Bej / Brite Hücreler Stromal Vasküler Hücre İzolasyonu ve Farklılaşma

Bu prosedürün genel amacı, primer adipositleri izole etmek ve kültürde bej veya parlak hücrelere farklılaşmalarını indüklemektir. İlk adım, farelerden yağ dokusunu incelemektir. Daha sonra, doku kollajenaz ile sindirilir.

Stroma vasküler fraksiyonu izole edildikten sonra hücreler kaplanır. Son adım, hücrelerin bej veya parlak hücrelere farklılaşmasını indüklemektir. Sonuç olarak, kahverengi adiposit spesifik genlerin artan ekspresyonunu göstermek için analitik yöntemler kullanılır.

Bu yöntem, kahverengi yağ dokularındaki temel soruların ele alınmasına yardımcı olabilir, bu da moleküler mekanizmanın parlak veya hücrelerin gelişimini düzenlediği şeydir. Bu tekniğin etkileri, obezite ve diğer yaşam tarzı hastalıklarının tedavisine kadar uzanır. İnsanlarda kahverengi yağ dokusunun manipülasyonu potansiyel bir terapötik müdahale olarak kullanılabileceğinden, İlk adım sindirim ortamını hazırlamaktır.

Daha sonra ötenaziden sonra yağ dokusu çıkarılır. İlk olarak, hayvanın sırtından boynuna kadar keserek interskapular kahverengi yağ dokusunu veya yarasayı izole edin. Omuzlar arasındaki derinin hemen altında iki loblu kahverengi yağ dokusu bulunabilir.

Ardından, yarasayı kaplayan ince beyaz yağ tabakasını dikkatlice çıkarın. İzole edildikten sonra, dokuyu doğrudan temiz PBS'ye yerleştirin. Kasık beyaz yağ dokusu veya wat, her iki tarafta doğrudan derinin altında bulunur.

Uylukların iç kısmına ve testislere doğru uzanır. Dokuyu çıkarın ve temiz PBS'ye yerleştirin. Aşağıdaki adımlar hem yarasa hem de ıslak numunelere uygulanır.

Doku bölümlerinden saç, iskelet kası ve bağ dokusu gibi tüm kontaminasyonları hızla çıkarın. Daha sonra, diseksiyon ortamının PBS ile seyreltilmesini önlemek için dokuyu bir kağıt havlu üzerinde hızlı bir şekilde kurulayın ve kuru bir tabağa koyun. Sindirim ortamını ekleyin ve dokuyu küçük parçalar halinde kıyın.

Daha sonra, dokuyu sindirim ortamının geri kalanını içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpü, sindirmek için 40 ila 50 dakika boyunca sürekli çalkalama ile 37 derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Sindirimin iyi gittiğinden emin olmak ve aşırı sindirimi önlemek için her 10 ila 15 dakikada bir kontrol edin.

Doku iyice sindirildikten sonra sindirimi durdurun. Beş mililitre tam ortam ekleyerek ve iyice karıştırarak, hücreler neredeyse tamamen homojen olmalıdır. Daha sonra, numuneyi 10 dakika boyunca 700 kez G'de santrifüjleyin.

Stromal vasküler fraksiyon şimdi tüpün altında kahverengimsi bir topak olarak görünür olmalı, üstte yağlı olgun adiposit tabakasını ve sıvı tabakanın çoğunu aspire etmelidir. Daha sonra, peleti 10 mililitrede çözün, ortayı tamamlayın ve iyice karıştırın. Karıştırıldıktan sonra, 50 mililitrelik yeni bir tüpün üzerine bir hücre süzgeci yerleştirin ve hücre süspansiyonunu süzün.

Filtrelenmiş hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 10 dakika boyunca 700 kez G'de santrifüjleyin. Ardından, ortamı aspire edin ve peleti yeniden askıya alın. 10 mililitre tam orta boy pipet ve iyice karıştırın, hücreleri gerektiği gibi kaplayın.

Genel olarak, beş fare, iki adet 10 santimetrelik kasık wat plakası ve bir tabak yarasa verecektir. Kaplamadan bir veya iki saat sonra. Ortamı aspire edin, PBS ile iki kez yıkayın ve taze ortam ekleyin.

Bu adım, kırmızı kan hücrelerini, bağışıklık hücrelerini ve diğer kirleticileri ortadan kaldırabileceği için önemlidir. Bakım ve indüksiyon ortamları önceden hazırlanır. Birincil adipositler% 95 ila 97 birleşim noktasına ulaştığında, normal tam ortamı indüksiyon ortamı ile değiştirin.

48 saat sonra, ortamı 0.5 mikromolar RO glitazon içeren bakım ortamına değiştirin. Ek bir 48 saat sonra, iki ila üç gün daha bir mikromolar RO glitazon içeren taze bakım ortamına geçin. Damlacıklar, indüksiyon ortamının ilk eklenmesinden altı ila yedi gün sonra burada görüldüğü gibi, indüksiyondan yaklaşık üç ila dört gün sonra ortaya çıkacaktır.

Hücreler olgun yağ hücrelerine tamamen farklılaşmalı ve yağ damlacıkları ile doldurulmalıdır. Hücreler artık hasat edilebilir ve daha fazla analiz için kullanılabilir. Primer adipositlerin esmerleşmesi, burada görüldüğü gibi kahverengi yağa özgü veya seçici genlerin mRNA'sının Q-R-T-P-C-R ile ölçülmesiyle değerlendirilebilir.

RO glitazon, sağlam bir şekilde indüklenmiş UCP bir mRNA ekspresyonu FORSKOLIN tedavisi burada siklik A MP olarak belirtilmiştir. RO glitazonun neden olduğu UCP'nin bir ekspresyonu daha da artırıldı. ÇİA. Başka bir kahverengi yağ seçici gen de doza bağlı bir şekilde sağlam bir şekilde arttırıldı. RO glitazon tedavisi ayrıca hem kahverengi hem de beyaz yağ için FABP dört ve adipojenik belirteç ekspresyonunu arttırdı.

Bu esmerleşme etkisi sadece kendi başına adipogenezin artmasından kaynaklanmadı. UCP bir ve CDIA ekspresyonunun indüksiyonu hala önemli olduğundan, mRNA seviyeleri FABP dörtüncüsününkilere normalize edilmiş olsa bile, bu Western blot, UCP birin artmış protein seviyesini doğrular. Bu videoyu izledikten sonra, preadipositlerin nasıl izole edileceğini ve bu hücrelerin kültürde bej veya parlak hücrelere nasıl ayırt edileceğini iyi anlamış olmalısınız.