Name: Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu + sağlayan olası Kanser Kök Hücreleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Öğrenin, melanom dokusundan hasta kaynaklı hücre kültürleri hazırlama ve MACS ile CD133+ kanser kök hücreleri izolasyonu yöntemini. Bu teknik, kişiselleştirilmiş tıp için ilaç yanıtı tahminlerini doğrulamada değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar bu işi desteklemek ve eleştirel bir yazının okunması için M. Dietel ve Dirk Schumacher ederim. Bu sonuçlara yol açan araştırma hibe anlaşması n altında Yenilikçi İlaçlar Girişimi Ortak Taahhüt ° 115234, Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) ve EFPIA şirketlerin &#39;in mali katkı oluşmaktadır hangi kaynaklardan destek aldı Ayni katkı. Bu çalışma aynı zamanda Berliner Krebsgesellschaft (BKG) tarafından desteklenmiştir.

Birincil hücre kültürü, fibroblast tükenmesi ve CD133 manyetik hücre sıralama tümör dokusu, karakterizasyonu ikinci birincil tek hücrelerin hazırlanmasını da içeren deney genel düzeni + ve CD133 - melanom hücrelerinin Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. 1. Örnek Toplama <ol><li> Sonraki adımlar dikkate alınarak önce etik kurul onayı için kontrol edin. </li><li> Steril PBS cerrahi OR ekibine% 1 Penisilin-Streptomisin final konsantrasyon ve el ile desteklenmiş bir 50 ml tüp hazırlayın. </li><li> 4 ° C&#39;de cerrahi hücre kültürü laboratuarına tümör dokusunun hızlı ulaşım Organize </li></ol> 2. Tümör Dokusu Primer Melanom Tek hücre hazırlanması <ol><li> Steril koşullar altında tüm adımları uygulayın. </li><li> Tümör rezeksiyonu önce, bir ayrışma karışımı hazırlamak gerekmektedir. 2-4 g doku başına 10 ml ayrışma karışımı gereklidir. Karışım immedia kullanılabilirlarına ya da daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C&#39;de 10 ml alikots içinde saklanmıştır. <ol><li> 150 mM sodyum klorid içeren bir çözelti hazırlayın. Çözümü netleşene kadar bir girdap kullanarak karıştırın. Eğer bir 0.22 um filtre kullanılarak steril gerekli-Süzülen madde sodyum klorür çözeltisi. </li><li> DNaz I tartılır ve 10 mg / 150mm sodyum klorür ml DNaz I içeren bir solüsyon hazırlanır. Çözümü netleşene kadar alt üst edilerek karıştırılır. </li><li> PBS içinde 100mg/ml Kollajenaz IV içeren bir solüsyon hazırlayın. Çözümü netleşene kadar alt üst edilerek karıştırılır. Kolajenaz çözeltisi alikotlar birkaç ay boyunca -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> % 1 Penisilin-Streptomisin, 1 mg / ml kollajenaz IV, ve 0.1 mg / Quantum 263 orta ml DNase I, bir son konsantrasyon ile ayrışma karışım hazırlayın. Bir girdap kullanarak karıştırın. İsteğe: 1.5 ug / ml amfoterisin B&#39;nin bir nihai konsantrasyon için ayrışma karışımına ekleyin cilt amfoterisin B çözeltisi elde edilen melanom doku kullanıldığında </li></ol></li><li> Pre-sıcak req37 disosiyasyon karışımı, PBS ve Kuantum 263 orta uired miktarda ° C. </li><li> Steril bir Petri kabı yerleştirin tümör dokusu. Doku aşırı çözüm aspire ve 500 ul dissosiyasyon karışımı ekleyin. Taze, steril neşter kullanılarak 2-4 mm küçük parçalar halinde doğrayın tümörü. </li><li> Transferi 2-4 gr 5 ml dissosiasyon karışımını içeren GentleMACS C Tüp içine tümör dokusu kıyılmış. Ek 4.5 ml disosiyasyon karışımı ile Petri durulayın ve GentleMACS C Tüp kalan doku parçaları ekleyin. </li><li> GentleMACS C tüpü kapatın ve GentleMACS Dissociator bir kol üzerine ters takın. GentleMACS programı &quot;h_tumor_01&quot; çalıştırın. </li><li> Dissociator gelen GentleMACS C tüpü ayırın ve 37 az 30 dakika örnek inkübe ° C yerleşti dokusu parçalanmakta süspansiyonu her 5 dk yüksek çalışma hızı (12 rpm) veya manuel olarak tüp çevirerek MACSmix Tüp Rotator kullanarak sürekli rotasyon altında . </li><li> T kol üzerine baş aşağı GentleMACS C boru takınO GentleMACS Dissociator ve GentleMACS programı &quot;h_tumor_02&quot; çalıştırın. </li><li> Dissociator gelen GentleMACS C tüpü ayırın ve 37 az 30 dakika örnek inkübe ° C yerleşti dokusu parçalanmakta süspansiyonu her 5 dk yüksek çalışma hızı (12 rpm) veya manuel olarak tüp çevirerek MACSmix Tüp Rotator kullanarak sürekli rotasyon altında . </li><li> GentleMACS Dissociator bir kol üzerine baş aşağı GentleMACS C tüpü takın ve GentleMACS programı &quot;h_tumor_03&quot; çalıştırın. </li><li> Dissociator, tekrar süspansiyon örnek GentleMACS C tüp ayırın ve bir 50 ml tüp üzerine yerleştirilmiş bir 70 mikron hücre süzgeci için hücre süspansiyonu uygulanır. Filtrenin tıkanma oluşursa komple süspansiyon koştu kadar steril bir filtre ucu ile hücre süspansiyonu karıştırın. </li><li> 5 ml Kuantum 263 orta hücre süzgecinden durulayın. </li><li> İsteğe bağlı: Eğer hala Kuantum 263 orta ve uygun bir hücre kültürü dis tohum onları filtre, tekrar süspansiyon parçaları kalan doku parçaları varsah. 