Name: Bej / Brite Hücreler Stromal Vasküler Hücre İzolasyonu ve Farklılaşma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Keşfedin fare yağ dokusundan stromal vasküler hücre izolasyonu ve bej hücrelere farklılaştırma yöntemini. Bu teknik metabolik hastalıklar ve obezite tedavisi araştırmalarında termojenik adiposit oluşumunu incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz tartışma, teknik yardım ve el yazması üzerinde editoryal yardım için Haruya Ohno, Kosaku Shinoda, Louis Sharp, Emi Tomoda ve Lauren Ruiz ederim. Bu çalışma Atılım Biyomedikal Araştırma ve Asubio Ecz Inc için Programı SKULA için NIH (DK087853), hibe Kopenhag ve AB 7.ÇP Proje Diabat (SAĞLIK-F2 Üniversitesi&#39;nden HİSSE doktora bursları ile desteklenmiştir tarafından desteklenmiştir Lise Madsen ve Karsten Kristiansen için -2.011-278373). Biz de DERC merkezi hibe (NIH P30 DK063720) kabul etmektesiniz.

1. Sindirim Orta hazırlayın Doku başına 5 fare (yaklaşık 1 ml / 1 g yağ dokusu) başına 5 ml olun. <ol><li> Sindirim enzimleri tartılır: - Collaginase D: 1.5 u / ml (1108874103, 1 g, Roche, 70334223) - Dispase II: 2.4 u / ml (04942078001, 0,980 mg / lyo, Roche, 11466200) </li><li> 25 ml PBS ekleyin ve çözünmesi için iyice karıştırın </li><li> 10 mM nihai bir konsantrasyonda doku sindirim hemen önce CaCI2 eklemek </li></ol> 2. Fare dan Yağ Dokusu teşrih <ol><li> Diseksiyon çok dikkatli yapılmalıdır, ve hemen fareler sonra (6-8 haftalık) kurban edilir. Açmadan önce fare kürk üzerine püskürtülür etanol ile steril çalışın. Temiz PBS, ayrı interskapular BAT ve subkutan kasık WAT doğrudan doku yerleştirin. </li><li> Interskapular BAT için: kadar karşı karşıya arka yerleştirilen fare sırt ve boyun için tüm yol boyunca açık kesti. Kahverengiadipoz doku doğru omuzlar (interskapular) arasındaki deri altında bulunabilir. BAT iki lobu, şeklindeki kelebek olarak görülebilir. BAT kapsayan beyaz yağ ince bir tabaka dikkatlice çıkarılması gerekmektedir. </li><li> Subkutan WAT (inguinal WAT) için: cilt kaldırmak. Kasık WAT içinde testis karşı uyluk ve aşağı, hemen hemen arkasında ve yanında başlangıç ​​olacak, her iki tarafta da deri altına direkt olarak bulunur. </li></ol> 3. Yağ Dokusu Kes ve Digest <ol><li> Çabuk saç, iskelet kası ve doku kesitlerinde gelen bağ dokusu gibi, tüm kontaminasyonu temizlemek. </li><li> PBS ile diseksiyon orta sulandırmak ve kuru bir tabağa yerleştirin değil kağıt üzerinde hızla doku kurulayın. </li><li> Sindirim orta (ön sindirime CaCI2 eklenir) ve küçük parçalar halinde doku kıyma ekleyin. 5 ml&#39;lik pipet ve aşağı yukarı pipetleme tarafından çok iyi karıştırın. Sindirim m geri kalanı ile 50 ml tüp içinde kıyılmış doku aktarınedium, aşağı yukarı pipetleme ve daha da karıştırın. </li><li> Digest 37 ° C 40-50 dakika için 150 rpm&#39;de sabit ajitasyon. Sindirim iyi gidiyor ve aşırı-sindirim önlemek için emin olmak için her 10-15 dakika kontrol edin. </li></ol> Not: Doğru sindirim, orta ve zaman önemlidir. Doku de sindirilmesi gerekir, ama aşırı sindirim hücrelerine zarar verebilir. 