Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu + sağlayan olası Kanser Kök Hücreleri

Bu prosedürün genel amacı, malign melanomlardan hasta kaynaklı hücre kültürleri oluşturmak ve varsayılan CD 1 33 pozitif kanser kök hücrelerini izole etmektir. Bu, hücre peletinden eritrositleri tükettikten sonra önce bir tümör dokusundan primer melanom tek hücrelerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Gerekirse, birincil hücre kültürünü karakterize edin ve fibroblastları tüketin.

Son adım, CD 1 33 pozitif ve CD 1 33 negatif melanom hücrelerinin manyetik hücre sıralamasını yapmaktır. Sonuç olarak, bu optimize edilmiş maksimum prosedür, CD 1 33 pozitif ve CD 1 33 negatif hücrelerin yüksek oranda zenginleştirilmiş ve canlı popülasyonlarını elde etmek için mükemmel bir yöntemdir. Bu tekniği ilk olarak, kanser hastalarının ilaç tepkisini tahmin etmeye çalıştığımız kişiselleştirilmiş tıpta insco verilerini doğrulamak için kullandık ve bunun için ticari olarak mevcut bir hücre hattı kullanılamaz.

Tekniğin temel avantajı, malign melanomda varsayılan kanser kök hücreleri olan CD 1 33 pozitif hücrelere hızlı erişimimizin olmasıdır. Teknik, laboratuvarımdan bir laboratuvar teknisyeni olan Catherine Davis tarafından sunulacak. Ameliyattan yeni izole edilen tümör dokusunu %1 penisilin streptomisin içeren steril PBS'de doku kültürü laboratuvarına aktarın.

Tümör dokusunu steril bir petri kabına aktarın, fazla çözeltiyi aspire edin. Daha sonra 500 mikrolitre ayrışma karışımı ekleyin ve tümörü taze steril neşterler kullanarak iki ila dört milimetrelik küçük parçalar halinde kıyın. Şimdi iki ila dört gram kıyılmış tümör dokusunu beş mililitre ayrışma karışımı içeren yumuşak bir maksimum C tüpüne aktarın.

Petri kabını ek bir 4,5 mililitre ayrışma karışımı ile durulayın ve kalan doku parçalarını nazik max C tüpüne ekleyin. Tüpü kapatın, dissosiyasyonun manşonuna baş aşağı takın ve H tümör sıfır bir programını çalıştırın. Daha sonra, numuneyi en yüksek çalışma hızında sürekli dönüş altında 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Şimdi tüpü baş aşağı dissosiyasyonun manşonuna takın ve H tümör sıfır iki programını çalıştırın. Daha sonra numuneyi 12 RPM'de sürekli dönüş altında 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Ardından, nazik maksimum program H tümör sıfır üç'ü çalıştırın.

Numuneyi yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu 70 mikronluk bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir tüpe geçirin. Gerekirse, tam süspansiyon geçene kadar hücre süspansiyonunu steril bir filtre ucuyla karıştırın. Hücre süzgecini beş mililitre quantum 2 6 3 orta boy pelet ile durulayın, hücre süspansiyonunu 300 G'de beş dakika boyunca atın ve süpernatanı atın.

Hücre damakları, yüksek miktarda tikler ve yalanlar nedeniyle okunmuş gibi görünüyorsa, kırmızı kan hücreleri, eşlik eden metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi. Tümör hücrelerini kuantum 2, 6, 3'te yeniden döndürün ve bir kültür, hücreleri% 80 birleşmeye ulaştıklarında rutin olarak geçiş hücrelerini tohumlayın. Birincil hücre kültürünü bir mikroskop kullanarak fenotipik olarak analiz edin.

Daha sonra CD NA sentezini takiben RNA ekstraksiyonu için az miktarda birincil hücre kültürü toplayın ve neoplastik melanom, kök hücre ve stroma hücre işaretleyici genleri için primerlerle R-T-P-C-R gerçekleştirin. Analiz edilmesi gereken en önemli genler, fibroblast belirteci CD 90, melanom ve melanosit belirteci, kanser kök hücre belirteci CD 1 33, olgun dendritik hücreler için belirteç, CD 83 ve HPRT veya GAAP dh gibi bir temizlik genidir. Kombine mikroskobik ve R-T-P-C-R analizi, primer melanom kültüründe yüksek bir lifblast kontaminasyonu ortaya çıkarsa, anti fibroblastlar, mikroboncuklar ve LD kolonlarını kullanarak fibroblastları tüketmeye devam edin.

% 80 birleşme hücrelerini önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın, uygun miktarda Accutane ekleyin ve hücreler kültür yüzeyinden ayrılana kadar inkübe edin. Hücreleri kuantum 2 6 3 ortamında toplayın ve 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri numaralandırın, ardından gerekli sayıda hücreyi 300 G'de beş dakika ve dört ila sekiz santigrat derece santrifüjleyin.

