Name: Polarize İnsan Havayolu bir sıvı kaplı Kültürünün Oluşturulması Solunum Patojenler için Host Hücre Yanıtı Okumak Epitel Calu-3 Hücreler In vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Öğrenin, Transwell sisteminde Calu-3 hücreleriyle polarize sıvı kaplı kültür oluşturmayı. TEER ölçümü ve sodyum fluoressein testiyle bariyer bütünlüğünü değerlendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar onu teknik yardım için Elisabeth Blanchard teşekkür etmek istiyorum. Bu rapordaki bulgular ve sonuçlar yazarlara aittir ve Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri görüşlerini temsil etmemektedir.

1. Transwell Kültürleri Kullanım için Kültürleme Calu-3 Hücreler Güvenlik Önlemleri: steril kültür tekniği kullanarak bir biyogüvenlik kabini tüm prosedürleri gerçekleştirin. <ol><li> Donmuş depolama hücreleri çözülme için: <ol><li> % 20 ısı ile inaktive edilmiş fetal bovin serumu (FBS), 0.1 mM temel olmayan amino asitler, 2 mM L-glutamin, and10 mM HEPES pH 7.4 (EMEM-% 20 + S) içeren Minimum Essential Eagle Medium hazırlayın. 37 ile steril filtre hazırlanmış bir 0.2 um gözenek boyutlu bir filtre kullanılmak üzere, orta, ve bir su banyosu içinde sıcak ° C. In situ havayolu epitel ortam içinde daha fazla yansıtıcı olmak için, antibiyotikler veya antimiyotikler orta ile desteklenmiş değildir. </li><li> Bir 37 ° C su banyosu içinde hızla Calu-3 hücreleri (&lt;1 dk), bir donmuş cryovial çözülme. </li><li> 50 ml&#39;lik steril konik tüpe çözülmüş hücreleri aktarın ve ısıtılmış EMEM +% 20-S, 30 ml eklemek </li><li> 1,000-1,200 az 5 dakika süreyle santrifüj yoluyla topak hücrelere x g,soğutma olmadan ve düşük fren hızı ile. </li><li> Nazikçe süpernatant süzün ve yavaşça aşağı yukarı ve pipetleme ile ısıtılmış EMEM +% 20-S, 5 ml içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Tohum 2 ila 5 × 10 37 6-iyi doku kültürü plaka ve inkübe içine kuyu başına 6 hücre ° C, hücreler% 75 kadar hava atmosferinde% 7 CO 2 - 80% konfluent. Günlük olarak kontrol edin; 7 güne kadar gerekli olabilir. Her 3-4 günde hücrelerin medyumuyla aspire ve taze EMEM-% 20 + S. ile değiştirin </li></ol></li><li> : Altkültür hücreleri için <ol><li> Sıcak% 0.05 tripsin - 37 ° C su banyosunda% 0.02 EDTA. Fazla orta ve serum çıkarmak için% 0.02 EDTA - hücrelerin medyumuyla aspire ısıtılmış ve% 0.05 tripsin ile bir kere yıkayın hücrelerini. Yıkama çıkarın ve hücreler tripsin ısıtıldı kuyu başına 1 ml ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;de inkübe edin ve bir mikroskop altında% 7 CO2 ve monitör hücrelerin en azından% 75 doku kültür plakasının da (lar) dan ayırmak kadar her 5 dak. Bu olabilir5 ila 30 dakika sürer. </li><li> Aşırı tripsin kaldırmak EMEM-% 20 + S hücreleri yıkayın. 50 ml&#39;lik steril konik tüpe hücreler tripsinize aktarın. Bir 6-kültür plakasının bir hücre Çoklu kuyular ve bir steril 50 ml konik bir tüp içine toplanmış olabilir. Soğutma olmaksızın 1,000-1,200 santrifüje edilerek EMEM-% 20 + S ve pelet hücreler 30 ml x g, ekleme, ve düşük fren hızı ile. </li><li> Yavaşça süpernatant Durusu ve hafifçe aşağı yukarı pipetleme ve taze olarak EMEM-% 20 + S hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. 80% birleşik - onlar 75 arasında olduğunda 1.2.7 adımlarda 1.2.5 açıklandığı gibi doku kültür kaplarına altkültür hücrelere devam hücreleri Trypsinize için yukarıda 1.2.3 adımları 1.2.1. </li><li> Yukarı 6-kuyulu plakanın iyi bir ikinci EMEM +% 20-S, 5 ml&#39;lik bir nihai hacim içinde bir T-25 cm2 şişeye Alt kültür, 0.5 ila 1 x 10 6 hücre / şişeye arasında tohumlama. </li><li> 5 ml kullanarak hücreleri, altkültür ayırmak için T-25 cm 2 balon başına tripsin ısındıbir T-25 cm2 şişeye yukarı bir ila EMEM +% 20-S, 10 ml&#39;lik bir nihai hacim içinde T-75 cm2 şişeye, tohum 5-1 arasında x 10 6 hücre / flask. </li><li> 8 ml Kullanımı 2 T-75 cm 2 şişeler içine bir T-75 cm 2 balon hücreleri, altkültür ayırmak için T-75 cm 2 balon başına tripsin ısındı. 3 yeni şişeler: Optimum hücre büyümesi için, alt kültür hücreleri 1 ebeveyn şişeyi daha büyük bir oranda T-75 cm 2 veya altkültür daha büyük ölçülü balona yok. </li></ol></li><li> Sonra hücreler ekilerek oylandı, tamamen kaldırmak ve% 75-90 izdiham ulaşıncaya kadar her 2 ila 3 gün orta değiştirin. Hücreler% 75-90 izdiham ulaşmak için 3 hafta kadar sürebilir. Polarize kültürler, alt kültür hücreleri bir tek tabaka olarak% 90 izdiham ötesinde büyümeye öncesi optimal kuşak için. </li><li> Hücreleri yeterince tohum Transwell ekler istenilen sayıda büyüdü kadar altkültür hücreleri devam edin. Her Transwell insert 2 × 10 5 hücre gerektirir. Optimum performans polarize kültürler üretebilmek için, en fazla 10 altkültürler uğramıştır hücreleri kullanır. </li></ol> 2. Büyüyen Polarize Calu-3 Sıvı kaplı Kültürleri (LCC) Güvenlik Önlemleri: steril kültür tekniği kullanarak bir biyogüvenlik kabini tüm prosedürleri gerçekleştirin. <ol><li> 37 EMEM bir su banyosu içinde% 10 FBS (EMEM-% 10) ihtiva eden ve sıcak hazırlanması ° C. </li><li> Tohumlama için 24-kuyu Transwell plaka hazırlayın. Steril forseps kullanarak, insert membran dokunmadan iç kısmından plakasının dış satırlara Transwell ekler taşıyın. Hücreler sadece plakanın dış satırlar üzerinde kuyu içine ekilerek olmalıdır. Bazolateral bölme içine hava kabarcıklarının girişini önlemek için, her bir bölme duvarına karşı pipet olta ve yavaş yavaş kuyuya orta serbest bırakarak, her biri için EMEM-% 10, 600 ul ilave edin. </li><li> T-75 cm 2 doku hücreleri ayırın. SubcuLTURE şişeler ısıtıldı tripsin kullanılarak, ve-EMEM +% 20, adım 1.2 &#39;de tanımlanan tripsinize hücreleri, her 2 şişeler başına S, 30 ml ile yıkanır. </li><li> İyice hafifçe aşağı yukarı ve pipetleme ile EMEM-% 10, 5 mL içinde yıkanmış hücrelerin tekrar süspansiyon. </li><li> Tripan mavi dışlama yöntemi ile uygulanabilir ve total hücre sayısı belirleyin. Yalnızca% 80 devam - 90% yaşayabilir. </li><li> 50 ml&#39;lik steril bir konik boru, 2&#39;lik bir konsantrasyonda x EMEM-% 10 ile 10 6 canlı hücre / ml &#39;ye sulandırın hücre. </li><li> Her Transwell ve apikal bölmeye hücreleri ekleyin. , Boşlukları, hücreleri olmadan EMEM-10% 100 ul ekleyin hücre içermeyen kontrol kuyuları, olacak kuyu A1 ve D1, için. Kalan kuyularının her biri için hafifçe uç duvarın iç kılavuz kanal karşı pipet olta ve yavaş yavaş salan hücreler, yeniden süspanse Calu-3 hücreler 100 ul ilave edin. Insert membrana pipet dokunmayın. Calu-3 hücrelerinin, homojen bir süspansiyon sağlamak için hafifçe ajite hücre süspansiyonuBu tohum çekilebilir. </li><li> 37 ° C ve% 7 hava atmosferde CO 2 de inkübe Transwell plakası. Fiziksel rahatsızlık minimal olacaktır küvözde plakayı. Polarizasyon verimliliğini artırmak için, birbirlerinin üstüne tabak yığmayın. </li><li> Polarize ve tamamen, deneylerinde kullanıma hazır olarak aşağıda 2.13 adımlarda 2.10 açıklandığı Transwells orta yerine kadar kültürleri korumak. Hücreleri tamamen polarize kadar Orta tamamen, önceki beslendikten sonra dördüncü ve sonra üçüncü gün arasında değişen bir döngü daha sonra üç gün Transwells içine ekilerek sonra değiştirilir, ve olmalıdır. </li><li> Sıcak EMEM-10 37 ile bir su banyosu içinde% ° C. </li><li> Yavaşça Transwell ekler orta aspire. Bir hafif vakumlu bir vakum tuzak bağlı bir kılcal pipet ile, ya da bir standart 1 ml birinci her kuyudan apikal orta kaldırma sonra pipet, hücre içermeyen kuyu A1 ve D1 aspirat orta taneli kuyulardan, ve ttavuk bütün kuyulardan bazolateral orta çıkarmadan. Orta aspire ederken insert