4. Filtre Hücre Süspansiyon <ol><li> 5 ml tam orta (DMEM/F12 içeren% 10 FPS ve P / S) ekleyerek sindirim durdurun. Hücreler hemen hemen tamamen homojen olması gerekir. Pipetleme ile iyice karıştırın. </li><li> 10 dakika boyunca 700 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> SVF şu anda, tüpün altına bir kahverengimsi bir pelet olarak görülebilir. Üst ve sıvı tabaka çoğu üzerinde yağlı olgun adiposit tabaka aspire - pelet tutmak ve 10 ml tam bir ortam içinde çözülür. İyice karıştırın. </li><li> Yeni bir 50 üzerinde bir hücre süzgeç (50-70 mikron çaplı) yerleştirin<html> ml tüp ve hücre süspansiyonu filtre. </li></ol> 5. Plaka Hücreler <ol><li> 10 dakika boyunca 700 xg&#39;de 15 ml tüp ve santrifüj hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> 10 ml tam bir ortam içinde ortam aspire ve yeniden askıya pelet. Pipet ve iyi karıştırın. </li><li> Ihtiyaç kaç tabak tahmin. Bu değişiklik ve topak boyutuna bağlı olarak değişebilir. Genel bir kural inguinal WAT için 5 fareler ve BAT için bir 10 cm plaka 10 cm tabak 2&#39;dir. </li><li> Tam orta kollajen kaplı yemekleri Tabak hücreleri (Ar-Ge) </li><li> 1-2 saat hücreleri, aspirat orta kaplama sonra, iki kez PBS ile yıkayın ve taze orta ekleyin. Bu kırmızı kan hücreleri, bağışıklık hücreleri ve diğer kirleticiler kaldırmak bu adım önemlidir. </li></ol> 6. Hücreler farklılaştırın <ol><li> Bakım ve indüksiyon ortamlar olun. </li></ol> Bakım orta Eklenen orta tamamlayın: ent &quot;&gt; İnsülin, nihai kons. 5 ug / ml (5 mg / ml stok, pH 2.5 asitlendirilmiş su hazırlamak için 10 ml H2O içindeki asetik asit *** 100 ul. asitlendirilmiş su içinde insülin çözülür. deposu stok itibariyle -20 ° C) 3,3 &#39;,5 triiodo-L-thyronine (T3), son kons. 1 nM (10 uM stok, *** 1N NaOH T3 çözülür ve 10 uM stok yapmak için orta ekleyin. Sigma kedi # T-2877) 4 ° C arasında, bir hafta için iyi İndüksiyon orta Aşağıdaki bileşikler ihtiva eden bakım ortamı: İndometazin, son kons. 125 uM (etanol 0.125 M stok, Sigma kedi # I-7378). Indometasin 60 ısıtılması gerekir ° C&#39;de eritildi gerekir. Deksametazon, son kons. 2 ug / ml (etanol içinde 2 mg / ml çorap, Sigma cat # D-1756) 3-izobütil-1-metilksantin (IBMX), nihai kons. 0.5 mM (DMSO 0.25 M stok, Sigma kedi # I-5879) Rosiglitazon, son kons. 0.5 uM(DMSO içinde 10 mM stok, Sigma kedi # R-2408) Not: Her zaman orta taze indüksiyon olun. <ol start="2"><li> Tam orta 95-97% izdiham (konfluent ama çok dolu değil) birincil adipositler büyümek </li><li> Indüksiyon orta (gün 0) düzenli komple orta değiştirme </li><li> 48 saat (2 gün) sonra, rosiglitazon (0.5 uM) ile bakım ve orta orta değiştirin </li><li> Ek 48 saat (günde 4) sonra ek 2-3 gün rosiglitazon ile taze bakım ortamı (1 uM) değiştirebilirsiniz. 6-7 gün indüksiyon orta ekledikten sonra, hücreler tamamen yağ hücrelerinin olgunlaşması için farklılaştığı ve yağ damlacıkları ile dolu. Damlacıklar indüksiyon 3-4 gün sonra etrafında görünecektir. </li></ol> Not: Değişim orta hücreleri tamamen farklılaşmış olan 2-3 gün kadar. Hücreler artık hasat ve Ucp1 ve Othe mRNA edilebilirr kahverengi adiposit-özgü genler qRT-PCR yöntemi ile ölçülebilir. Western blot proteinleri tespit etmek için kullanılacaktır.