37 parça inkübe ° C ve% 5 CO2. </li><li> Hücre süzgecinden atın ve sindirilmiş hücre süspansiyonu ile 50 ml tüp kapatın. 300 x g&#39;de 5 dakika süreyle hücre süspansiyonu santrifüjleyin ve supernatant atın. </li><li> İsteğe bağlı: hücre pelletini nedeniyle eritrositler 500 ul PBS çift damıtık su, tekrar süspansiyon hücre pelletini 10x çözümü 01:10 sulandırarak 1x Kırmızı Kan Hücresi Lizis Çözüm hazırlamak yüksek miktarda ve 5 ml 1x Kırmızı Kan Hücresi Lizis ekleyebilir, kırmızı görünüyorsa Çözüm. 10 dk için oda sıcaklığında Vortex 5 saniye ile inkübe edin. 300 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjleyin ve supernatant atın. </li><li> Quantum 263 ve tohum uygun hücre kültürü şişesi içinde hücreleri ile tümör hücrelerinin yeniden süspanse edin. 37 Kültür tümör hücrelerinin ° C ve% 5 CO2 ve% 80 izdiham ulaşmak rutin olarak geçit hücreleri. </li></ol> 3. Primer Hücre Kültürü ve Fibroblast tükenmesi Karakterizasyonu <ol><li> Fenotipik bir microsco kullanılarak primer hücre kültürü analizpe. </li><li> Primer hücre kültürü küçük bir miktar (0.5x 10 6 hücre) Hasat ve neoplastik-, melanom-, kök hücre ve stroma hücre işaretleyici genler için primerler ile RT-PCR işlemi gerçekleştirmek. Analiz etmek için en önemli genler CD90 (fibroblast işaretleyici), TYR (melanom / melanosit işaretleyici), CD133 (kanser kök hücre belirteci), CD83 (olgun dendritik hücreler için marker) ve bir temizlik gen (örn. HPRT ya GAPDH) vardır. </li><li> RT-PCR sırasında mikroskopik analizi ve CD90 yüksek ifade fibroblast ile primer melanom kültürünün yüksek kontaminasyon saptandı varsa, Miltenyi gelen Anti-Fibroblastlar microbeads ve D sütunları kullanarak fibroblastlar tüketmek gerekir. </li></ol> 4. Manyetik Hücre CD133 arasında Ayırma + ve CD133 - LS sütunlar kullanma Melanom Hücreleri <ol><li> PBS içinde 2 mM EDTA,% 5 FCS ihtiva eden tampon MACS hazırlayın. 0.22 mikron Steritop-GP Filtre Ünitesi kullanarak eviren ve steril-süzüntü tampon ile karıştırın. 4-8 ° C Hissedilen tamponKullanmadan önce ve degas. </li><li> 37 Pre-sıcak Accutase, PBS ve Kuantum 263 orta ° C. </li><li> PBS ile 80% konfluent hücreleri yıkayın. Accutase uygun miktarda ekleyin ve hücrelerin kültür yüzeyden koparak kadar inkübe edin. Quantum 263 ortamı kullanılarak bir 50 ml tüp içinde hücreler toplayın. </li><li> Hücre sayısı belirleyin ve az 5 dakika boyunca hücrelerinin gerekli sayıda (2x 10 9 hücrelerin azami sayıda LS Sütun başına yüklenmiş olabilir. Hücre hattı belirli optimum numaralarını tespit edilmeli ve oldukça düşük olabilir Miltenyi protokolüne göre.) Santrifüj 300 xg ve 4-8 ° C&#39;de Tamamen süpernatant aspire. </li><li> 350 ul MACS tamponu ile 1x 10 8 hücre azami (yüksek hücre numaraları buna göre aşağıdaki tüm MACS tamponu büyütmek, FCR Engelleme Reaktif, CD133/1-Biotin ve anti-Biotin microbeads birimler için) tekrar. </li><li> 100 ul FCR Engelleme Reaktif ekleyin. </li><li> 50 ul CD133/1-Biotin ekleyin. 4-8 bir vorteks ve inkübe kullanarak iyice karıştırın ° C fya da 10 dk. </li><li> 300 xg ve 4-8 ° C sıcaklıkta 5 dk için 10 ml MACS tampon ve santrifüj ekleyerek yıkayın hücrelerini Tamamen süpernatant aspire. </li><li> Yıkama adımı (4.8) tekrarlayın </li><li> 400 ul MACS tamponu ile tekrar süspansiyon hücre pelletini. </li><li> 100 ul anti-biotin mikro-küreler ekleyin. 15 dakika boyunca 4-8 ° C&#39;de bir vorteks ve inkübe kullanarak iyice karıştırın. </li><li> Bu arada, manyetik ayırma için MACS ayırıcı hazırlamak. MACS Ayırıcı Çoklu Stand QuadroMACS takın. QuadroMACS bir manyetik alanda ön sütun kanatlarıyla LS sütun gerekli sayıda yerleştirin. Her sütun altında her bir LS kolon ve uygun bir toplama tüpü (15 ml, 50 ml) içine bir ön ayırma filtresi (30 um Naylon filtre) yerleştirin. 