membranlar dokunmayın. </li><li> Pipet ucu kılavuz ucun yan kullanarak apikal bölmeye yönlendiren ortamı, daha sonra tohumlu kuyulara, hücre içermeyen kuyu A1 ve D1 apikal bölmeye EMEM-10% 200 ul ekle. Doğrudan hücreleri üzerine orta katmayın ve ekleme membran dokunmayın. </li><li> Bazolateral bölmelere EMEM-% 10, 600 ul ekle. Bazolateral bölmeleri içine hava kabarcıkları girmesini önlemek için, her bölmenin duvara karşı pipet olta ve yavaş yavaş kuyunun içine orta bırakarak her biri orta ekleyin. </li></ol> 3. Calu-3 LCC Direnç Gelişimi Değerlendirilmesi Güvenlik Önlemleri: steril kültür tekniği kullanarak bir biyogüvenlik kabini tüm prosedürleri gerçekleştirin. <ol><li> Trans-epitelyal elektrik Calu-3 direnci (Teer) sonra LCC 30 dk Değerlendirinorta değişiklikler; eğer istenirse değerlendirme her bir ortam değişikliği yapılabilir. Steril koşullar altında ölçüm yapın. Bazal ölçümler elde etmek için hücre içermeyen kontrol kuyuları A1 ve D1 (boşluklar) ile ölçümler başlayın ve her iyi için ölçümler ile devam edin. <ol><li> Steril koşullar altında, steril su içinde% 70 etanol ihtiva eden 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne STX2 elektrot aktarmak ve 15 dakika sterilize edin. </li><li> Kalibre ve üreticinin talimatlarına göre kullanıma voltohmmeter sınayın. </li><li> Etanol, hava kurusu 5-10 sn elektrot çıkarın ve steril EMEM-% 10 ile elektrot durulayın. </li><li> DİRENÇ ayara voltohmmeter şekli anahtarını ayarlayın ve gücü AÇIK konuma getirin. </li><li> Bezin bir Transwell kültür bazolateral bölmesine erişim sağlayan 3 girişlerinden birine elektrot yerleştirin. Sıra elektrot yüzden artık kurşun yavaþca, dış kuyunun dibine dokunur ve dikey kalmasınıve kısa kurşun uç zar dokunmadan, apikal bölmesinin doku kültür ortamı içinde. </li><li> &quot;Tedbir R&quot; düğmesine basın ve stabilize etmek için okuma için bekleyin. Her kuyucuk için diğer 2 bağlantı noktaları için tekrarlayın ve her üç limanlarından, kuyu başına üç ölçümün toplam ölçümleri kaydetmek. Hücrelerin bütün kuyuları için direncini ölçmek için devam edin. </li><li> ,% 70 etanol içinde 5-10 dk iliklerine steril dH 2 O, durulama ve iyice kurutulması ile elektrot temizleyin. Orijinal ambalajında ​​saklayın. </li><li> Eşitlik 1 kullanılarak, her bir kuyunun dayanıklılığını hesaplayın. Ω fiili = Ω örnek - Ω boş, Denklem 1 Ω numune seribaşı iyi ve Ω boş gelen ortalama ölçüm nerede ekler ve orta içeren 2 kuyu, A1 ve D1 ortalama ölçüm, ancak hiçbir hücredir. </li><li> Denklemleri kullanılarak, birim alan direnç hesaplamation 2. Ω gerçek × efektif membran alanı = Ω × cm 2, Denklem 2 efektif membran alanı 24-kuyu Transwell uçlar için 0.33 cm 2 olduğu. </li></ol></li><li> Bu kutuplaşma esasına 02:59 Transwell kültürleri, apikal ve bazolateral bölmeleri arasında pasif sodyum fluorescein difüzyon ölçümü, ikinci bir tahlil yaparak tamamlandıktan doğrulayın. Sodyum fluoresein testi için kullanılan kuyu hemen tahlil tamamlanmasından sonra atılmalıdır. <ol><li> 4.75 mM KCl;; 2.53 mM CaCl 2 .2 H 2 O; 2.44 mM MgSO4; 1.19 mM KH 2 PO 4, 25 mM steril su içinde NaHCO 3; 0.45 mikron filtrasyon cihazı ile steril filtre (118 mM NaCl floresan olmayan tampon hazırlayın ). 4 ışıktan korunmalıdır ° C&#39;de floresan olmayan tampon, steril filtre, alüminyum folyo ile sarın, ve mağaza içinde 1 mg / ml sodyum fluorescein hazırlayın. Oda sıcaklıkları için SıcakKullanmadan önce yeniden. </li><li> Direnç ölçümleri tamamladıktan sonra, dikkatlice 02:59 bireysel Transwell kültürlerin bazolateral ve apikal bölümlerinde hem orta kaldırmak. </li><li> Transwell kültürleri durulayın. Yavaşça apikal bölmelere bazolateral bölmeleri ve 100 ul oda sıcaklığında steril D-PBS 600 ul oda sıcaklığında steril Dulbecco PBS (D-PBS) ekleyin. </li><li> Yavaşça kuyulardan D-PBS çıkarın. Bazolateral bölmelere 600 ul steril floresan olmayan tampon ekleyin. Apikal bölmelere 100 ul steril 1 mg / ml sodyum fluoresein ekleyin. </li><li> 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe plaka. CO2 kuluçka sırasında bu gerekli değildir. </li><li> İnkübasyon sırasında, sodyum floresein sulandırmak için floresan olmayan tampon kullanılarak, 20 ug / ml ve 0 ug / ml arasında değişen bir sodyum fluoresein standart bir eğri hazırlanır. En az 600 ul nihai hacim içinde sodyum fluoresein, en az 8 farklı konsantrasyonda, her hazırlayın. TutmakStandart eğri dilüsyonları absorbans ölçmek için hazır olana kadar ışıktan korunmalıdır. </li><li> Her bir test Transwell arasında bazolateral bölme Analiz için bir temiz tüpe floresan olmayan tampon numune aktarın. Plaka pasif sodyum fluorescein difüzyon incelemek ve atmak için kullanılan test Transwells çıkarın. Inkübatör kalan Transwells ile plaka dönün. </li><li> 96 çukurlu bir düz tabanlı plaka içine üç kopya halinde her bir standart çözelti 100 ul koyun. </li><li> Floresan olmayan tampon içinde her bir bazolateral numunenin üç dilüsyonları (1:2, 1:20 ve 1:50) hazırlanması, ve içine, iki kopya halinde her bir sulandırılmamış numune seyreltme ve her biri 100 ul ekle bir 96-gözlü düz alt plaka. </li><li> 486 nm veya 490 nm dalga boyunda ELISA plaka okuyucu Tedbir numune absorbansı. </li><li> Floresein st için sodyum absorbans değerleri karşı örneklerin absorbans karşılaştırarak bazolateral bölme içinde sodyum fluoresein konsantrasyonunun belirlenmesiandard eğrisi. </li></ol></li></ol> 4. Solunum Virüs ile birlikte polarize Calu-3 LCC Infecting Güvenlik Önlemleri: Virüs kullanılan uygun bir biyogüvenlik düzeyde steril kültür tekniği kullanarak bir biyogüvenlik kabini tüm prosedürleri gerçekleştirin. <ol><li> İstediğiniz inokulum 100 ul olurdu böylece serumsuz EMEM virüs seyreltin. </li><li> Serumsuz EMEM hücreleri yıkayın. Yavaşça o bazolateral orta apikal orta kaldırarak, tüm kuyulardan orta aspire. Bir hafif vakumlu bir vakum tuzak bağlı bir kılcal pipet ile, ya da bir standart 1 ml pipet, hücre içermeyen kuyu A1 ve D1 aspirat orta, sonra ayrılmış kuyularda, her şeyden önce kuyusundan apikal orta kaldırma ve sonra kaldırma her kuyudan bazolateral ortamı. Orta aspire ederken insert membranlar dokunmayın. <ol><li> T sonra hücre içermeyen kuyuları A1 ve D1 apikal bölmeye serumsuz EMEM 100 ul ekleyin veO seribaşı kuyuları, pipet rehberlik etmek ucun tarafı kullanılarak apikal bölmeye orta yönetmenlik. Doğrudan hücreler üzerinde orta katmayın ve ekleme membran dokunmayın. </li><li> Bazolateral bölmelere serumsuz EMEM 600 ul ekleyin. Bölmesinin duvara karşı pipet olta ve yavaş yavaş kuyunun içine orta bırakarak her Transwell orta ekleyin. </li><li> Yavaşça kuyulardan serum orta aspire. </li></ol></li><li> Bulaşmamış veya mock-enfekte kuyuları ile başlayarak, Transwells ve apikal bölmeye uygun olan virüs dilüsyon ekleyin. Bulaşmamış kuyuları, mock-enfekte kuyuları için, uygun Transwells ve apikal bölmeye serumsuz EMEM 100 ul ekleyin uygun Transwells arasında apikal bölmeye serumsuz EMEM seyreltilir virüssüz hazırlık 100 ul ekleyin ve için virüs enfeksiyonu, serum serbest EMEM virüs sulandırmak ve uygun Transwells ve apikal bölmelere 100 ul ekleyin. </li><li>Her bazolateral bölmelere serumsuz EMEM 600 ul ekle. </li><li> 37 ° C&#39;de inkübe edin ve 2 saat boyunca% 7 CO2. </li><li> Sonra enfekte kuyulardan, ilk bulaşmamış ve mock-enfekte kuyulardan, kuyulardan orta aspire. Bazolateral süpernatantlar ardından ilk apikal süpernatantlar, çıkarın. </li><li> Apikal bölmeleri ve bazolateral bölümlerinde EMEM-% 10 ve 600 ul içinde EMEM-% 10 ile 200 ul ortam değiştirin. </li></ol>