<ol><li>Barness, L. A., Opitz, J. M., Gilbert-Barness, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%3A+genetic%2C+molecular%2C+and+environmental+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Obesity: genetic, molecular, and environmental aspects.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 143A, 3016-3034 (2007).</li>
<li>Rothwell, N. J., Stock, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effects+of+cafeteria+and+tube-feeding+on+energy+balance+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Proceedings+of+the+Nutrition+Society%22%5BJournal%5D)">Combined effects of cafeteria and tube-feeding on energy balance in the rat.</a> The Proceedings of the Nutrition Society. 38, 5A(1979).</li>
<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue%3A+function+and+physiological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).</li>
<li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+importance+of+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans.</a> The New England Journal of Medicine. 360, 1509-1517 (2009).</li>
<li>van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-activated+brown+adipose+tissue+in+healthy+men%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cold-activated brown adipose tissue in healthy men.</a> The New England Journal of Medicine. 360, 1500-1508 (2009).</li>
<li>Virtanen, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+brown+adipose+tissue+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional brown adipose tissue in healthy adults.</a> The New England Journal of Medicine. 360, 1518-1525 (2009).</li>
<li>Zingaretti, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+UCP1+demonstrates+that+metabolically+active+adipose+tissue+in+the+neck+of+adult+humans+truly+represents+brown+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The presence of UCP1 demonstrates that metabolically active adipose tissue in the neck of adult humans truly represents brown adipose tissue.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 3113-3120 (2009).</li>
<li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+incidence+of+metabolically+active+brown+adipose+tissue+in+healthy+adult+humans%3A+effects+of+cold+exposure+and+adiposity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity.</a> Diabetes. 58, 1526-1531 (2009).</li>
<li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRDM16+controls+a+brown+fat%2Fskeletal+muscle+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch.</a> Nature. 454, 961-967 (2008).</li>
<li>Petrovic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+%28PPARgamma%29+activation+of+epididymally+derived+white+adipocyte+cultures+reveals+a+population+of+thermogenically+competent%2C+UCP1-containing+adipocytes+molecularly+distinct+from+classic+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2010).</li>
<li>Coulter, A. A., Bearden, C. M., Liu, X., Koza, R. A., Kozak, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+fat+interacts+with+QTLs+controlling+induction+of+Pgc-1+alpha+and+Ucp1+during+conversion+of+white+to+brown+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Dietary fat interacts with QTLs controlling induction of Pgc-1 alpha and Ucp1 during conversion of white to brown fat.</a> Physiological Genomics. 14, 139-147 (2003).</li>
<li>Klingenspor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-induced+recruitment+of+brown+adipose+tissue+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cold-induced recruitment of brown adipose tissue thermogenesis.</a> Experimental Physiology. 88, 141-148 (2003).</li>
<li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adipose+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins%2C+leukotrienes%2C+and+essential+fatty+acids%22%5BJournal%5D)">The adipose organ.</a> Prostaglandins, leukotrienes, and essential fatty acids. 73, 9-15 (1016).</li>
<li>Ghorbani, M., Himms-Hagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+of+brown+adipocytes+in+white+adipose+tissue+during+CL+316%2C243-induced+reversal+of+obesity+and+diabetes+in+Zucker+fa%2Ffa+rats%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Obesity+and+Related+Metabolic+Disorders%3A+Journal+of+the+International+Association+for+the+Study+of+Obesity%22%5BJournal%5D)">Appearance of brown adipocytes in white adipose tissue during CL 316,243-induced reversal of obesity and diabetes in Zucker fa/fa rats.</a> International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders: Journal of the International Association for the Study of Obesity. 21, 465-475 (1997).</li>
<li>Hansen, J. B., Kristiansen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+circuits+controlling+white+versus+brown+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulatory circuits controlling white versus brown adipocyte differentiation.</a> The Biochemical Journal. 398, 153-168 (2006).</li>
<li>Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARy+agonists+induce+a+white-to-brown+fat+conversion+through+stabilization+of+PRDM16+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+metabolism%22%5BJournal%5D)">PPARy agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein.</a> Cell metabolism. 15, 395-404 (2012).</li>
<li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+bipotential+adipocyte+progenitors+recruited+by+beta3-adrenoceptor+activation+and+high-fat+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding.</a> Cell Metabolism. 15, 480-491 (2012).</li>
<li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transdifferentiation+properties+of+adipocytes+in+the+adipose+organ%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transdifferentiation properties of adipocytes in the adipose organ.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E977-E986 (2009).</li>
<li>Barbatelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+mouse+white+fat+depots+is+determined+predominantly+by+white+to+brown+adipocyte+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 298, E1244-E1253 (2010).</li>
<li>Petrovic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+%28PPARgamma%29+activation+of+epididymally+derived+white+adipocyte+cultures+reveals+a+population+of+thermogenically+competent%2C+UCP1-containing+adipocytes+molecularly+distinct+from+classic+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2009).</li>
<li>Rong, J. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+mitochondrial+biogenesis+is+suppressed+in+db%2Fdb+and+high-fat+diet-fed+mice+and+improved+by+rosiglitazone%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Adipose mitochondrial biogenesis is suppressed in db/db and high-fat diet-fed mice and improved by rosiglitazone.</a> Diabetes. 56, 1751-1760 (2007).</li>
<li>Wilson-Fritch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+remodeling+in+adipose+tissue+associated+with+obesity+and+treatment+with+rosiglitazone%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone.</a> The Journal of Clinical Investigation. 114, 1281-1289 (2004).</li>
<li>Sell, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+agonism+increases+the+capacity+for+sympathetically+mediated+thermogenesis+in+lean+and+ob%2Fob+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonism increases the capacity for sympathetically mediated thermogenesis in lean and ob/ob mice.</a> Endocrinology. 145, 3925-3934 (2004).</li>
<li>Fukui, Y., Masui, S., Osada, S., Umesono, K., Motojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+thiazolidinedione%2C+NC-2100%2C+which+is+a+weak+PPAR-gamma+activator%2C+exhibits+potent+antidiabetic+effects+and+induces+uncoupling+protein+1+in+white+adipose+tissue+of+KKAy+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">A new thiazolidinedione, NC-2100, which is a weak PPAR-gamma activator, exhibits potent antidiabetic effects and induces uncoupling protein 1 in white adipose tissue of KKAy obese mice.</a> Diabetes. 49, 759-767 (2000).</li>
<li>Vernochet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C%2FEBPalpha+and+the+corepressors+CtBP1+and+CtBP2+regulate+repression+of+select+visceral+white+adipose+genes+during+induction+of+the+brown+phenotype+in+white+adipocytes+by+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">C/EBPalpha and the corepressors CtBP1 and CtBP2 regulate repression of select visceral white adipose genes during induction of the brown phenotype in white adipocytes by peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4714-4728 (2009).</li>
<li>Tai, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+nuclear+receptor+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+promotes+brown+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Activation of the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma promotes brown adipocyte differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271, 29909-29914 (1996).</li>
<li>Sugii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARgamma+activation+in+adipocytes+is+sufficient+for+systemic+insulin+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">PPARgamma activation in adipocytes is sufficient for systemic insulin sensitization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 22504-22509 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Burada farelerde primer kültürlerinde adipositlerde bej / brite hücrelerinin gelişimini incelemek için güvenilir bir hücresel sistem sunuyoruz. Gibi çeşitli mevcut ölümsüzleştirilmiş hücre soyları ile karşılaştırıldığında, bu sistem, in vivo beyaz yağ kahverengileşme ile geliştirilmiş İlgiye sunmak için olasıdır. Bu birincil adipositlerin çalışmanın bazı avantajlar sunuyor olsa da, orada da düşünülmesi gereken önemli bazı sınırlamalar ve endişeleri var. İlk olarak, bu sistem, hücre ...

