İzolasyon ve Kültür Yenidoğan Fare kardiyomiyositlerin

Bu prosedürün genel amacı, sonraki tahlillerde kullanılmak üzere yenidoğan fare kardiyomiyositlerini izole etmek ve kültürlemektir. Bu, önce yenidoğan farelerin kalplerinin kesilmesi ve daha sonra kalp dokusunun manuel olarak küçük parçalara ayrılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, kalp hücreleri bir dizi enzimatik sindirim yoluyla ayrıştırılır. Daha sonra, izole edilen hücreler kardiyomiyositleri zenginleştirmek için kaplanır. Son olarak, kültürlenmiş kardiyomiyositler, plakaya yapışarak ve spontan atım davranışı göstererek gözlenebilir. Sonuç olarak, ökaryotik ekspresyon yapıları ile transfekte edilen kalp kası hücreleri içindeki proteinlerin hücre altı lokalizasyonu, immünofloresan mikroskopi ile gözlemlenebilir.

- Bu tekniğin diğer yöntemlere göre en büyük avantajı, yenidoğan fare kardiyomiyositlerinin izolasyonu ve kültüründeki sağlamlık ve tekrarlanabilirliktir.

- Bu yöntem, kardiyovasküler araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve küçük moleküllerin kardiyak sinyal yollarını nasıl etkileyebileceğini veya biyomekanik uyaranların protein lokalizasyonunu, transkripsiyonunu ve ekspresyonunu nasıl etkileyebileceğini ele almak gibi kalp kası hücrelerinin benzersiz moleküler hücre biyolojisi hakkında fikir verebilir.

- Elde edilen kardiyomiyosit hücrelerinin ve kültürünün çok yönlü doğası nedeniyle, bu teknik, deneyin ihtiyaçlarına göre uyarlanmış birçok aşağı akış uygulamasına ve denemesine olanak tanır.

