Polarize İnsan Havayolu bir sıvı kaplı Kültürünün Oluşturulması Solunum Patojenler için Host Hücre Yanıtı Okumak Epitel Calu-3 Hücreler In vitro

Bu prosedürün genel amacı, Transwell kültür sistemini kurmak için bir Transwell kültür sistemi kullanarak Calu üç hücreli polarize sıvı kaplı bir kültür oluşturmaktır. İlk olarak, ekleri plakanın dış sıralarına hareket ettirerek ve her bir oyuğun bazolateral odalarına ortam ekleyerek bir transwell plakası hazırlayın. İkinci adım, tek katmanlı kültür hücrelerini tek hücreli süspansiyonlara hazırlamaktır.

Daha sonra, askıya alınan hücreler, transwell eklerinin apikal bölmelerine oturtulur. Son adım, apikal ve bazal lateral medyayı tamamen değiştirmektir. Kültürde, hücreler tamamen polarize olana kadar iki ila üç hafta boyunca üç ve ardından dört günlük bir döngüye eklenir.

Sonuç olarak, sıvı kaplı calu üç kültürün polarizasyonunu göstermek için trans epitelyal elektrik direnci ve pasif bir sodyum floresein dengeleme testi kullanılır. Bu tekniği kullanmanın normal insan bronşiyal epitel hücrelerini kullanmaya göre temel avantajı, Calor üç'ün daha erişilebilir olması ve daha hızlı polarize kültürlere dönüşmesidir Kullanıma hazır Polarize calu yetiştirmek için tüm prosedürler. Steril kültür teknikleri kullanılarak bir biyogüvenlik kabininde üç sıvı kaplı kültür veya LCC gerçekleştirilir.

24 kuyulu bir trans kuyu plakası hazırlayarak başlayın. Steril forseps kullanarak tohumlama için, transwell uçlarını ek parçaya dokunmadan plakanın iç kısmından dış sıralarına doğru hareket ettirin. Membran hücreleri sadece plakanın dış sıralarındaki kuyucuklara alt kültür olmalıdır.

%10 FBS içeren 600 mikrolitrelik EMEM, bundan sonra EMEM olarak anılacaktır, her bir bazolateral bölmeye% 10. Hava kabarcıklarının girmesini önlemek için, pipeti her bölmenin duvarına doğru eğin ve ortamı yavaşça kuyuya bırakın. Daha sonra, protokol metninde tarif edildiği gibi doku kültürü şişelerinden ve alt kültür hücrelerinden Colu üç hücresini ayırın, yıkanmış hücreleri beş mililitre EMEM %10'da hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice yeniden süspanse edin, trian mavisi dışlama yöntemiyle canlı ve toplam hücre sayılarını belirleyin ve yalnızca %80 ila %90'ı uygulanabilirse devam edin.

Daha sonra 50 mililitrelik steril bir konik tüpte, hücreleri mililitre başına iki kez 10 ila altı canlı hücre konsantrasyonuna seyreltin. EMEM ile% 10 ile, A ve D kuyuları hariç, her bir transwell'in apikal bölmesine 100 mikrolitre yeniden süspanse edilmiş calu üç hücre ekleyin. Pipeti kesici uç duvarının iç kılavuz kanalına doğru nazikçe eğin ve hücreleri yavaşça serbest bırakın.

Pipeti insert membranına dokundurmayın. Bu oturma adımı sırasında CALU üç hücreli süspansiyonu nazikçe çalkalayın ve hücrelerin A ve D kuyularına homojen bir süspansiyonunu koruyun, bu da hücresiz 100 mikrolitre EMEM'de hücresiz kontrol kuyuları veya boşluklar olacaktır% 10 hücresizdir. Trans kuyu plakasını, polarizasyonun verimliliğini artırmak için fiziksel rahatsızlığın minimum olacağı bir inkübatörde hava atmosferinde 37 santigrat derece ve% 7 karbondioksitte inkübe edin.

Alt kültürden üç gün sonra plakaları üst üste istiflemeyin ve üç hücreyi transwell'lere dökmeyin, hafif bir vakumla bir vakum tuzağına bağlı bir kılcal pipet kullanarak ortamı transwell eklerinden tamamen nazikçe aspire edin. Önce apikal besiyerini tüm oyuklardan çıkarın ve ardından bazolateral besiyerini tüm oyuklardan çıkarın. Ortamı aspire ederken ek membranlara dokunmayın.