<html> Obezite ölçüde dünya çapında artan ve şu anda halk sağlığı 1 için en ciddi kaygılarından biri olarak kabul edilir. Bu durum bir harcama enerji alımı göreli misbalance ve beyaz yağ dokusu (WAT) lipid olarak depolanan fazla enerji sonuçları ile ilgilidir. Kahverengi adipoz dokuda ısı üretmek için fazla enerjiyi dağıtmak için yeteneğine sahipken Büyümüş WAT, artan vücut kütlesi ve ağırlığı ile ilişkilidir. Bu nedenle BAT soğuk ve obezite 2,3 hem de karşı koruma olarak işlev görebilir. Bu protein 1 (UCP1) ile ayrılmasının mitokondri içinde elektron nakil bölgesinin ayrılmasının elde edilir. Bu protein, BAT 3 termojenez nonshivering için ayırt edici bir özelliği olarak kabul edilir. Son yıllarda çeşitli çalışmalar erişkin insanlarda fonksiyonel BAT 4-8 var ve dolayısıyla insanlarda BAT manipülasyon obezite ve ilgili hastalıklara karşı savaşta potansiyel bir terapötik girişim olabileceğini ortaya koymuştur. jove_content &quot;&gt; Mevcut kanıtlar kahverengi adiposit iki tip kemirgenlerde bulunduğunu gösterir,&quot; klasik &quot;ya da&quot; önceden mevcut olan &quot;kahverengi yağ doğum öncesi aşama sırasında ortaya çıkar ve interskapular ve diğer periferik dokularda adanmış kahverengi yağ deposu oluşturan diğer taraftan. , kahverengi yağ (yani brite veya bej hücreler denir) bir &quot;indüklenebilir&quot; şeklinde doğum sonrası aşamasında gelişir ve beyaz adipoz dokularında serpiştirilmiş görünür. kahverengi adipositlerin iki tip de farklı gelişimsel kökenleri ile ayrılır. önceden mevcut iken kahverengi adipositler Myf5 öncüleri myoblastsic gibi ortaya çıkar, WAT olarak serpiştirilmiş indüklenebilir bej / brite hücre dışı bir Myf5 soy 9,10 ortaya çıkar. Buna ek olarak, bu tip hücre düzenleyici yollar Myf5 türevi kahverengi farklı olması muhtemeldir adipositler 11. bej hücreleri (beyaz yağ yani &quot;esmerleşme&quot;) gelişimi kronik soğuk maruziyeti ve yanıt olarak aktive edilebilirβ3-adrenoseptör agonistler veya yetişkin 12-14 yılında PPARy agonistleri. Bej / brite hücreler genel enerji dengesi manipülasyonu için umut verici bir terapötik hedef olması muhtemel ve potansiyel obezite tedavisinin bir parçası haline gelebilir, bu nedenle, çevresel ipuçları bej gelişimini kontrol hangi hassas moleküler mekanizmaları ve sinyal yolları anlamak önemlidir hücreler. Beyaz yağ esmerleşme moleküler kontrolünü anlamak için, in vitro deneylerde iyi preadipositlerden oldukça uyumsuz gerçekleşir farklılaşması olarak uygun ve yerinde 15 hücreleri tespit etmek zordur. Adiposit geliştirme çalışmaları, şimdiye kadar bu tür 3T3-L1, 3T3-F442A veya HIB1 gibi hücre soyları üzerine esas olarak gösterilmiş olsa da, bu hücre hatları bej hücre moleküler imza eksikliği görülmektedir. Diğer taraftan, derialtı WAT izole birincil adipositler süreç yeniden özetlemek için büyük olasılıklaBir hücre özerk moda beyaz yağ esmerleşme s. Burada yağ dokularından stromal-vasküler fraksiyonun etkili izolasyonu için ve PPARy agonistleri yanıt olarak beyaz yağ kahverengileşme indüklenmesi için bir protokol sağlar. Rosiglitazon, bu hücrelerde esmerleşmenin özellikle etkili bir aracı olduğu gösterilmiştir. 16. Daha önce de belirtildiği gibi, bu hücresel sistem bej / brite hücrelerinin gelişimini incelemek için güvenilir bir hücresel sistem hizmet etmek için de kullanılabilir.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reaktif </td></tr><tr><td> Collaginase D </td><td> Roche </td><td> 11088874103 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase II </td><td> Roche </td><td> 04942078001 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM ortamı </td><td> Balıkçı </td><td> 10017-CV </td><td> Sodyum piruvat olmadan 2,5 g / l glukoz ve L-glutamin ile </td></tr><tr><td> Ensülin </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> T3 (3,3 &#39;,5-triiodo-L-thyronine) </td><td> Sigma </td><td> T-2877 </td><td></td></tr><tr><td> İndometazin </td><td> Sigma </td><td> I-7378 </td><td></td></tr><tr><td> Deksametazon </td><td> Sigma </td><td> D-1756 </td><td></td></tr><tr><td> IBMX </td><td> Sigma </td><td> I-5879 </td><td></td></tr><tr><td> Rosiglitazon </td><td> Sigma </td><td> R-2408 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ekipman </td></tr><tr><td> Kollajen kaplı yemekleri </td><td> BD </td><td> 354450 </td><td> 10 cm tabaklar </td></tr><tr><td> 70 um bir filtreden </td><td> BD Falcon </td><td> 352350 </td><td> Hücre süzgeç, 70 mikron naylon 1/ea </td></tr></tbody></table>