3 ml MACS tamponu ile durulama filtre ve sütun hazırlayın. Flow-through atın. </li><li> 300 xg ve 4-8 ° C sıcaklıkta 5 dk için 10 ml MACS tampon ve santrifüj ekleyerek yıkayın hücrelerini Tamamen süpernatant aspire. </li><li> 500 ul hücreler süspanseMACS Pre-Ayırma Filtre ile LS kolona hücre süspansiyonu tampon ve uygulamak. </li><li> Sütun başına 3 ml MACS tamponu ile üç kez yıkayın. Sütun haznesi boşaldığında Sadece yeni bir tampon ekleyin. </li><li> Hücre fraksiyonu - toplanan toplam atık etiketsiz CD133 içerir. </li><li> Pre-Ayırma Filtre atın, ayırıcı gelen sütunu kaldırmak ve uygun bir toplama tüpü üzerine yerleştirin. </li><li> 5 ml MACS tamponu uygulayın. Hemen sıkıca sütuna pistonu iterek etiketli CD133 + hücreler dışarı floş. </li><li> Negatif fraksiyonunun saflığı arttırmak için, QuadroMACS yerleştirilen yeni bir LS dengelenmiş sütun üzerine hücre süspansiyonu uygulanır. Fraksiyon - atık CD133 içerir. </li><li> Sütunlar atın. </li></ol>

<ol><li>Garibyan, L., Fisher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+sunlight+causes+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Oncol.+Rep%22%5BJournal%5D)">How sunlight causes melanoma.</a> Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).</li>
<li>Radovic-Kovacevic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+analysis+in+patients+with+cutaneous+malignant+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Srp.+Arh.+Celok.+Lek%22%5BJournal%5D)">Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma.</a> Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).</li>
<li>Lens, M. B., Eisen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+chemotherapy+in+the+treatment+of+malignant+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Systemic chemotherapy in the treatment of malignant melanoma.</a> Expert Opin. Pharmacother. 4, 2205-2211 (2003).</li>
<li>Nashan, D., Muller, M. L., Grabbe, S., Wustlich, S., Enk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+therapy+of+disseminated+malignant+melanoma%3A+an+evidence-based+overview+of+the+state-of-the-art+in+daily+routine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Eur.+Acad.+Dermatol.+Venereol%22%5BJournal%5D)">Systemic therapy of disseminated malignant melanoma: an evidence-based overview of the state-of-the-art in daily routine.</a> J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 21, 1305-1318 (2007).</li>
<li>Eigentler, T. K., Meier, F., Keilholz, U., Hauschild, A., Garbe, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEigentler%2C+TK+%22Der+Onkologe%22">Der Onkologe</a>. 16, Springer-Verlag. 1160-1166 (2010).</li>
<li>Keilholz, U., Tilgen, W., Hohenberger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemische+Therapie+des+metastasierten+Melanoms%3A+Ergebnisse+randomisierter+Studien+der+letzten+zehn+Jahre%5BTitle%5D)+AND+%22Deutsches+%C3%84rzteblatt%22%5BJournal%5D)">Systemische Therapie des metastasierten Melanoms: Ergebnisse randomisierter Studien der letzten zehn Jahre.</a> Deutsches Ärzteblatt. 100, (2003).</li>
<li>Chapman, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+with+vemurafenib+in+melanoma+with+BRAF+V600E+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation.</a> N. Engl. J. Med. 364, 2507-2516 (2011).</li>
<li>Burdall, S. E., Hanby, A. M., Lansdown, M. R., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+cell+lines%3A+friend+or+foe%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+%3A+BCR%22%5BJournal%5D)">Breast cancer cell lines: friend or foe.</a> Breast Cancer Research : BCR. 5, 89-95 (2003).</li>
<li>Osborne, C. K., Hobbs, K., Trent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+differences+among+MCF-7+human+breast+cancer+cell+lines+from+different+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Biological differences among MCF-7 human breast cancer cell lines from different laboratories.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 9, 111-121 (1987).</li>
<li>Hiorns, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+RNA+expression+and+genomic+DNA+content+acquired+during+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Variation in RNA expression and genomic DNA content acquired during cell culture.</a> Br. J. Cancer. 90, 476-482 (2004).</li>