200 mikrolitre EMEM ekleyin% 10 hücresiz kuyucuklar A ve D olanın apikal bölmesine. Daha sonra oturmuş kuyucuklara, pipet ucunu yönlendirmek için ek parçanın yan tarafını kullanarak ortamı apikal bölmeye yönlendirin. Ortamları doğrudan hücrelerin üzerine eklemeyin ve ekleme zarına dokunmayın.

Daha sonra, bazal yan bölmelere hava kabarcıklarının girmesini önlemek için bazal yan bölmelere 600 mikrolitre EMEM %10 ekleyin. Pipeti her bölmenin duvarına doğru açılandırarak ve ortamı yavaşça kuyuya bırakarak her birine orta ekleyin. Bu ilk ortamdan sonra transwell plakasını inkübatöre geri koyun. Yedek.

Ortam, hücreler tamamen polarize olana kadar önceki beslemeden sonraki dördüncü ve üçüncü gün arasında değişen bir döngüde değiştirilmelidir. Polarizasyon, kalibre edilmiş ve test edilmiş bir volter kullanılarak CALU üç LCC'nin trans epitelyal elektrik direnci veya yırtılması değerlendirilerek izlenir. Bu işleme başlamak için, elektrodu etanolden çıkarın, beş ila 10 saniye kurutun ve elektrodu steril EMEM ile durulayın %10 Lamperin mod anahtarını direnç ayarına getirin ve gücü açın.

Temel ölçümleri elde etmek için ölçümlere hücresiz kontrol kuyularıyla başlayın ve ardından her biri için ölçümlere devam edin. Elektrodu, transwell kültürünün bazolateral bölmesine erişime izin veren üç porttan birine nazikçe yerleştirin. Elektrodu, daha uzun uç dış kuyunun dibine hafifçe değecek ve dikey kalacak şekilde yerleştirin.

Ve daha kısa uç, ekleme zarına dokunmadan apikal bölmenin doku kültürü ortamındadır, ölçü R düğmesine basın ve okumanın stabilize olmasını bekleyin. Her kuyucuk için diğer iki bağlantı noktası için tekrarlayın ve polarizasyonun tamamlandığını doğrulamak için kuyu başına toplam üç ölçüm için üç bağlantı noktasından gelen ölçümleri kaydedin. Apikal ve bazolateral bölmeler arasındaki pasif sodyum floresein difüzyonunu ölçen ikincil bir test, bir ila üç transwell kültürü üzerinde gerçekleştirilir.

Test edilecek olan transwell kültürlerinin hem bazal lateral hem de apikal bölmelerinden ortamı dikkatlice çıkarın. Bazolateral bölmelere 600 mikrolitre oda sıcaklığı, steril DPBS ve apikal bölmelere 100 mikrolitre oda sıcaklığında steril DPBS ekleyerek transwell kültürlerini durulayın. DPBS'yi kuyulardan yavaşça çıkarın.

Bazolateral bölmelere 600 mikrolitre steril floresan olmayan tampon ekleyin, ardından apikal bölmelere 100 mikrolitre steril sodyum floresein ekleyin. Plakayı bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir saat sonra.

Floresan olmayan tampon numunesini, her bir test transwell'inin bazolateral bölmesinden ayrı bir temiz tüpe aktarın. Analiz için, pasif sodyum floresein difüzyonunu incelemek için kullanılan test transwell'lerini plakadan çıkarın ve atın. Kalan transwelllerle birlikte plakayı inkübatöre geri koyun.

Önceden hazırlanmış her bir sodyum floresein standart çözeltisinden 100 mikrolitreyi üç nüsha halinde 96 kuyulu düz bir alt plakaya yerleştirin. Floresan olmayan tamponda her bir bazal yanal numunenin üç seyreltmesini hazırlayın. Her numune için, 100 mikrolitre seyreltilmemiş numune ve her seyreltmeden 100 mikrolitre iki kopya halinde 96 kuyulu düz bir alt plakaya ekleyin.

Bir EISA plaka okuyucusunda numune absorbansını 486 nanometre veya 490 nanometrede ölçtü. Bu prosedüre başlamak için, önce hücreleri ve serum içermeyen EMEM'i bir vakum tuzağına bağlı bir kılcal pipet ile yıkayın, yumuşak bir vakumla tüm kuyucuklardan ortamı nazikçe aspire edin, apikal ortamı ve ardından bazolateral ortamı çıkarın, hücresiz kuyulardan aspire edin A bir ve D bir ve daha sonra tohumlanmış kuyulardan. Ortamı aspire ederken ek membranlara dokunmayın.