<ol><li>Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+airway+epithelial+cells+%28calu-3%29%3A+a+model+of+human+respiratory+function%2C+structure%2C+and+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+care+research+and+practice%22%5BJournal%5D)">Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses.</a> Critical care research and practice. 2010, (2010).</li>
<li>Mukherjee, M., Pritchard, D. I., Bosquillon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+air-interfaced+Calu-3+cell+layers+for+investigation+of+inhaled+drug+interactions+with+organic+cation+transporters+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of air-interfaced Calu-3 cell layers for investigation of inhaled drug interactions with organic cation transporters in vitro.</a> International journal of pharmaceutics. 426, 7-14 (2012).</li>
<li>Baginski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigations+into+the+fate+of+inhaled+salmon+calcitonin+at+the+respiratory+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">Investigations into the fate of inhaled salmon calcitonin at the respiratory epithelial barrier.</a> Pharmaceutical research. 29, 332-341 (2012).</li>
<li>Vllasaliu, D., Alexander, C., Garnett, M., Eaton, M., Stolnik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc-mediated+transport+of+nanoparticles+across+airway+epithelial+cell+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+controlled+release+%3A+official+journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Fc-mediated transport of nanoparticles across airway epithelial cell layers.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. , (2011).</li>
<li>Vinhas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pollen+proteases+compromise+the+airway+epithelial+barrier+through+degradation+of+transmembrane+adhesion+proteins+and+lung+bioactive+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Pollen proteases compromise the airway epithelial barrier through degradation of transmembrane adhesion proteins and lung bioactive peptides.</a> Allergy. 66, 1088-1098 (2011).</li>
<li>Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+Pharmaceutical+Aerosol+Deposition+Device+on+Cell+Cultures+%28PADDOCC%29+to+evaluate+pulmonary+drug+absorption+for+metered+dose+dry+powder+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+pharmaceutics+and+biopharmaceutics+%3A+official+journal+of+Arbeitsgemeinschaft+fur+Pharmazeutische+Verfahrenstechnik+e%22%5BJournal%5D)">A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations.</a> European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e. 77, 132-138 (2011).</li>
<li>Huttunen, S., Toivanen, M., Arkko, S., Ruponen, M., Tikkanen-Kaukanen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+activity+of+wild+berry+juice+fractions+against+Streptococcus+pneumoniae+binding+to+human+bronchial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Phytotherapy+research%3A+PTR%22%5BJournal%5D)">Inhibition activity of wild berry juice fractions against Streptococcus pneumoniae binding to human bronchial cells.</a> Phytotherapy research: PTR. 25, 122-127 (2011).</li>
<li>Elm, C., Rohde, M., Vaerman, J. P., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+interaction+of+the+pneumococcal+surface+protein+SpsA+with+the+human+polymeric+immunoglobulin+receptor+%28hpIgR%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Indian+journal+of+medical+research%22%5BJournal%5D)">Characterization of the interaction of the pneumococcal surface protein SpsA with the human polymeric immunoglobulin receptor (hpIgR).</a> The Indian journal of medical research. 119, 61-65 (2004).</li>
<li>Sutherland, T. C., Quattroni, P., Exley, R. M., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+passage+of+Neisseria+meningitidis+across+a+polarized+respiratory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Transcellular passage of Neisseria meningitidis across a polarized respiratory epithelium.</a> Infection and immunity. 78, 3832-3847 (2010).</li>
<li>Grantham, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation+of+the+influenza+A+virus+M2+protein+is+not+required+for+virus+replication+in+vitro+but+contributes+to+virus+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation of the influenza A virus M2 protein is not required for virus replication in vitro but contributes to virus virulence.</a> Journal of. 83, 8655-8661 (2009).</li>
<li>Saedisomeolia, A., Wood, L. G., Garg, M. L., Gibson, P. G., Wark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lycopene+enrichment+of+cultured+airway+epithelial+cells+decreases+the+inflammation+induced+by+rhinovirus+infection+and+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+nutritional+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Lycopene enrichment of cultured airway epithelial cells decreases the inflammation induced by rhinovirus infection and lipopolysaccharide.</a> The Journal of nutritional biochemistry. 20, 577-585 (2009).</li>
<li>Yoshikawa, T., Hill, T., Li, K., Peters, C. J., Tseng, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+acute+respiratory+syndrome+%28SARS%29+coronavirus-induced+lung+epithelial+cytokines+exacerbate+SARS+pathogenesis+by+modulating+intrinsic+functions+of+monocyte-derived+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus-induced lung epithelial cytokines exacerbate SARS pathogenesis by modulating intrinsic functions of monocyte-derived macrophages and dendritic cells.</a> Journal of virology. 83, 3039-3048 (2009).</li>
<li>Yoshikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+innate+immune+responses+of+human+bronchial+epithelial+cells+to+severe+acute+respiratory+syndrome-associated+coronavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Dynamic innate immune responses of human bronchial epithelial cells to severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus infection.</a> PloS one. 5, e8729(2010).</li>
<li>Hsu, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+constitutive+type+I+interferon+response+in+bronchial+epithelial+cell+to+influenza+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Critical role of constitutive type I interferon response in bronchial epithelial cell to influenza infection.</a> PloS one. 7, e32947(2012).</li>
<li>Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Calu-3+cell+line+as+a+model+of+in+vitro+respiratory+syncytial+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virological+methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection.</a> Journal of virological methods. 174, 144-149 (2011).</li>
<li>Zhang, L., Peeples, M. E., Boucher, R. C., Collins, P. L., Pickles, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+infection+of+human+airway+epithelial+cells+is+polarized%2C+specific+to+ciliated+cells%2C+and+without+obvious+cytopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus infection of human airway epithelial cells is polarized, specific to ciliated cells, and without obvious cytopathology.</a> Journal of virology. 76, 5654-5666 (2002).</li>
<li>Geys, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+the+pulmonary+translocation+of+nanoparticles%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+letters%22%5BJournal%5D)">In vitro study of the pulmonary translocation of nanoparticles: a preliminary study.</a> Toxicology letters. 160, 218-226 (2006).</li>
<li>Geys, J., Nemery, B., Hoet, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+culture+conditions+to+develop+an+in+vitro+pulmonary+permeability+model%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+vitro+%3A+an+international+journal+published+in+association+with+BIBRA%22%5BJournal%5D)">Optimisation of culture conditions to develop an in vitro pulmonary permeability model.</a> Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 21, 1215-1219 (2007).</li>
<li>Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Calu-3+cells+at+the+air+interface+provides+a+representative+model+of+the+airway+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier.</a> Pharmaceutical research. 23, 1482-1490 (2006).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Transwell ekler Calu-3 LCC oluştururken, hücrelerin hiç kutuplaştırma olabilir, veya tam olarak polarize etmek değil, gibi bir Teer tarafından tanımlanan ≥ 1000 Ω x 2 cm ve apikal ve bazolateral bölmeleri arasındaki ≤% 1 sodyum fluoresein boyası dengeleme. Buna ek olarak, LCC içinde Calu-3 hücreleri tam kutuplaştırma olabilir, fakat Teer ölçümler arasında tutarsız olabilir. Calu-3 LCC Teer ölçümlerinde dalgalanmalar, günlük normal olmasına rağmen kültür, doğal olarak az 5 hafta veya sürece 12 hafta olabilecek, yaşla birlikte azalır kadar Teer kez tamamen polarize, dramatik değişim beklenmemektedir tohumlama sonrası. Polarize Calu-3 LCC yeteneği hücreler hazırlanmış ve Transwell sistem içinde kullanım öncesinde pasajlandı nasıl kısmen bağlıdır. Alt kültür sırasında bir tek tabaka olarak% 90 izdiham ötesinde büyüdü Hücreler, dondurulmuş stoktan fazla 10 kat ekilerek oylandı, ya da değil kidüzenli olarak taze besiyeri ile birlikte en tam kutuplaştırmaya az olasıdır, ve herhangi bir polarizasyon hızla düşecek. Polarizasyon Eksik veya toplam eksikliği de malzeme ve Calu-3 LCC için kullanılan Transwells gözenek boyutu varyasyon atfedilen olabilir, ve benzeri kompozisyon ve gözenek büyüklüğüne Transwells içinde sürü-için-çok varyasyon ayrıca polarizasyon etkileyebilir. Latacağız Calu-3 polarize gelen kültürü korumak, bazolateral bölmeye Transwell zarından büyümesine izin verebilirsiniz. Kutuplaşma olmayışı da bakteriyel büyüme nedeniyle olabilir, Calu-3 hücreleri arasındaki sıkı bağlantıları müteakip parçalanmasına yol bulutlu kültür ortamı ile gösterilir. Calu-3 LCC değişken Teer ölçümleri Calu-3 LCC hücre mono tabakaları, insert, ya da levha kendileri mekanik kesintileri neden olabilir. Orta değişiklikler ve Teer ölçümleri pipet uçları veya elektro olmadan yapılmalıdırde hücrelerin temas yol açar. Bu işlemleri gerçekleştirirken, bakım direnci tespit voltohmmeter yeteneği bozacak apikal ve bazolateral bölmeleri, içine hava kabarcıkları tanıtmak önlemek için alınmalıdır. Aslında kutuplaşmış bir kültürde direniş tespit voltohmmeter yeteneği de elektrot kablolarında protein birikmesi ile sınırlı olabilir. Bu birikme nazik zımpara ile kaldırılabilir veya elektrot değiştirerek düzeltilebilir. Bir kez Calu-3 LCC tamamen polarize ve Teer artık artmaktadır, Calu-3 LCC solunum yolu enfeksiyonuna konak akciğer epitel hücre yanıtlarını karakterize etmek için bir in vitro model olarak kullanılmak için hazır. Bu sistem Calu-3 LCC bei ek avantajlarıyla birlikte, geleneksel olarak bu tür A549 ve HEp-2 hücreleri gibi solunum patojenleri incelemek için kullanılan tek tabaka-kültürlü akciğer hücre hatları ile karşılaştırıldığında patojenlere yönlü tepkilerin iyi karekterinigeliştirmek için ng daha hızlı, daha kolay elde edilebilir ve primer, kutuplaşmış, farklılaştırılmış NHBE daha üretmek için daha az pahalı. NHBE benzer polarize Calu-3 sıkı kavşak oluşumu göstermek ve müsin üretirler. Ancak, NHBE aksine, polarize Calu-3 hücreleri bazal hücreler ve kirpikli kolumnar epitel hücrelerinin katmanlarına ayrım yoktur, ve birkaç polarize Calu-3 hücreleri kirpikler şeklinde çıkıntılar 19 gelişir. Solunum hakaret havayolu epitel hücrelerinin polarize tepkilerin test için yararlı rağmen Böylece, polarize Calu-3 LCC solunum hakaret veya yaralanmaya yanıt olarak hava yolu geliştirme veya yeniden incelemek için ideal bir model değil. In vitro olarak kültür hücreleri, mukus üretimini hücresel enfektivite yanı sıra, bir polarize modelinde bulaşıcı virüs yayılması ve virüs salınması ve polarize Calu-3 LCC ve polarize, farklılaşmış NHBE rapor edilmemiştir arasında mukus üretiminin doğrudan karşılaştırma etkileyebilir . A549 ve HEp-2 hücreleriCalu-3 hücreleri daha kültürüne kolay yeniden, ancak, Transwell ekler üzerinde büyüdüğü zaman Calu-3 LCC aksine, onlar polarize kültürleri kurmazlar, ve böylece ideal değil modelleri solunum virüs enfeksiyonu, in vitro polarize epitel hücrelerinin yanıtları inceleyerek içindir .