<li>Nelson-Rees, W. A., Daniels, D. W., Flandermeyer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-contamination+of+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cross-contamination of cells in culture.</a> Science. 212, 446-452 (1981).</li>
<li>MacLeod, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+intraspecies+cross-contamination+of+human+tumor+cell+lines+arising+at+source%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source.</a> Int. J. Cancer. 83, 555-563 (1999).</li>
<li>Masters, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cancer+cell+lines%3A+fact+and+fantasy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human cancer cell lines: fact and fantasy.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 233-236 (2000).</li>
<li>Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Single-Cell+Suspensions+from+Mouse+Neural+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue.</a> J. Vis. Exp. (29), e1267(2009).</li>
<li>Zabierowski, S. E., Fukunaga-Kalabis, M., Li, L., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dermis-derived+stem+cells%3A+a+source+of+epidermal+melanocytes+and+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">Dermis-derived stem cells: a source of epidermal melanocytes and melanoma.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 24, 422-429 (2011).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li>
<li>Ieta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+genetic+characteristics+of+tumor-initiating+cells+in+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Biological and genetic characteristics of tumor-initiating cells in colon cancer.</a> Ann. Surg. Oncol. 15, 638-648 (2008).</li>
<li>Bertolini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+tumorigenic+lung+cancer+CD133%2B+cells+display+stem-like+features+and+are+spared+by+cisplatin+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16281-16286 (2009).</li>
<li>Monzani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoma+contains+CD133+and+ABCG2+positive+cells+with+enhanced+tumourigenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential.</a> Eur. J. Cancer. 43, 935-946 (2007).</li>
<li>Gedye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer%2Ftestis+antigens+can+be+immunological+targets+in+clonogenic+CD133%2B+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy+%3A+CII%22%5BJournal%5D)">Cancer/testis antigens can be immunological targets in clonogenic CD133+ melanoma cells.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy : CII. 58, 1635-1646 (2009).</li>
<li>Kobari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2B+cell+selection+is+an+alternative+to+CD34%2B+cell+selection+for+ex+vivo+expansion+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hematother.+Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">CD133+ cell selection is an alternative to CD34+ cell selection for ex vivo expansion of hematopoietic stem cells.</a> J. Hematother. Stem Cell Res. 10, 273-281 (2001).</li>
<li>Quirici, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+expansion+of+endothelial+cells+from+human+bone+marrow+CD133%28%2B%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133(+) cells.</a> Br. J. Haematol. 115, 186-194 (2001).</li>
<li>Pfenninger, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133+is+not+present+on+neurogenic+astrocytes+in+the+adult+subventricular+zone%2C+but+on+embryonic+neural+stem+cells%2C+ependymal+cells%2C+and+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells.</a> Cancer Res. 67, 5727-5736 (2007).</li>
<li>Dubreuil, V., Marzesco, A. M., Corbeil, D., Huttner, W. B., Wilsch-Brauninger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbody+and+primary+cilium+of+neural+progenitors+release+extracellular+membrane+particles+enriched+in+the+stem+cell+marker+prominin-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Midbody and primary cilium of neural progenitors release extracellular membrane particles enriched in the stem cell marker prominin-1.</a> J. Cell Biol. 176, 483-495 (2007).</li>