bej / brite hücreler stromal vasküler hücre İzolasyonu ve farklılaşma

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Kahverengi adipositler mitokondrilerde solunum zinciri ayırınız ve ısı gibi kimyasal enerjiyi için yeteneği var. Beyaz adipoz doku (yani bej veya brite hücreler olarak adlandırılır) UCP1 pozitif kahverengi adipositlerin Kalkınma yüksek kronik soğuğa maruz kalma ya da PPARy agonistleri tarafından çevresel işaretlerin çeşitli neden, bu nedenle, bu hücre tipi için bir terapötik hedef olarak potansiyele sahip obezite tedavisinde. Çoğu ölümsüzleştirdi adiposit hatları kültüründe beyaz yağ &quot;esmerleşme&quot; süreci özetleyen edemesek de, birincil adipositler brite / bej hücre gelişiminin moleküler kontrolü çalışmak için güvenilir hücresel sistem sağlamak subkütan beyaz adipoz dokuda stromal vasküler fraksiyon (WAT) izole . Burada primer preadipositlerden etkin izolasyonu ve kültür bej / brite hücrelerine farklılaşma inducing için bir protokol açıklar. Esmerleşme efekti kahverengi yağ seçici işareti ifade tarafından tespit edilebilirBöyle UCP1 gibi ers.