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAKTİFLER </td></tr><tr><td> Calu-3 </td><td> ATCC </td><td> HTB-55 </td><td></td></tr><tr><td> % 0.05 tripsin -% 0.02 EDTA </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> Eagle Minimum Essential Medium (EMEM) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 07-00100DK </td><td></td></tr><tr><td> Fetal bovin serumu (FBS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td> Isı inaktive, 56 ° C, 30 dakika </td></tr><tr><td> 100X olmayan esansiyel amino asitler (10 mM) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11140 </td><td> Karanlıkta 4 ° C&#39;de depolayın </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> EMEM-% 10 FBS (EMEM% 10) </td><td></td><td></td><td> Steril-filtre, serum% 10 ısı-inaktif FBS ile EMEM Ek </td></tr><tr><td> EMEM-% 20 FBS + takviyeleri (EMEM-% 20 + S) </td><td></td><td></td><td> ; 1X amino asitler, 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, steril-filtre ısı-inaktif FBS,% 20: son konsantrasyonları için EMEM Ek </td></tr><tr><td> 24-iyi Transwell plakaları </td><td> Corning Costar </td><td> 3472 </td><td> 3 mikron gözenek boyutu, polyester </td></tr><tr><td> Tripan mavisi </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15250 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Sigma </td><td> E7023 </td><td> Steril dH 2 O kullanarak% 70 hazırlayın </td></tr><tr><td> Dulbecco PBS (D-PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14040 </td><td></td></tr><tr><td> Sigara floresan tampon </td><td></td><td></td><td> 118 mM NaCl;4.75 mM KCl; 2.53 mM CaCl2 × H 2 O; 2.44 mM MgSO4; 1.19 mM KH 2 PO 4, steril su içinde 25 mM NaHCO 3; steril filtre </td></tr><tr><td> Sodyum floresein </td><td> Sigma </td><td> 6377 </td><td> Steril olmayan floresan tamponu içinde 1 mg / ml steril filtre, ışıktan korumak; 4 mağaza ° C 6 aya kadar </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EKİPMAN </td></tr><tr><td> Voltohmmeter </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td></td><td></td></tr><tr><td> STX2 elektrot </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ELISA plaka okuyucu </td><td></td><td></td><td> A 486 veya A 490 ölçebilen </td></tr></tbody></table>