<li>Florek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+neural+and+hematopoietic+stem+cell+marker%2C+is+expressed+in+adult+human+differentiated+cells+and+certain+types+of+kidney+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">a neural and hematopoietic stem cell marker, is expressed in adult human differentiated cells and certain types of kidney cancer.</a> Cell Tissue Res. 319, 15-26 (2005).</li>
<li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD4%2B+T+cells+from+Mouse+Lymph+Nodes+Using+Miltenyi+MACS+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification.</a> J. Vis. Exp. (9), e409(2007).</li>
<li>Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Immune+Cells+from+Primary+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Immune Cells from Primary Tumors.</a> J. Vis. Exp. (64), e3952(2012).</li>
<li>Mollamohammadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+cryopreservation+method+for+feeder-free+dissociated+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient cryopreservation method for feeder-free dissociated human induced pluripotent stem cells and human embryonic stem cells.</a> Hum. Reprod. 24, 2468-2476 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Tümör hücre pelet eritrosit kontaminasyonu kaldırmak için biz son derece Miltenyi gelen kırmızı kan hücre lizis çözüm kullanmanızı öneririz. Geleneksel Ficoll yoğunluk gradyan santrifüj üzerine eritrositlerin parçalayıcı avantajları, daha hızlı ve daha basit olmasıdır. Ayrıca, Ficoll ve kırmızı kan hücreleri ve tümör hücreleri kaybı ile kirlilikler önlenir. Çok uzun beklerken normalde tümör hücrelerinin Overgrow beri primer hücre kültürü fibroblastların büyümesini gözlemlemek zaman onlar derhal çıkarılmalıdır. <p cl...

Kutanöz malign melanom cilt kanseri en sık görülen, ama en ölümcül türüdür. Artan bir insidans, ölümleri 1,2 ilişkili malign deri tümörlerinin% 75 malignite ve hızlı yayılması bir yüksek dereceli, şimdi melanomlar hesabı nedeniyle. Primer tümör, kemoterapi, radyoterapi, immünoterapi ve metastas melanom kombine kemoterapi ve immünoterapi cerrahi eksizyon yanında melanom tedavisinde 3,4 için state-of-the-art stratejilerdir. Ancak, malign melanom kemoterapötiklerin zayıf yanıt (% 5-12) 5,6 ve Hazır vemurafenib 7 ile tedavi gibi yeni hedefli tedaviler vadeden BRAF V600E gen mutasyonunun yararı taşıyan melanom hastalarının yalnızca% 50-70 ile karakterizedir sağkalımı, melanom Tümörgenez mekanizmaların daha iyi anlaşılması gereklidir. Geçmişte, köklü ticari bu mekanizmaların incelenmesilikle mevcut hücre çizgileri kullanıldı. Kanser başlangıcı ve ilerlemesindeki moleküler olayları incelemek için daha yeni yaklaşımlar tümör dokusunun doğrudan elde primer kültürlerinde kullanmak - bir strateji rulman manifoldu faydaları: araştırmacı hasta ve doku seçimi üzerinde tam denetime sahiptir. Örneklenen hücreler ustaca seçilen tümör dokusu elde, tüm heterojenite ile tümörü andıran ve takip hastanın verileri ve ayrıntılı patoloji kültürünün özelliklerini orijinal tümör 8 ile karşılaştırıldı izin vermek için kullanılabilir. Buna karşılık, kanser araştırma ilgili model sistem olarak oluşturulmuş hücre hattını kullanmak tartışılmaktadır. Zaten 1987 yılında Osborne ve arkadaşları farklı laboratuvarlarda 9 MCF-7 insan meme kanseri hücre hatları arasında önemli biyolojik farklılıklar açıklanmıştır. Altkültür sırasında RNA ekspresyonunda Bu geniş genomik kararsızlık ve değişkenlik işbirliği olduHiorns ark nfirmed. ve hücre hatları böylece insan kanser 10 modelleri gibi kurulan kültürlerin doğrudan alaka zayıflaması, kültür gelişmeye emin delil destekleyici veriler sağladı. Büyük ölçüde yıllar boyunca ihmal edilen bir diğer önemli göz, hücre hatları çok sayıda HeLa ile kirlenmiş olduğunu ilk göstererek yirmi yıl önce çizildi ilgisiz &#39;false&#39; hücreleri ile kültürlerin kontaminasyon veya büyümesi riski olduğunu hücreleri 8,11. &#39;Yanlış&#39; hücre hatları verilerin yanlış yorumlanmasına son zamanlarda tekrar literatürde açık olarak ortaya çıkmıştır. DNA profili ve moleküler sitogenetik bir arada kullanarak, McLeod ve ark. 252 yeni tümör türevli insan hücre hatları, Mikroorganizmalar ve Hücre Kültürleri (DSMZ), Alman Collection tevdi yaklaşık% 18 oranında intraspecies olduğu bulunmuştur ya da çapraz türler arası olduğunu