Birincil adipositlerin Browning mRNA Ucp1 ifade ve qRT-PCR ile diğer kahverengi yağ-spesifik veya seçici genler ölçerek erişilebilir. Şekil 1&#39;de Sunan inguinal WAT-kökenli birincil adipositlerde gen ekspresyonu veridir. Hücreler, sırasıyla 50 nM ve 500 nM de rosiglitazon iki farklı dozda varlığında ayırt etmek için oluşturuldu. Hücrelerinin bir alt kümesi, hasattan önce 4 saat boyunca 10 uM forskolin ile de muamele edilmiştir. Bu hücrelerde siklik-AMP (cAMP) teşvik ve Ucp1 ekspresy...

Farelerde beyaz adipoz dokulardan izole İlköğretim beyaz preadipositlerden bej / brite hücrelerine ayırt edilebilir. Burada sunulan beyaz yağ &quot;esmerleşme&quot; moleküler düzenlenmesi okumak için güvenilir hücresel modeli sistemidir.

Bej / Brite Hücreler Stromal Vasküler Hücre İzolasyonu ve Farklılaşma

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Bu prosedürün genel amacı, primer adipositleri izole etmek ve kültürde bej veya parlak hücrelere farklılaşmalarını indüklemektir. İlk adım, farelerden yağ dokusunu incelemektir. Daha sonra, doku kollajenaz ile sindirilir.Stroma vasküler fraksiyonu izole edildikten sonra hücreler kaplanır. Son adım, hücrelerin bej veya parlak hücrelere farklılaşmasını indüklemektir. Sonuç olarak, kahverengi adiposit spesifik genlerin artan ekspresyonunu göstermek için analitik yöntemler kullanılır.Bu yöntem, kahverengi yağ dokularındaki temel soruların ele alınmasına yardımcı olabilir, bu da moleküler mekanizmanın parlak veya hücrelerin gelişimini düzenlediği şeydir. Bu tekniğin etkileri, obezite ve diğer yaşam tarzı hastalıklarının tedavisine kadar uzanır. İnsanlarda kahverengi yağ dokusunun manipülasyonu potansiyel bir terapötik müdahale olarak kullanılabileceğinden, İlk adım sindirim ortamını hazırlamaktır.Daha sonra ötenaziden sonra yağ dokusu çıkarılır. İlk olarak, hayvanın sırtından boynuna kadar keserek interskapular kahverengi yağ dokusunu veya yarasayı izole edin. Omuzlar arasındaki derinin hemen altında iki loblu kahverengi yağ dokusu bulunabilir.Ardından, yarasayı kaplayan ince beyaz yağ tabakasını dikkatlice çıkarın. İzole edildikten sonra, dokuyu doğrudan temiz PBS'ye yerleştirin. Kasık beyaz yağ dokusu veya wat, her iki tarafta doğrudan derinin altında bulunur.Uylukların iç kısmına ve testislere doğru uzanır. Dokuyu çıkarın ve temiz PBS'ye yerleştirin. Aşağıdaki adımlar hem yarasa hem de ıslak numunelere uygulanır.Doku bölümlerinden saç, iskelet kası ve bağ dokusu gibi tüm kontaminasyonları hızla çıkarın. Daha sonra, diseksiyon ortamının PBS ile seyreltilmesini önlemek için dokuyu bir kağıt havlu üzerinde hızlı bir şekilde kurulayın ve kuru bir tabağa koyun. Sindirim ortamını ekleyin ve dokuyu küçük parçalar halinde kıyın.Daha sonra, dokuyu sindirim ortamının geri kalanını içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpü, sindirmek için 40 ila 50 dakika boyunca sürekli çalkalama ile 37 derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Sindirimin iyi gittiğinden emin olmak ve aşırı sindirimi önlemek için her 10 ila 15 dakikada bir kontrol edin.Doku iyice sindirildikten sonra sindirimi durdurun. Beş mililitre tam ortam ekleyerek ve iyice karıştırarak, hücreler neredeyse tamamen homojen olmalıdır. Daha sonra, numuneyi 10 dakika boyunca 700 kez G'de santrifüjleyin.Stromal vasküler fraksiyon şimdi tüpün altında kahverengimsi bir topak olarak görünür olmalı, üstte yağlı olgun adiposit tabakasını ve sıvı tabakanın çoğunu aspire etmelidir. Daha sonra, peleti 10 mililitrede çözün, ortayı tamamlayın ve iyice karıştırın. Karıştırıldıktan sonra, 50 mililitrelik yeni bir tüpün üzerine bir hücre süzgeci yerleştirin ve hücre süspansiyonunu süzün.Filtrelenmiş hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 10 dakika boyunca 700 kez G'de santrifüjleyin. Ardından, ortamı aspire edin ve peleti yeniden askıya alın. 10 mililitre tam orta boy pipet ve iyice karıştırın, hücreleri gerektiği gibi kaplayın.Genel olarak, beş fare, iki adet 10 santimetrelik kasık wat plakası ve bir tabak yarasa verecektir. Kaplamadan bir veya iki saat sonra. Ortamı aspire edin, PBS ile iki kez yıkayın ve taze ortam ekleyin.Bu adım, kırmızı kan hücrelerini, bağışıklık hücrelerini ve diğer kirleticileri ortadan kaldırabileceği için önemlidir. Bakım ve indüksiyon ortamları önceden hazırlanır. Birincil adipositler% 95 ila 97 birleşim noktasına ulaştığında, normal tam ortamı indüksiyon ortamı ile değiştirin.48 saat sonra, ortamı 0.5 mikromolar RO glitazon içeren bakım ortamına değiştirin. Ek bir 48 saat sonra, iki ila üç gün daha bir mikromolar RO glitazon içeren taze bakım ortamına geçin. Damlacıklar, indüksiyon ortamının ilk eklenmesinden altı ila yedi gün sonra burada görüldüğü gibi, indüksiyondan yaklaşık üç ila dört gün sonra ortaya çıkacaktır.Hücreler olgun yağ hücrelerine tamamen farklılaşmalı ve yağ damlacıkları ile doldurulmalıdır. Hücreler artık hasat edilebilir ve daha fazla analiz için kullanılabilir. Primer adipositlerin esmerleşmesi, burada görüldüğü gibi kahverengi yağa özgü veya seçici genlerin mRNA'sının Q-R-T-P-C-R ile ölçülmesiyle değerlendirilebilir.RO glitazon, sağlam bir şekilde indüklenmiş UCP bir mRNA ekspresyonu FORSKOLIN tedavisi burada siklik A MP olarak belirtilmiştir. RO glitazonun neden olduğu UCP'nin bir ekspresyonu daha da artırıldı. ÇİA. Başka bir kahverengi yağ seçici gen de doza bağlı bir şekilde sağlam bir şekilde arttırıldı. RO glitazon tedavisi ayrıca hem kahverengi hem de beyaz yağ için FABP dört ve adipojenik belirteç ekspresyonunu arttırdı.Bu esmerleşme etkisi sadece kendi başına adipogenezin artmasından kaynaklanmadı. UCP bir ve CDIA ekspresyonunun indüksiyonu hala önemli olduğundan, mRNA seviyeleri FABP dörtüncüsününkilere normalize edilmiş olsa bile, bu Western blot, UCP birin artmış protein seviyesini doğrular. Bu videoyu izledikten sonra, preadipositlerin nasıl izole edileceğini ve bu hücrelerin kültürde bej veya parlak hücrelere nasıl ayırt edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