polarize İnsan havayolu bir sıvı kaplı kültürünün oluşturulması solunum patojenler için host hücre yanıtı okumak epitel calu-3 hücreler<em&gt; in vitro</em

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Havayolu epitel hücrelerinin apikal ve bazolateral yüzeyler in vivo patojen maruziyeti yönlü tepkiler göstermektedir. Böylece, apikal ve bazolateral yüzeyler oluşturarak, Polarize solunum patojenlere hücresel cevaplarının incelenmesi için in vitro modeller idealdir. Böyle bir modelin normal insan bronşiyal epitel hücreleri (NHBE) farklılaşıyor. Ancak, bu sistem izole akciğer doku örnekleri, uzmanlık ve doku kültürü epitel hücreleri, ve bir hava-sıvı arayüzü kültürü oluşturmak için zaman gerektirir. Bir insan bronşiyal adenokarsinom türetilen Calu-3 hücreleri, solunum hakaret 1, farmakolojik bileşikler 2-6 proksimal hava yolu epitel hücrelerinin tepkisi inceleyerek ve bakteriyel 7-9 ve viral patojenler, grip virüsü, rinovirüs dahil olmak için alternatif bir model olarak ve şiddetli akut solunum sendromu - ilişkili koronavirüs 10-14. Son zamanlarda, wE Calu-3 hücreleri NHBE 15,16 ile tutarlı bir şekilde solunum sinsityal virüs (RSV) enfeksiyona duyarlı olduğu gösterilmiştir. Burada, ayrıntılı büyüyen ve kültür Calu-3 hücreleri LCC içine kültüre oylandı hücreleri korumak teknik detayları üzerinde duruluyor Calu-3 hücre polarize, sıvı kaplı kültürü (LCC), kurulması ve biz sunuyoruz polarize Calu-3 hücrelerinin solunum virüsü enfeksiyonu gerçekleştirmek için yöntem. Sürekli polarize Calu-3 LCC, Calu-3 hücreleri dikkatli Transwell ekler kültürleme önce pasajlandı yapmalısınız edinin. Hazır Calu-3 tek tabaka kültürleri,% 90 izdiham altında kalmalı dondurulmuş stok az 10 kez pasajlandı edilmeli ve düzenli olarak taze ortam ile sağlanmalıdır. Bir kez Transwells kültüre, Calu-3 LCC dikkatle ele alınması gerekir. Düzensiz ortam değişiklikleri ve hücre katmanları veya levhaların mekanik veya fiziksel bozulma olumsuz için polarizasyon etkisibirkaç saat veya gün. Polarizasyon trans-epitelyal elektriksel direnç (Teer) değerlendirilerek izlenir ve apikal ve bazolateral bölmeleri 17,18 arasında sodyum fluoresein pasif dengeleme değerlendirerek doğrulanır. Ω × cm 2 veya 1,000 Yukarıdaki kez Teer yaylaları, Calu-3 LCC solunum patojenlere hücresel yanıtları incelemek için kullanıma hazırdır.