göstermiştir -kirletici 12,13. Bu sorunları önlemek için ve yukarıda belirtilen avantajlardan yararlanmak için, biz yeni eksize metastaz düşük-geçiş melanom hücre hatları kurmaya karar verdi. Sağlam hücre ayırma ve analiz teknolojileri eşzamanlı karakteristik yüzey proteinleri hücre ölüm ve yıkım sınırlayan ise tek hücreli preparatlar elde edilecek gerektirir. Tek hücre süspansiyonları içine dokuların otomatik ayrışma için benchtop enstrüman Miltenyi tarafından imal GentleMACS Dissociator olduğunu. Antijen epitoplarının korunması ve hücre kaybını azaltma süre GentleMACS C tüp ve optimize edilmiş ayrışma çözeltiler, kapalı bir sistem içerisinde tümör dokusunda etkili ve yumuşak bir ayrılma ile kombinasyon halinde kullanıldığı zaman elde edilir. Enstrüman özel uygulamalar ve teminatlar melanom dokusunun 14 tek hücre süspansiyonları standardize hazırlık çeşitli için optimize edilmiş, önceden ayarlanmış programları sunmaktadır. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; tümörlerin çoğunluğu sadece tümör başlatılması ve kapasite kendini yenileyen sergilerler denilen kanser kök hücreleri (rulmanları), küçük bir subpopülasyonu liman ortaya çıkanlar raporlar. Derinin dermis melanosit üreten kök hücrelerinin tanımlanması UVA ışınlarına maruz malign transformasyon 15 için bu hücreleri hazırlamak çünkü bu hücrelerin melanom kanser kök hücreleri (rulmanları) kökeni olabileceği hipotezini doğurmuştur. Bu tür bir genetik lezyon sonucu, tümör ve kök hücre özelliklerinin bir kombinasyonu liman hücreler olacaktır. Melanom rulmanları ve alt sınıfı için önerilen anahtar belirteçlerin biri CD133 16-20 olduğunu. CD133 (ayrıca Prominin 1 olarak da bilinir), pentaspan transmembran glikoproteinler üyesi, hematopoetik kök hücreler, endotelyal progenitör hücreleri, nöronal ve glial kök hücreleri 21-23 olarak ifade edilir. CD133 ekspresyonu ile korelasyonasimetrik hücre bölünmesi 24, ve CD133 ve glikosilatlı epitop 25 hücre farklılaşması üzerine aşağı regüle olduğu gösterilmiştir. Son zamanlarda, CD133 + melanom hücrelerinin kendini yenileme ve tümör-inisiyasyon kapasitesi 19,20 olduğu gösterilmiştir. CD133 + olası melanom rulmanları fonksiyonunu incelemek için, değiştirilmiş ve CD133 yüksek derecede zenginleştirilmiş ve canlı popülasyonları + ve CD133 elde Miltenyi Biotech gelen Manyetik-Aktif Hücre Ayırma (MACS) sistemi optimize - hücreleri. Matheu ark gösterildiği gibi Manyetik boncuk tabanlı hücre ayırma ya negatif seçim için izin verir. 26 veya pozitif seleksiyon Burada göstereceğimiz gibi. Pozitif seçimi sırasında özellikle hedef hücre tipi, örneğin CD133 eksprese eden hücrelerin, manyetik bir karşı yüksek düzeyde özgül antikorlarla konjuge olan microbeads, 50-nm Süperparamanyetik parçacıkları ile etiketlenmiştirözel hücre yüzeyi antijenine. Etiketsiz hücreleri akmasına ise ayrılık sırasında, manyetik etiketli hücreleri, ayırıcı manyetik alanında sütun içinde korunur. Yıkama adımları takiben, sütun ayırıcı manyetik alan kaldırılır ve hedef hücrelerin sütundan elüt edilmiştir. LS veya MS sütunları yüksek saflıkta etiketli ve etiketsiz hücre fraksiyonları pozitif seleksiyon sonucu sırasında kullanılır. Diğer taraftan, negatif seleksiyon için kullanılan LD kolonlar, etiketli fraksiyonunun biraz daha düşük bir saflık ile sonuçlanır. Bunların matris ambalaj yoğun olması nedeniyle bu sütunlarda debi sütununda tuzağa, etiketsiz hücrelerin daha yüksek bir risk düşük sonuç olduğunu. LD sütunları nedenle istenmeyen bir hücrenin alt populasyonun sıkı tükenmesi için kullanılmalıdır. Pozitif seçim incubatio aşağıdaki mikro-küreler ile doğrudan (mikro-küreler bağlanmış antikor) veya dolaylı manyetik etiketleme (kuluçka ile gerçekleştirilebilirN birincil antikor ile birlikte). Spesifik MACS mikro-küreler ya da prostat melanom 27 gibi primer tümör hücrelerinin çok sayıda hücre tiplerinin pozitif seçim için kullanılabilir.