isolation-differentiation-stromal-vascular-cells-to-beigebrite

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

2001 yılında, UCLA araştırmacılar erişkin kök hücrelerin bir nüfus izolasyon, adipoz dokudan, Yağ elde edilen kök hücreler veya TSK adlandırılan nitelendirdi. Bu makale kolajenazı kullanarak manuel, enzimatik sindirim protokolü kullanılarak lipoaspirates gelen TSK izolasyonunu özetliyor.

İnsan Lipoaspirates den Yağ-türetilen Kök Hücre Manuel İzolasyon

Rejeneratif uygulamalar için idealdir insan iskelet kası liman birkaç çok-soy öncü nüfus içindeki kan damarları. Intima gelen Miyojenik endotel hücreleri, medya perisitler ve adventisyanın gelen adventisyal hücreler: Bu izolasyon yöntemi, kan damarlarının üç yapısal katmanları sırasıyla üç multipotent öncü hücre popülasyonlarının eşzamanlı arınma sağlar.

İnsan İskelet Kası Kan-damar-türevli Multipotent Öncüleri İzolasyonu

Lenf nodu stromal hücrelerinin izolasyonu, fibroblastik retiküler hücreler, lenfatik ve kan endotel hücreleri elde etmek için enzimatik sindirim ve mekanik ayrıştırmayı içeren çok aşamalı bir prosedürdür. Tarif edilen prosedürde, canlı lenf nodu stromal hücrelerinin yüzey işaretleyici bozulmasını en aza indirmek için kısa bir sindirim otomatik mekanik ayrıştırma ile birleştirilir.

