adaptif özelliklerin moleküler temellerini belirlemek için giderek daha önemli hale geliyor. Burada, diyapoz ve diyapoz olmayan Aedes albopictus sivrisinekleri arasında diferansiyel olarak ifade edilen genleri tanımlamak için bir protokol, sivrisinek yetiştiriciliğinden RNA dizilimine ve RNA-Seq verilerinin biyoinformatik analizlerine kadar açıklanmaktadır.

Asya Tiger Sivrisinek içinde Photoperiodic Diapause RNA-seq Analizler Deneysel ve Biyoinformatik Protokolü, Aedes albopictus

Örneğin, kistik fibroz hava yolunu kullanarak, el yazması bir hayvan ile ilişkili örneklerde mikrobik ve virüs toplulukları karakterize metagenomic ve metatranscriptomic yaklaşımların bir kombinasyonu içeren kapsamlı bir akışını göstermektedir.

Saf olmayan Arındırıcı: Sıralama Metagenomes ve Metatranscriptomes Kompleksi Hayvan ilişkili Örneklerinden

Gerçek zamanlı PCR aracılığıyla kıyı çökeltilerinden bakteriyel 16S rRNA genlerini ve transkriptlerini ölçmek için bir protokol sağlanır. Metodoloji, DNA ve RNA'nın birlikte ekstraksiyonunu içerir; DNA'sız RNA'nın hazırlanması; ve standart eğri yapısı dahil olmak üzere RT-q-PCR yoluyla 16S rRNA geni ve transkript miktar tayini.

Gerçek zamanlı PCR ile Kıyı tortulları ve Niceleme 16S rRNA Genler ve Transkriptler eşzamanlı DNA-RNA Ekstraksiyon

Translasyonel yönetmelik protein bereket kontrolünde önemli bir rol oynar. Burada, kantitatif analiz tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaeçeviri için bir yüksek-den geçerek yöntemi açıklanmaktadır.

Genom çapında Quantification ribozom profil oluşturma tarafından mayası çeviri

Burada bir nesil sıralama iletişim kuralı kimliği ve mikrobiyal topluluklar vektörel çizimler içinde karakterizasyonu sağlayan 16S rRNA sıralama için mevcut. Bu yöntem, DNA ekstraksiyon, amplifikasyon ve barkodlama filogenetik bilgi için sıra verileri eşleştirmek için bir akış-hücre ve Biyoinformatik üzerinde sıralama PCR aracılığıyla örnekleri içerir.

Kene Microbiome karakterizasyonu tarafından yeni nesil 16S rRNA Amplicon sıralama

Bu makalede, izole ve sivrisinek midgut kültlenebilir mikropların belirlenmesi, sivrisinek bağırsak bakterilerin antibiyotik tükenmesi de dahil olmak üzere bireysel sivrisinek bağırsak bakterilerin etkisini araştırmak için bir protokol sunuyor ve belirli bir bakteri türleri yeniden tanıtmak.

Antibiyotik Tedavi Sivrisinekler ile Bakteriyel Oral Beslenme Tsay

Bu protokol, hayvan ve insan deneklerin dışkı örneklerinden yüksek kaliteli toplam RNA'yı izole eder. Ticari bir miRNA izolasyon kiti, saf RNA'yı optimize edilmiş miktar ve kalitede izole etmek için önemli bir adaptasyonla kullanılır. RNA izolatları, dizileme, mikro dizi ve RT-PCR gibi çoğu aşağı akış RNA testi için iyidir.

Fekal (mikro) RNA İzolasyonu

Burada bakterilerde RIBO-seq için numune toplama ve hazırlama aşamalarını açıklıyoruz. Bu yönergelere göre hazırlanan kütüphanelerin sıraya dizilimi, kapsamlı biyoinformatik analiz için yeterli veri ile sonuçlanır. Sunduğumuz protokol basittir, standart laboratuvar ekipmanlarını kullanır ve lizizden kütüphanelerin eldeine kadar yedi gün sürer.

Bakterilerde RIBO-seq: NGS Dizilimi için Örnek Toplama ve Kütüphane Hazırlama Protokolü

Caenorhabditis elegans'ta rutin olarak kullanılan RNA girişimi (RNAi) için bir dağıtım yöntemi olan bakteriler tarafından üretilen dsRNA'nın oral yoldan uygulanması, burada yetişkin sivrisineklere başarıyla uygulanmıştır. Yöntemimiz, enjeksiyon kullanmadan sağlam ters genetik çalışmalarına ve iletimi engelleyen vektör çalışmalarına izin verir.

Yetişkin Anofeller gambiae Sivrisineklerine Etkili Oral RNA İnferferi (RNAi) Uygulaması

Sivrisineklerdeki mikrobiyal topluluklar, vektör biyokontrol stratejileri için büyük umut vaat ediyor. Simbiyontların çoğu yetiştirilemez ve metagenomik analizler gerektirir. Dişi sivrisinekleri incelemek ve yumurtalıkları, orta bağırsakları ve tükürük bezlerini ayırmak, çapraz kontaminasyonu önlemek, organ düzeyinde mikrobiyom çalışmalarını kolaylaştırmak ve mikroorganizmaların sivrisinek biyolojisindeki rollerinin anlaşılmasını geliştirmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Organ Düzeyinde Mikrobiyom Analizleri için Sivrisinek Yumurtalıkları, Midgut ve Tükürük Bezlerinin Diseksiyonu

Öğrenin, sivrisinek bağırsak örneklerinden ribozomal RNA'yı %90-99 oranında tüketerek mRNA'yı zenginleştirme yöntemini. Bu protokol, metatranskriptom analizi ve mikrobiyal ekoloji araştırmaları için RNA-seq veri kalitesini artırır.

Sivrisinek Gut Metagenomic RNA-seq Ribozomal RNA tükenmesi

Daha fazla video keşfet