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reaktif </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> L11-007 </td><td></td></tr><tr><td> Amfoterisin B çözeltisi 250 ug / mL deiyonize su içinde </td><td> Sigma-Aldrich Inc </td><td> A2942-50ml </td><td></td></tr><tr><td> Anti-fibroblastlar mikro-küreler </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-050-601 </td><td></td></tr><tr><td> CD133 / 1 (W6B3C1) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-092-395 </td><td></td></tr><tr><td> Kollajenaz IV </td><td> Sigma-Aldrich Inc </td><td> C5138 </td><td></td></tr><tr><td> DNaz I </td><td> Applichem GmbH </td><td> A3778.0050 </td><td></td></tr><tr><td> Ca, Mg olmadan D-PBS </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> H15-002 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat (EDTA), </td><td> Sigma-Aldrich Inc </td><td> E-7889 </td><td></td></tr><tr><td> FBS Üstün </td><td> Biochrom </td><td> S0615 </td><td></td></tr><tr><td> Dolaylı CD133 Mikro-Boncuk Kiti insan </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-091-895 </td><td> Kapsar: CD133 / 1 (AC133)-Biotin, anti-Biotin microbeads ve FCR Engelleme Reaktif </td></tr><tr><td> Penisilin-Streptomisin, sıvı (100x) </td><td> Invitrogen GmbH </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Kuantum 263 </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> U15-815 </td><td></td></tr><tr><td> Kırmızı Kan Hücre Lizis Solüsyonu (10x) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-094-183 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ekipman </td></tr><tr> &lt;td&gt; Hücre süzgeci (70 mikron) </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> GentleMACS C Tüpler </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> GentleMACS Dissociator </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> MACS Ayırıcı Multi Standı </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-042-303 </td><td></td></tr><tr><td> MACS Ayırma Sütunlar 25 LS Sütunlar </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> MACSmix Tüp Rotator </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-090-753 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> Merck KGaA </td><td> 567440-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Pre-Ayırma Filtreler </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-041-407 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> QuadroMACS Ayırıcı </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-090-976 </td><td></td></tr><tr><td> Rotilabo-şırınga filtreleri (0.22 mikron, PES) </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> P668.1 </td><td></td></tr><tr><td> Steritop-GP Filtre Birimin&#39;den 500 ml </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> SCGPS05RE </td><td></td></tr></tbody></table>

hasta türetilen hücre kültürü ve cd133 İzolasyonu<sup&gt; +</supmelanom dan&gt; sağlayan olası kanser kök hücreleri

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Mevcut melanom bugün için daha iyi tedaviler seçenekleri rağmen, ileri malign melanom hastalarında hala progresyonsuz ve genel sağkalım için kötü bir prognoza sahiptir. Bu nedenle, translasyonel araştırma malign melanom için hedefli tedaviler geliştirmek için ileri moleküler kanıtlar sağlaması gerekir. Melanom ile ilgili geçmişte, onkojenik mekanizmalar yoğun yerleşik hücre hatları çalışıldı. Bireysel genetik profillerine dayalı daha kişiselleştirilmiş tedavi rejimleri için yolda, biz hasta türevi hücre hatları yerine jenerik hücre hatları kullanmayı öneriyoruz. Birlikte özellikle hasta takibi üzerine yüksek kalitede klinik verilerle birlikte, bu hücreler daha melanoma ilerleme arkasında moleküler mekanizmaları anlamak için vesile olacaktır. Burada disseke taze tümör dokusu primer melanom kültürlere kurulması rapor. Bu işlem, tek bir hücre içine kıyma ve doku ayrışma, yeniden içerireritrositler ve fibroblastlar gibi primer kültür ve hücrelerin melanom kökenli güvenilir doğrulama ile kontaminasyonların moval. Son raporlar ortaya koydu melanomlar, tümörlerin çoğunluğu gibi, limana sadece metastatik devlete karşı tümör gelişimini ve ilerlemesini yakıt gibi kanser kök hücreleri (rulmanları), küçük bir subpopülasyonu. Melanom CSC kimlik ve izolasyon için önemli belirteçler biri CD133 olduğunu. Primer melanom kültürlere ait CD133 + rulmanları yalıtmak için, değiştirilmiş ve Manyetik-Aktif Hücre yüksek sıralama saflıkta sonuçlanan Miltenyi gelen Sıralama (MACS) prosedürü ve CD133 + rulmanları ve CD133 canlılığı optimize - dökme, ekili ve fonksiyonel analiz edilebilir bundan sonra.