Şekil 1, farklı apikal ve bazolateral yüzeylerinin geliştirilmesi polarize Calu-3 hücreleri, gösterildiği gibi, Transwell kültür sistemleri içinde sıvı kaplı kültürler (LCC) olarak büyümüş zaman. Yöntem sonra burada açıklandığı gibi, Calu-3 LCC, trans-epitelyal elektrik rezistansı (Teer) tohumlama sonraki 3 hafta içinde Ω x cm 2 ya da 1.000 &#39;üzerinde bir plato, Şekil 2&#39; de gösterildiği üzere bir örnek ulaşır. Polarize hücreleri arasında oluşan sıkı kavşaklar apikal ve bazolateral bölmeler arasındaki küçük moleküllerin pasif dengeleme engeller. Bu nedenle, bir değiştirilmiş sodyum fluoresein dengeleme tahlil Calu-3 LCC 15,17,18 polarizasyon doğrulamak için kullanılır. LCC artar Calu-3 hücre mono tabakaları Teer olarak, pasif bazolateral bölmesine equilibrates floresan miktarı azalır. Teer 1.000 Ω cm x 2, equilibrates floresan miktarı kezbazolateral bölmesine olarak Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi ≤% 1, bu nedenle, Calu-3 LCC Teer ≥ 1000 Ω cm x 2 iken tam olarak polarize edilmiş olarak kabul edilir. Calu-3 LCC pik Teer ölçüm deneyden deneye değişebilir. Ancak, herhangi bir deney için bir kere Teer değerleri plato, tam polarize, enfekte olmamış Calu-3 LCC 12 hafta sonrası tohumlama ile 5 arasındaki için kararlı olabilirler. Transwell kültürlü Calu-3 direnç gelişme olmaması Tablo 1&#39;de özetlendiği gibi çeşitli faktörler neden olabilir. Ω × cm 2 veya 1,000 Yukarıda Calu-3 LCC platolar Teer, modeli incelemek için kullanılmaya hazır olduğunu bir kez respiratuvar sinsityal virüs (RSV) dahil solunum patojenlere hava yolu epitel hücre yanıtlarının. Hücrelerin bir mock-enfeksiyonu (Şekil 4) ile karşılaştırıldığında polarize kültür bütünlüğü içinde daha hızlı bir düşüş RSV sonuçları Poz. Şekil 1. Transwell-kültür hücrelerinin kesiti temsil. Hücreleri ekleme membran apikal yüzeyinde yetiştirilmektedir. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2.jpg" /> Şekil 2. Trans-epitelyal elektriksel direnç (Teer) ve Transwell ekler tohumlama sonrası Calu-3 hücrelerinin polarizasyon Gelişimi. Her zaman noktasında, Teer ortanca Ω x cm 2 olarak sunulan bir temsilci deneyden 32 bağımsız kuyuların ± SEM. <img alt="Şekil 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3.jpg" /> Şekil 3,. Pasif equili<html> hücreleri gibi polarize olur Calu-3 hücre mono tabakaları bazolateral bölmesine sodyum fluoresein ration inhibe edilir. dört bağımsız deneyin kümülatif veri sunulmuştur. Her veri noktası tek bir ölçüm temsil eder. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4.jpg" /> Şekil 4. Polarize Calu-3 LCC RSV enfeksiyonu tek tabaka bütünlüğü bir düşüş hızlanır. Polarize Calu-3 hücreleri 0. gün bir İçişleri Bakanlığı = 1 RSV-A2 ile enfekte edildi ve polarite 8 hafta sonrası enfeksiyon yönünden takip edildi. Bir temsilci deneme gösterilir. Veri infeksiyon başına 8 bağımsız kuyuları ± SEM zaman noktası başına medyan direnç olarak sunulmaktadır. * P olarak Student t-testi ile tespit mock-ve RSV-A2-enfekte kültürler arasındaki &lt;0.05. yolları &quot;&gt; <tbody><tr><td> Konu </td><td> Çözünürlük (ler) </td></tr><tr><td> Direnç ölçülebilir değildir </td><td><ul><li> Kuyularda herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarın </li><li> Dondurulmuş stok daha az 10 kez pasajlandı oylandı Calu-3 hücreleri kullan </li><li> Calu-3 hücre monolayer altkültür% 100 izdiham ulaşmasına izin vermeyin </li><li> Hücreler (ucun gözenekler aracılığıyla büyümüş olabileceğini belirten) sıra insert altında plastik üzerinde büyüyen olmadığını kontrol edin </li><li> Tam direnç gelişimi için 2-3 hafta sonrası tohumlama izin ver </li><li> Değiştirmek, kullanılan ekler kompozisyon ve gözenek boyutu kontrol edin, gerekiyorsa (önerilen polyester insert, 0,3 mikron gözenek boyutu, hayır kaplamalar, ayrıntılar için malzemeler bakınız) </li><li> Ucundan biriken proteinler kaldırmak için hafifçe zımpara ve gerekirse değiştirilmesi, elektrodun kalitesini kontrol edin </li><li> Bakteriyel büyüme için orta kontrol </li></ul&gt; </td></tr><tr><td> Direnç geliştirir, ama tam polarizasyon (≥ 1.000 Ω × cm 2) elde edilememesi </td><td><ul><li> Geliştirmek için polarizasyon (bazen 4 hafta kadar sürebilir) için ek süre tanıyınız </li><li> Dondurulmuş stok daha az 10 kez pasajlandı oylandı Calu-3 hücreleri kullan </li><li> Calu-3 hücre monolayer altkültür% 100 izdiham ulaşmasına izin vermeyin </li><li> Sürekli önceki beslendikten sonra ardından üçüncü ve dördüncü gün arasında değişen, Transwell kültürlerde orta yerine </li><li> Plakaların dış sıra halinde yerleştirilen uçları üzerinde sadece kültür hücreleri </li><li> Transwell ekler farklı bir sürü kullanın </li></ul></td></tr><tr><td> Hücreler tamamen polarize, ancak direnç bir okuma diğerine tutarlı değil </td><td><ul><li> Bozabilir veya inkübatör plakaları yığmayın </li><li> Biyogüvenlik kabininde titreşime sebep yok iken Transwell plates ele alındığını </li><li> Kuyularda herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarın </li><li> Ortam değiştirme veya Teer okumaları yapan pipet uçları ile hücre tabakası rahatsız etmeyin </li><li> Apikal bölmeye 200 ul ortamı kullanın; düşük ses dengesiz Teer okumalara neden olabilir </li><li> , Elektrodun kalitesini kontrol ucundan biriken proteinler kaldırmak için hafifçe zımpara ve gerekirse değiştirin </li></ul></td></tr></tbody></table> Transwells içinde zaman kültür Calu-3 hücreleri oluşabilir Tablo 1. Sorun giderme sorunları. Çoklu faktörler sıvı kaplı kültürleri, bu tabloda ortaya koyan en muhtemel olarak Calu-3 hücreleri dolu kutuplaşmaya katkıda bulunur.

Bu rapordaki bulgular ve sonuçlar yazarlara aittir ve Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri görüşlerini temsil etmemektedir.