100 mikrolitre serum içermeyen EMEM, hücresiz kuyucuklar A ve D olanın apikal bölmesine ve daha sonra ortamı apikal bölmeye yönlendiren oturmuş kuyucuklara ekleyin. Pipet ucunu yönlendirmek için ek parçanın yan tarafını kullanın. Doğrudan hücrelerin üzerine ortam eklemeyin ve ekleme zarına dokunmayın.

Daha sonra 600 mikrolitre serumsuz EMEM'i bazolateral bölmelere ekleyin. Pipeti bölmenin duvarına doğru açılandırarak ve ortamı yavaşça kuyuya bırakarak her bir trans kuyucuğuna orta ekleyin: Serum içermeyen ortamı kuyulardan nazikçe aspire edin. Enfekte olmamış veya sahte enfekte kuyucuklardan başlayarak, uygun trans kuyucuklarının apikal bölmesine aşağıdaki virüs seyreltmelerini ekleyin.

Enfekte olmamış kuyular için 100 mikrolitre serumsuz EMEM. Sahte enfekte kuyular için serumsuz EMEM'de seyreltilmiş 100 mikrolitre virüssüz preparat ve virüs için serumsuz EMEM'de seyreltilmiş 100 mikrolitre virüs. Bundan sonra, tüm bazolateral bölmelere 600 mikrolitre serumsuz EM'de, iki saat boyunca 37 santigrat derece ve% 7 karbondioksitte inkübe edin.

İki saat sonra, önce enfekte olmamış ve sahte enfekte kuyulardan ve daha sonra enfekte olmuş kuyulardan ortamı aspire edin. Önce apikal süpernatantları, ardından bazal lateral süpernatanları çıkarın. Son olarak, bu videoda gösterilen yöntemi izleyerek ortamı 200 mikrolitre EMEM, apikal bölmelerde% 10 ve bazolateral bölmelerde% 600 mikrolitre EMEM ile değiştirin.

Trans epitelyal elektrik direnci veya calu üç sıvı kaplı kültürün yırtılması, tohumlamadan sonraki üç hafta içinde 1000 M'ye santimetre kare veya üzerinde bir platoya ulaşır. Bunun bir örneği bu şekilde gösterilmiştir, çünkü polarize hücreler arasında oluşan sıkı bağlantılar, apikal ve bazolateral bölmeler arasındaki küçük moleküllerin pasif dengesini önler. Calu üç sıvı kaplı kültürün polarizasyonunu doğrulamak için modifiye edilmiş bir sodyum floresan dengeleme testi kullanılır.

Calu, üç hücreli tek tabakalar ve sıvı kültürlerin katmanı arttıkça, bazolateral bölmeye pasif olarak dengelenen floresein miktarı azalır, dört bağımsız deneyden elde edilen kümülatif veriler burada sunulmaktadır ve her veri noktası ayrı bir ölçümü temsil etmektedir. Yırtılma santimetre kareye ait 1000 olduğunda, BA bazolateral bölmesine dengelenen floresein miktarı %1'e eşit veya daha azdırBu nedenle, calu üç sıvı kaplı kültür, katman santimetre kareye sahip 1000'e eşit veya daha büyük olduğunda tamamen polarize olarak kabul edilir. Calu üç sıvı kaplı kültür katmanı, santimetre kareye sahip 1000 veya üzerinde platolara ulaştığında, model, gösterildiği gibi solunum sinsityal virüsü veya RSV dahil olmak üzere solunum yolu epitel hücresi tepkilerini incelemek için kullanılmaya hazırdır.

Bu örnekte, kırmızı ile gösterilen RSV'ye maruz kalma, polarize kültürde daha hızlı bir düşüşe neden olur. Mavi verilerde temsil edilen hücrelerin sahte bir enfeksiyonu ile karşılaştırıldığında bütünlük, enfeksiyon başına sekiz bağımsız kuyucuğun medyan direnci, zaman noktası başına artı veya eksi SEM olarak sunulur. Yıldız işareti, öğrencinin T-testi testi ile belirlenen sahte ve RSVA iki enfekte kültür arasında 0.05'ten az P'yi gösterir.

Bulaşıcı ajanlarla çalışırken tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürleri gerçekleştirirken uygun KKD giymeniz ve iyi laboratuvar uygulamalarını kullanmanız gerektiğini unutmayın.