- Kardiyak doku izolasyonuna başlamadan önce, buz üzerine yerleştirilmiş iki steril bakteri tabağının her birine 20 milimolar BDM ile taze takviye edilmiş 25 mililitre kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS dağıtın. Ardından, steril 50 mililitrelik konik bir tüpe 10 mililitre izolasyon ortamı ekleyin ve buzun üzerine yerleştirin. Şimdi, bir ila üç günlük yenidoğan farelerin cildini% 75 etanol ile hızlı bir şekilde sterilize edin. Kurban kesiminden sonra, göğüs kemiği boyunca her hayvanın göğüs boşluğunu açın ve her kalbi bir çift steril kavisli makasla çıkarın. Kalpleri hemen 20 milimolar BDM ile PBS içeren bakteri kaplarından birine aktarın. Daha sonra, kalplerdeki kanı nazikçe sıkmak için bir çift forseps kullanın ve ardından yıkanmış kalpleri ilk tabaktan ikinciye aktarın. Daha sonra kalpleri bir kez daha üçüncü bir bakteri kabında 250 mikrolitrelik bir izolasyon ortamına aktarın. Kalpleri 0,5 ila bir milimetre küp parçalarına ayırmak için bir çift kavisli makas kullanın ve ardından kıyılmış parçaları 10 mililitre izolasyon ortamı içeren konik bir tüpe aktarın. Kalp dokusunu gece boyunca dört santigrat derecede hafif bir çalkalama ile inkübe edin. Kalp dokusunu sindirmeden önce, hücre kültürü plakalarını en az bir saat boyunca kollajen çözeltisi ile kaplayın. Daha sonra kollajen solüsyonunu çıkarın ve bulaşıkları steril, laminer akışlı bir hücre kültürü davlumbazında kurutun. Bulaşıklar kururken, doku parçalarının toplandığını onaylayın. Ardından, parçaların tüpün dibine batmasına izin verin ve süpernatantın son bir mililitresi hariç hepsini çıkarın. Doku parçalarına beş mililitre taze hazırlanmış sindirim ortamı ve 20 milimolar BDM ile takviye edilmiş beş mililitre L-15 ortamı ekleyin ve ardından süspansiyonu bir dakika boyunca oksijenlendirin. Tüpü kapatın ve ardından dokuyu 37 santigrat derece su banyosuna aktarın. İki dakika sonra, kardiyak parçaları 20 ila 30 dakika boyunca 60 RPM'den fazla olmayacak şekilde ayarlanmış 37 derecelik bir çalkalayıcıda inkübe edin. Daha sonra steril bir hücre süzgecini steril 50 mililitrelik bir konik tüpe yerleştirin. Filtreyi 20 milimolar BDM ile desteklenmiş 5 mililitre L-15 ile önceden ıslatın ve ardından doku parçalarını yaklaşık 10 ila 20 kez nazikçe ezmek için önceden ıslatılmış 10 mililitrelik bir hücre kültürü pipeti kullanın. Daha büyük doku parçalarının çökelmesine izin verin ve ardından askıya alınmış hücreleri içeren süpernatanı tüpe süzün. Sindirilmemiş doku parçalarını beş mililitre sindirim ortamında yeniden süspanse edin ve daha sonra parçaları hafif çalkalama ile 37 santigrat derecede beş ila 10 dakika daha inkübe edin. Doku parçaları tamamen sindirildikten sonra, hücre bulamacını 10 ila 20 kez hafifçe ezin ve çözeltiyi filtreden geçirerek, ilk sindirimden hücreleri içeren konik tüpe süzün. Hücre süzgecini beş mililitre L-15 takviyeli ortamla, 20 milimolar BDM ile durulayın ve ardından askıya alınmış kardiyomiyositleri oda sıcaklığında 50 ila 100 kez G'de beş dakika boyunca döndürün. Süpernatanı çıkarın ve ardından peleti 10 mililitre kaplama ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri, herhangi bir fibroblast ve endotel hücresini çıkarmak için 10 santimetrelik bir hücre kültürü kabında, bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. Bir ila üç saat sonra, kaplama ortamını tabağın üzerine tekrar tekrar pipetleyerek yapışmayan kardiyomiyositleri yeniden süspanse edin ve ardından yeniden süspanse edilmiş hücreleri yeni bir konik tüpe aktarın. Hücreleri saydıktan sonra, bunları santimetre kare başına yaklaşık 1,5 çarpı 10 ila beş hücre yoğunluğuna sahip kollajen kaplı hücre kültürü kaplarına yerleştirin. Daha sonra, kardiyomiyositlerin yapışması ve yayılması için plakaları rahatsız edilmeden 12 ila 18 saat inkübe edin. Kaplamadan bir gün sonra, kardiyomiyositler hücre kültürü kabına yapışmalı ve kendiliğinden kasılmaya başlamalıdır. Yapışma ve büzülmeyi onayladıktan sonra, taze hazırlanmış bakım ortamını 37 santigrat derece su banyosunda önceden ısıtın, ardından kültürdeki ölü hücreleri çıkarmak için kaplama ortamını ısıtılmış bakım ortamıyla değiştirin. Son olarak, kardiyomiyositleri bir ila beş gün daha kültürleyin ve ortamı gerektiği gibi değiştirin. Bu ilk görüntü, ön kaplama adımının başlangıcında izole edilmiş neonatal fare kardiyomiyositlerini göstermektedir. Bir ila üç saat sonra, kardiyak fibroblastlar ve endotel hücreleri, kaplanmamış hücre kültürü kabına yapışmaya başlar. Yapışık olmayan kardiyomiyositlerin yeniden süspansiyonundan sonra, kalan kardiyak fibroblastlar ve endotel hücreleri istenirse daha fazla kültürlenebilir. Bu görüntüde, kollajen kaplı hücre kültürü kaplarında kaplanmış izole edilmiş ve saflaştırılmış neonatal fare kardiyomiyositleri gözlemlenebilir. Kültürde 18 saat sonra gösterildiği gibi, kardiyomiyositler kaplanmış bulaşıklara yapışır. Burada, kırmızı renkte miyomesine ve yeşil renkte beta-katenine karşı antikorlarla boyanmış yenidoğan fare kardiyomiyositlerinin temsili bir immünofloresan görüntüsü gösterilmektedir. Son olarak, bu immünofloresan görüntü, eksprese edilen GFP etiketli protein yeşil ve alfa aktinin kırmızı renkte transfekte edilmiş neonatal fare kardiyomiyositlerine aittir.

- Bu prosedürü takiben, kardiyomiyositlerin moleküler hücre biyolojisi ve biyomekanik özellikleri hakkında bilgi edinmek için kardiyomiyosit transfeksiyonu, küçük moleküllü inhibitörler veya aktivatörlerle tedavi veya immünofloresan biyomekanik analizler gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

- Bu izolasyon prosedürünün yenidoğan fare kardiyomiyositleri için uyarlanması, genetik olarak değiştirilmiş knock-in veya knock-out farelerle çalışan araştırmacıların, özellikle doğum sonrası kardiyak patolojiye sahip model sistemlerle çalışırken, bu hücrelerin davranışlarını kolayca kontrol edilen bir hücre kültürü ortamında keşfetmelerinin yolunu açtı.