Polarize İnsan Havayolu bir sıvı kaplı Kültürünün Oluşturulması Solunum Patojenler için Host Hücre Yanıtı Okumak Epitel Calu-3 Hücreler<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Bu prosedürün genel amacı, Transwell kültür sistemini kurmak için bir Transwell kültür sistemi kullanarak Calu üç hücreli polarize sıvı kaplı bir kültür oluşturmaktır. İlk olarak, ekleri plakanın dış sıralarına hareket ettirerek ve her bir oyuğun bazolateral odalarına ortam ekleyerek bir transwell plakası hazırlayın. İkinci adım, tek katmanlı kültür hücrelerini tek hücreli süspansiyonlara hazırlamaktır.Daha sonra, askıya alınan hücreler, transwell eklerinin apikal bölmelerine oturtulur. Son adım, apikal ve bazal lateral medyayı tamamen değiştirmektir. Kültürde, hücreler tamamen polarize olana kadar iki ila üç hafta boyunca üç ve ardından dört günlük bir döngüye eklenir.Sonuç olarak, sıvı kaplı calu üç kültürün polarizasyonunu göstermek için trans epitelyal elektrik direnci ve pasif bir sodyum floresein dengeleme testi kullanılır. Bu tekniği kullanmanın normal insan bronşiyal epitel hücrelerini kullanmaya göre temel avantajı, Calor üç'ün daha erişilebilir olması ve daha hızlı polarize kültürlere dönüşmesidir Kullanıma hazır Polarize calu yetiştirmek için tüm prosedürler. Steril kültür teknikleri kullanılarak bir biyogüvenlik kabininde üç sıvı kaplı kültür veya LCC gerçekleştirilir.24 kuyulu bir trans kuyu plakası hazırlayarak başlayın. Steril forseps kullanarak tohumlama için, transwell uçlarını ek parçaya dokunmadan plakanın iç kısmından dış sıralarına doğru hareket ettirin. Membran hücreleri sadece plakanın dış sıralarındaki kuyucuklara alt kültür olmalıdır.%10 FBS içeren 600 mikrolitrelik EMEM, bundan sonra EMEM olarak anılacaktır, her bir bazolateral bölmeye% 10. Hava kabarcıklarının girmesini önlemek için, pipeti her bölmenin duvarına doğru eğin ve ortamı yavaşça kuyuya bırakın. Daha sonra, protokol metninde tarif edildiği gibi doku kültürü şişelerinden ve alt kültür hücrelerinden Colu üç hücresini ayırın, yıkanmış hücreleri beş mililitre EMEM %10'da hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice yeniden süspanse edin, trian mavisi dışlama yöntemiyle canlı ve toplam hücre sayılarını belirleyin ve yalnızca %80 ila %90'ı uygulanabilirse devam edin.Daha sonra 50 mililitrelik steril bir konik tüpte, hücreleri mililitre başına iki kez 10 ila altı canlı hücre konsantrasyonuna seyreltin. EMEM ile% 10 ile, A ve D kuyuları hariç, her bir transwell'in apikal bölmesine 100 mikrolitre yeniden süspanse edilmiş calu üç hücre ekleyin. Pipeti kesici uç duvarının iç kılavuz kanalına doğru nazikçe eğin ve hücreleri yavaşça serbest bırakın.Pipeti insert membranına dokundurmayın. Bu oturma adımı sırasında CALU üç hücreli süspansiyonu nazikçe çalkalayın ve hücrelerin A ve D kuyularına homojen bir süspansiyonunu koruyun, bu da hücresiz 100 mikrolitre EMEM'de hücresiz kontrol kuyuları veya boşluklar olacaktır% 10 hücresizdir. Trans kuyu plakasını, polarizasyonun verimliliğini artırmak için fiziksel rahatsızlığın minimum olacağı bir inkübatörde hava atmosferinde 37 santigrat derece ve% 7 karbondioksitte inkübe edin.Alt kültürden üç gün sonra plakaları üst üste istiflemeyin ve üç hücreyi transwell'lere dökmeyin, hafif bir vakumla bir vakum tuzağına bağlı bir kılcal pipet kullanarak ortamı transwell eklerinden tamamen nazikçe aspire edin. Önce apikal besiyerini tüm oyuklardan çıkarın ve ardından bazolateral besiyerini tüm oyuklardan çıkarın. Ortamı aspire ederken ek membranlara dokunmayın.200 mikrolitre EMEM ekleyin% 10 hücresiz kuyucuklar A ve D olanın apikal bölmesine. Daha sonra oturmuş kuyucuklara, pipet ucunu yönlendirmek için ek parçanın yan tarafını kullanarak ortamı apikal bölmeye yönlendirin. Ortamları doğrudan hücrelerin üzerine eklemeyin ve ekleme zarına dokunmayın.Daha sonra, bazal yan bölmelere hava kabarcıklarının girmesini önlemek için bazal yan bölmelere 600 mikrolitre EMEM %10 ekleyin. Pipeti her bölmenin duvarına doğru açılandırarak ve ortamı yavaşça kuyuya bırakarak her birine orta ekleyin. Bu ilk ortamdan sonra transwell plakasını inkübatöre geri koyun. Yedek.Ortam, hücreler tamamen polarize olana kadar önceki beslemeden sonraki dördüncü ve üçüncü gün arasında değişen bir döngüde değiştirilmelidir. Polarizasyon, kalibre edilmiş ve test edilmiş bir volter kullanılarak CALU üç LCC'nin trans epitelyal elektrik direnci veya yırtılması değerlendirilerek izlenir. Bu işleme başlamak için, elektrodu etanolden çıkarın, beş ila 10 saniye kurutun ve elektrodu steril EMEM ile durulayın %10 Lamperin mod anahtarını direnç ayarına getirin ve gücü açın.Temel ölçümleri elde etmek için ölçümlere hücresiz kontrol kuyularıyla başlayın ve ardından her biri için ölçümlere devam edin. Elektrodu, transwell kültürünün bazolateral bölmesine erişime izin veren üç porttan birine nazikçe yerleştirin. Elektrodu, daha uzun uç dış kuyunun dibine hafifçe değecek ve dikey kalacak şekilde yerleştirin.Ve daha kısa uç, ekleme zarına dokunmadan apikal bölmenin doku kültürü ortamındadır, ölçü R düğmesine basın ve okumanın stabilize olmasını bekleyin. Her kuyucuk için diğer iki bağlantı noktası için tekrarlayın ve polarizasyonun tamamlandığını doğrulamak için kuyu başına toplam üç ölçüm için üç bağlantı noktasından gelen ölçümleri kaydedin. Apikal ve bazolateral bölmeler arasındaki pasif sodyum floresein difüzyonunu ölçen ikincil bir test, bir ila üç transwell kültürü üzerinde gerçekleştirilir.Test edilecek olan transwell kültürlerinin hem bazal lateral hem de apikal bölmelerinden ortamı dikkatlice çıkarın. Bazolateral bölmelere 600 mikrolitre oda sıcaklığı, steril DPBS ve apikal bölmelere 100 mikrolitre oda sıcaklığında steril DPBS ekleyerek transwell kültürlerini durulayın. DPBS'yi kuyulardan yavaşça çıkarın.Bazolateral bölmelere 600 mikrolitre steril floresan olmayan tampon ekleyin, ardından apikal bölmelere 100 mikrolitre steril sodyum floresein ekleyin. Plakayı bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir saat sonra.Floresan olmayan tampon numunesini, her bir test transwell'inin bazolateral bölmesinden ayrı bir temiz tüpe aktarın. Analiz için, pasif sodyum floresein difüzyonunu incelemek için kullanılan test transwell'lerini plakadan çıkarın ve atın. Kalan transwelllerle birlikte plakayı inkübatöre geri koyun.Önceden hazırlanmış her bir sodyum floresein standart çözeltisinden 100 mikrolitreyi üç nüsha halinde 96 kuyulu düz bir alt plakaya yerleştirin. Floresan olmayan tamponda her bir bazal yanal numunenin üç seyreltmesini hazırlayın. Her numune için, 100 mikrolitre seyreltilmemiş numune ve her seyreltmeden 100 mikrolitre iki kopya halinde 96 kuyulu düz bir alt plakaya ekleyin.Bir EISA plaka okuyucusunda numune absorbansını 486 nanometre veya 490 nanometrede ölçtü. Bu prosedüre başlamak için, önce hücreleri ve serum içermeyen EMEM'i bir vakum tuzağına bağlı bir kılcal pipet ile yıkayın, yumuşak bir vakumla tüm kuyucuklardan ortamı nazikçe aspire edin, apikal ortamı ve ardından bazolateral ortamı çıkarın, hücresiz kuyulardan aspire edin A bir ve D bir ve daha sonra tohumlanmış kuyulardan. Ortamı aspire ederken ek membranlara dokunmayın.100 mikrolitre serum içermeyen EMEM, hücresiz kuyucuklar A ve D olanın apikal bölmesine ve daha sonra ortamı apikal bölmeye yönlendiren oturmuş kuyucuklara ekleyin. Pipet ucunu yönlendirmek için ek parçanın yan tarafını kullanın. Doğrudan hücrelerin üzerine ortam eklemeyin ve ekleme zarına dokunmayın.Daha sonra 600 mikrolitre serumsuz EMEM'i bazolateral bölmelere ekleyin. Pipeti bölmenin duvarına doğru açılandırarak ve ortamı yavaşça kuyuya bırakarak her bir trans kuyucuğuna orta ekleyin: Serum içermeyen ortamı kuyulardan nazikçe aspire edin. Enfekte olmamış veya sahte enfekte kuyucuklardan başlayarak, uygun trans kuyucuklarının apikal bölmesine aşağıdaki virüs seyreltmelerini ekleyin.Enfekte olmamış kuyular için 100 mikrolitre serumsuz EMEM. Sahte enfekte kuyular için serumsuz EMEM'de seyreltilmiş 100 mikrolitre virüssüz preparat ve virüs için serumsuz EMEM'de seyreltilmiş 100 mikrolitre virüs. Bundan sonra, tüm bazolateral bölmelere 600 mikrolitre serumsuz EM'de, iki saat boyunca 37 santigrat derece ve% 7 karbondioksitte inkübe edin.İki saat sonra, önce enfekte olmamış ve sahte enfekte kuyulardan ve daha sonra enfekte olmuş kuyulardan ortamı aspire edin. Önce apikal süpernatantları, ardından bazal lateral süpernatanları çıkarın. Son olarak, bu videoda gösterilen yöntemi izleyerek ortamı 200 mikrolitre EMEM, apikal bölmelerde% 10 ve bazolateral bölmelerde% 600 mikrolitre EMEM ile değiştirin.Trans epitelyal elektrik direnci veya calu üç sıvı kaplı kültürün yırtılması, tohumlamadan sonraki üç hafta içinde 1000 M'ye santimetre kare veya üzerinde bir platoya ulaşır. Bunun bir örneği bu şekilde gösterilmiştir, çünkü polarize hücreler arasında oluşan sıkı bağlantılar, apikal ve bazolateral bölmeler arasındaki küçük moleküllerin pasif dengesini önler. Calu üç sıvı kaplı kültürün polarizasyonunu doğrulamak için modifiye edilmiş bir sodyum floresan dengeleme testi kullanılır.Calu, üç hücreli tek tabakalar ve sıvı kültürlerin katmanı arttıkça, bazolateral bölmeye pasif olarak dengelenen floresein miktarı azalır, dört bağımsız deneyden elde edilen kümülatif veriler burada sunulmaktadır ve her veri noktası ayrı bir ölçümü temsil etmektedir. Yırtılma santimetre kareye ait 1000 olduğunda, BA bazolateral bölmesine dengelenen floresein miktarı %1'e eşit veya daha azdırBu nedenle, calu üç sıvı kaplı kültür, katman santimetre kareye sahip 1000'e eşit veya daha büyük olduğunda tamamen polarize olarak kabul edilir. Calu üç sıvı kaplı kültür katmanı, santimetre kareye sahip 1000 veya üzerinde platolara ulaştığında, model, gösterildiği gibi solunum sinsityal virüsü veya RSV dahil olmak üzere solunum yolu epitel hücresi tepkilerini incelemek için kullanılmaya hazırdır.Bu örnekte, kırmızı ile gösterilen RSV'ye maruz kalma, polarize kültürde daha hızlı bir düşüşe neden olur. Mavi verilerde temsil edilen hücrelerin sahte bir enfeksiyonu ile karşılaştırıldığında bütünlük, enfeksiyon başına sekiz bağımsız kuyucuğun medyan direnci, zaman noktası başına artı veya eksi SEM olarak sunulur. Yıldız işareti, öğrencinin T-testi testi ile belirlenen sahte ve RSVA iki enfekte kültür arasında 0.05'ten az P'yi gösterir.Bulaşıcı ajanlarla çalışırken tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürleri gerçekleştirirken uygun KKD giymeniz ve iyi laboratuvar uygulamalarını kullanmanız gerektiğini unutmayın.