Kemirgen Lenf Düğümü Stromal Hücrelerinin İzolasyonu

İnsan adipoz kaynaklı stromal hücrelerindeki transkripsiyonel heterojenlik, hücre yüzeyi belirteçleri ve osteojenik genler kullanılarak tek hücre düzeyinde tanımlanabilir.  Bu çalışmada, kraniyofasiyal iskelet rekonstrüksiyonunu arttırmak için kullanılabilecek artmış osteojenik potansiyele sahip hücre alt popülasyonlarının izolasyonu için akış sitometrisi kullanan bir protokol tanımlanmıştır.

İzolasyon ve İnsan zenginleştirilmesi Gelişmiş Osteogenezi için Stromal Hücreleri adipoz-türevi

İnsan kalp dokusu miyokardiyal rejenerasyonu için uygun multipotent perivasküler öncü hücre popülasyonlarının barındırır. Perisitler ve CD34 + CD146 - - adventisya hücreleri, insan miyokard burada tarif edilen teknik, yerli kan damarları, örneğin CD146 + CD34 ile ilgili iki multipotent stromal hücre popülasyonlarının eş zamanlı izolasyonu ve saflaştırılması mümkün kılar.

İnsan Kardiyak Doku perivasküler Multipotent Öncü hücre popülasyonlarının izolasyonu

Bu makalede, biz izole ve kemik iliği stromal hücreler ve hematopoetik kök hücre fare uzun kemiklerin ayırt etmek için yöntemler mevcut. İki farklı protokol verimli farklı hücre popülasyonlarının genişleme ve farklılaşma dokusunu, adipositler ve Osteoklastlar içine uygun sunulmaktadır.

Yalıtım, kültür ve kemik iliği Stromal hücreler ve Osteoklast ataları fareler gelen farklılaşma

Yağ dokusu vasküler ataları gelen beyaz ve bej adiposit farklılaşma obezite metabolik iyileştirme için potansiyel taşımaktadır. CD34 + CD31 + insan yağı endotel hücre izolasyon ve bir sonraki vitro genişleme ve farklılaşma beyaz ve bej adiposit içine iletişim kurallarını açıklar. Birkaç aşağı akım uygulamaları ele alınmıştır.

Yalıtım, genişleme ve Adipojenik indüksiyon CD34 + CD31 + insan Omental ve deri altı yağ dokusu endotel hücrelerden

Bu protokol, adipojenik ve fibro-inflamatuar stromal hücre alt popülasyonlarını murin karın içi beyaz yağ dokusu (WAT) depolarından floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması veya immünmanyetik boncuk ayırma yoluyla izole etmek için teknik yaklaşımı açıklar.

Murin İntraabdominal Yağ Depolarından Adipojenik ve Fibroinflamatuar Stromal Hücre Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Bu protokol, preadipositleri elde etmek ve in vitro adiposit diferansiyasyonunu sağlamak için stromal vasküler fraksiyonun (SVF) murin yağ dokusundan yarı otomatik izolasyonunu tanımlar. Kollajenaz sindirimi için bir doku ayrıştırıcısı kullanmak deneysel varyasyonu azaltır ve tekrarlanabilirliği arttırır.

Bir Doku Dissosiyatör Kullanarak Stromal Vasküler Fraksiyonun Murin Beyaz Yağ Dokusundan Yarı Otomatik İzolasyonu

Burada, tek hücreli multiomik ile uyumlu murin kemiği, kemik iliği, timus ve insan timik dokusundan stromal hücrelerin izolasyonunu sağlayan protokoller sunulmaktadır.

Hematopoetik Organlardan Stromal Hücre İzolasyonu

Burada, fare stria vascularis'ten birincil marjinal hücrelerin izolasyonu, saflaştırılması ve kültürü için bir protokol sunuyoruz ve koklear yan duvar bozukluklarını incelemek için oksidatif stres ve hücresel yaşlanma için in vitro modeller oluşturulmuştur.

Stria vascularis'in Primer Marjinal Hücrelerinin Yenidoğan Farelerden İzolyasyonu ve Kültürü

Keşfedin fare yağ dokusundan stromal vasküler hücre izolasyonu ve bej hücrelere farklılaştırma yöntemini. Bu teknik metabolik hastalıklar ve obezite tedavisi araştırmalarında termojenik adiposit oluşumunu incelemek için kullanılır.

Bej / Brite Hücreler Stromal Vasküler Hücre İzolasyonu ve Farklılaşma

Daha fazla video keşfet