Süpernatanı tamamen aspire edin ve yeniden canlandırın. Maksimum 350 mikrolitre tamponda sekizinci hücrelere 10 kata kadar askıya alın, 100 mikrolitre FCR bloke edici reaktif ve 50 mikrolitre CD 1 33 ekleyin. Bir biyotin.

İyice karıştırın ve dört santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Hücreleri maksimum 10 mililitre tamponla yıkayın, ardından 300 G'de beş dakika ve dört ila sekiz santigrat derece santrifüjleyin. İkinci bir yıkamadan sonra süpernatanı tamamen aspire edin.

Hücre peletini 400 mikrolitre maksimum tamponda yeniden süspanse edin. 100 mikrolitre anti biyotin mikro boncuk ekleyin ve iyice karıştırın, dört ila sekiz santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Bu arada, maksimum ayırıcıyı manyetik ayırma için hazırlamak için, quadro max'ı maksimum ayırıcı çoklu standına takın.

Gerekli sayıda LS sütununu, sütun kanatları ile quadro'nun manyetik alanında öne doğru yerleştirin. Her LS sütununa bir pres ayırma filtresi ve uygun bir toplama tüpü yerleştirin. Her sütunun altında, filtreyi ve sütunu maksimum üç mililitre tamponla durulayın ve akışı atın.

Hücreleri daha önce tarif edildiği gibi maksimum tamponda yıkadıktan sonra, hücreleri maksimum 500 mikrolitre tamponda yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu hazırlanan LS kolonuna uygulayın. Sütun başına maksimum üç mililitre tampon ile üç kez yıkayın. Etiketlenmemiş cd 1 33 negatif hücre fraksiyonunun toplam zenginliğini toplayın.

Ardından, pres ayırma filtresini atın. Sütunu ayırıcıdan çıkarın ve uygun bir toplama tüpüne yerleştirin. Maksimum beş mililitre tampon uygulayın.

Negatif fraksiyonun saflığını artırmak için pistonu kolona sıkıca iterek etiketli CD 1 33 pozitif hücrelerini hemen yıkayın. Hücre süspansiyonunu yeni bir dengelenmiş LS kolonuna uygulayın ve atık CD 1 33 negatif fraksiyonunu toplayın. Bu rezeke edilen lenf nodu metastazı geç evre melanomlu bir hastadan elde edildi.

Dokunun mekanik ve enzimatik ayrışmasından sonra, filtrelenmiş hücrelerin peleti eritrositlerle yüksek bir kontaminasyon içeriyordu. Daha sonra, kırmızı kan hücrelerinin tükenmesi, açık kahverengi renkli bir hücre peleti ile sonuçlandı. Bu hücreler burada kuantum 2 6 3 ortamında, melanosit ve melanomun bir R-T-P-C-R olanı, fibroblast, dendritik ve kök hücre markörü ile kültürlendi.

Genler, hücrelerin çevredeki stromadan değil, tümörden kaynaklandığını doğrulamak için kullanılır. Erişkin melanositler, gözyaşı için normal kontrol hücreleri ve embriyonik karsinom hücre hattı N-C-C-I-T, kök hücre belirteci CD 1, 33 için pozitif kontrol olarak görev yaptı. Bu veriler, bazı birincil hücrelerin gerçekten gözyaşı için pozitif olduğunu ve bu nedenle melanositik kökenli olduğunu ortaya koymaktadır.

Kültür, olgun dendritik hücrelerin belirteci olan CD 83 için de negatiftir. İlginç bir şekilde, bu melanom hücre hattı, asimetrik hücre bölünmesi için çok önemli bir gen olan CD 1 33'ü ve bilinen bir kanser kök hücre belirtecini eksprese eder. Burada, fibroblast tükenmesi tedavisinden sonra fibroblastlarla yüksek oranda kontamine olmuş bir primer hücre kültürünün parlak alan mikrografı gösterilmiştir, kültürler primer melanom hücrelerini temsil eder.

Primer melanom hücreleri CD 1 33 pozitif ve CD 1 33 negatif hücreler olarak ayrıldı. İmmünofloresan, boyama ve western blot analizinden elde edilen bu veriler, yüksek sıralama etkinliği ve saflığını göstermektedir. Yaklaşımın kişiselleştirilmiş tıp için büyük etkileri vardır, çünkü artık her hastanın ilaç yanıtını ayrı ayrı daha iyi tahmin etmek için hastadan türetilen dokuları ve hücreleri kullanabiliriz.

Bu yöntem, tümör nereden kaynaklanıyor gibi temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olacaktır. Hastalar nasıl tedavi edilebilir? Ve deneylerini doğrulayarak sistem biyolojisi yaklaşımlarını daha iyi yeniden tanımlamaya yardımcı olacaktır.