establishing-liquid-covered-culture-polarized-human-airway-epithelial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Insan gönüllülerin yüzeysel sıyrık biyopsi yoluyla elde edilen nazal epitel hücreleri, doku kültürü ekler üzerine genişletilmiş ve aktarılır. Ortak akışkanlığa eriştikten sonra hücreler, kirpikli olmayan silli hücre kültürleri, sonuçta hava sıvı arayüzü yetiştirilir. Farklılaşmış nazal epitel hücre kültürleri solunum mukozasını eğitim için uygun deneysel modeller sunar.

Hava Sıvı Arayüz İnsan Burun Epitel Hücrelerinin ekimi

Biz cfbe41o kullanarak enfekte hava yollarının üç boyutlu ortak kültür modeli için bir protokol tarif- hücreler, THP-1 makrofajlar, ve Pseudomonas aeruginosa, hava-sıvı arayüzü nde kurulan. Bu model aynı anda antibiyotik etkinliğini test etmek için yeni bir platform sağlar, epitel bariyer fonksiyonu, ve inflamatuar belirteçleri.

P. aeruginosa Anti-Enfektiflerin Klinik Öncesi Değerlendirilmesi Için Hava-Sıvı Arabiriminde Bronşiyal Epitel Hücrelerin in enfekte 3D Eş Kültür

Tanımlanan, toksisite testi için parçacıklara gerçekçi, tekrarlanan inhalasyon maruziyeti için bir in vitro bronş modelinin hücre kültürü ve maruz kalma yöntemidir.

Toksisite Testi için Havadaki Parçacıklara Gerçekçi, Tekrarlanan Soluma Maruziyeti için Hava Sıvısı Arayüzü Bronşiyal Epitel Modeli

Bu protokol, viral olarak enfekte olmuş nazal epitel hücreleri ile doğuştan gelen hücre aktivasyonu arasındaki erken etkileşimlerin araştırılmasını detaylandırır. Bağışıklık hücrelerinin bireysel alt kümeleri, viral enfeksiyonlara yanıt olarak aktivasyonlarına göre ayırt edilebilir. Daha sonra erken antiviral yanıtlar üzerindeki etkilerini belirlemek için daha fazla araştırılabilirler.

Solunum Virüsü Enfeksiyonu Sırasında Doğuştan İmmün Hücre Aktivasyonunun İncelenmesi için Temassız Ko-Kültür Modeli

Mevcut protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı tip 2 alveoler epitel benzeri hücreleri (iAT2'ler) tanımlamaktadır. Bu hücreler 3D kültürde kendini yenileyen küreler olarak kültürlenebilir veya hava-sıvı arayüzü (ALI) kültürüne uyarlanabilir.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Tip 2 Alveolar Epitel Hücrelerinin 3D Küreleri ve 2D Hava-Sıvı Arayüz Kültürlerinin Üretilmesi

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre farklılaşma protokollerindeki son gelişmeler, organa özgü hücre tiplerinin kademeli olarak türetilmesine izin vermektedir. Burada, iPSC türevi hava yolu bazal hücrelerinin bakımı ve genişlemesi ve hava-sıvı arayüz kültürlerinde mukosiliyer bir epitel halinde farklılaşması için ayrıntılı adımlar sunuyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Hava Yolu Epitel Hücresi Hava-Sıvı Arayüz Kültürlerinin Oluşturulması

Nazal epitel, tüm solunum yolu patojenlerinin karşılaştığı birincil bariyer bölgesidir. Burada, fizyolojik olarak ilgili bir sistemde insan koronavirüs-konakçı etkileşimlerini karakterize etmek için hava-sıvı arayüz (ALI) kültürleri olarak büyütülen birincil nazal epitel hücrelerini kullanma yöntemlerini özetliyoruz.

İnsan Koronavirüs-Konakçı Etkileşimlerini Karakterize Etmek için Hava-Sıvı Arayüzünde Büyütülen Primer Nazal Epitel Hücrelerinin Enfeksiyonu

Burada, uzun süreli biyobankacılık için primer bronşiyal epitel hücrelerinin izolasyonu ve genişletilmesi ve hava-sıvı arayüzünde kültür yoluyla farklılaşmış epitel hücrelerinin üretilmesi için tekrarlanabilir, uygun fiyatlı ve sağlam bir yöntem sunulmaktadır.

Bronşiyal Epitel Hücrelerinin Biyobankacılık için Rezeke Akciğer Dokusundan İzole Edilmesi ve İyi Diferansiye Hava-Sıvı Arayüz Kültürlerinin Oluşturulması

Hava-sıvı arayüz kültürü, akciğer hava yolunun apikal tarafını taklit eden primer normal insan bronşiyal epitel hücrelerini farklılaştırarak psödostratifiye hava yolu epiteli geliştirmek için yaygın olarak kullanılır. Burada, siliyer fonksiyon ve membran bütünlüğü gibi biyofiziksel özelliklerini izleyerek kalitesini belirlemek için kolay bir protokol açıklıyoruz.

Psödostratifiye Akciğer Hava Yolu Epitelinin Siliyer Fonksiyonunun ve Membran Geçirimsizliğinin Belirlenmesi

Bu makale, bir hava-sıvı arayüz kültüründe indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi akciğer epiteli, mezenşim, endotel hücreleri ve makrofajlardan oluşan karmaşık, çok hücreli bir hava yolu bariyer modelinin oluşturulmasını açıklamaktadır.

Akciğer Sağlığı ve Hastalığında Hava Yolu Bariyeri Bütünlüğünü Modellemek için iPSC'den Türetilmiş Epitelyal, Mezenkimal ve İmmün Hücre Ko-Kültürü

Öğrenin, Transwell sisteminde Calu-3 hücreleriyle polarize sıvı kaplı kültür oluşturmayı. TEER ölçümü ve sodyum fluoressein testiyle bariyer bütünlüğünü değerlendirin.

Polarize İnsan Havayolu bir sıvı kaplı Kültürünün Oluşturulması Solunum Patojenler için Host Hücre Yanıtı Okumak Epitel Calu-3 Hücreler In vitro (Video) | JoVE Journal

Polarize İnsan Havayolu bir sıvı kaplı Kültürünün Oluşturulması Solunum Patojenler için Host Hücre Yanıtı Okumak Epitel Calu-3 Hücreler

Daha fazla video keşfet