Tümör dokusu tek-hücrelerinin hazırlanması Şekil 2 (A) ve (B) mekanik ayrışma sonra 2-4 mm parçalar halinde önce bir geç evre melanom hastasının rezeke lenf nodu metastazı örneğidir. Bir 70 mikron naylon ağ gözünden doku ve süzme enzimatik ayrılma sonrasında, hücreler peletlenmiş ve süpernatan atılır. Bu aşamada biz Şekil 2C hücre pelet kırmızımsı bir renk ile belirtilen eritrositler ile yüksek kirlilik gözlenmiştir. Daha sonra, biz açık kahverengi renk <strong...

Bu makale, birincil hücre kültürleri ve nasıl tümör hücrelerinden eritrositler ve fibroblastların kirlilikler çıkarmak için taze olarak elde edilen melanom doku hazırlanmasını tarif etmektedir. Son olarak, biz nasıl tarif CD133<sup&gt; +</sup&gt; Farzedilen melanom kök hücreler CD133 doğru sıralanır<sup&gt; -</sup&gt; Manyetik Aktif Hücre Ayırma (MACS) kullanarak toplu.

Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu<sup&gt; +</supMelanom dan&gt; sağlayan olası Kanser Kök Hücreleri

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Bu prosedürün genel amacı, malign melanomlardan hasta türevli hücre kültürleri oluşturmak ve putative CD 1 33 pozitif kanser kök hücrelerini izole etmektir. Bu işlem, öncelikle hücre peletinden eritrositler uzaklaştırıldıktan sonra bir tümör dokusundan primer melanoma tekil hücreleri hazırlanarak gerçekleştirilir. Gerekirse, primer hücre kültürü karakterize edilir ve fibroblastlar uzaklaştırılır.Son adım, CD 1 33 pozitif ve CD 1 33 negatif melanoma hücrelerinin manyetik hücre ayırmasını gerçekleştirmektir. Nihayetinde, bu optimize edilmiş max prosedürü, yüksek derecede zenginleştirilmiş ve canlı CD 1 33 pozitif ve CD 1 33 negatif hücre popülasyonları elde etmek için mükemmel bir yöntemdir. Bu tekniği ilk olarak, kanser hastalarının ilaç yanıtını öngörmeye çalıştığımız ve bu amaçla ticari olarak mevcut hiçbir hücre hattının kullanılamadığı kişiselleştirilmiş tıp alanındaki insco verilerini doğrulamak için kullandık.Tekniğin temel avantajı, malign melanomda varsayımsal kanser kök hücreleri olan CD 1 33 pozitif hücrelere hızlı erişim sağlamasıdır. Teknik, laboratuvarımdan laboratuvar teknisyeni Catherine Davis tarafından sunulacaktır. Ameliyatla yeni izole edilmiş tümör dokusunu, %1 penisilin streptomisin içeren steril PBS içinde doku kültürü laboratuvarına taşıyın.Tümör dokusunu steril bir petri kabına aktarın ve fazla çözeltiyi aspire edin. Ardından 500 µL disosiasyon karışımı ekleyin ve yeni steril bistüriler kullanarak tümörü iki ila dört milimetrelik küçük parçalar halinde kıyın. Şimdi, kıyılmış tümör dokusundan iki ila dört gramı, beş mL disosiasyon karışımı içeren bir gentle max C tüpüne aktarın.Petri kabını ek 4,5 millilitersle disosiyasyon karışımıyla durulayın ve geri kalan doku fragmanlarını gentle max C tüpüne ekleyin. Tüpü kapatın, disosiyasyon cihazının manşonuna baş aşağı gelecek şekilde yerleştirin ve H tumor zero one programını çalıştırın. Ardından, örneği en yüksek çalışma hızında sürekli rotasyon altında 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.Şimdi tüpü, disosyasyon cihazının manşonuna ters şekilde takın ve H tumor zero two programını çalıştırın. Ardından, örneği 37 °C'de, 12 RPM'de sürekli rotasyon altında 30 dakika boyunca inkübe edin. Son olarak, gentle max programı H tumor zero three'ü çalıştırın.Numuneyi yeniden süspande edin ve hücre süspansiyonunu 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirerek 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Gerekirse, süspansiyonun tamamı geçene kadar hücre süspansiyonunu steril bir filtre ucuyla karıştırın. Hücre süzgecini beş mililitre quantum 2 6 3 medyum ile durulayın; hücre süspansiyonunu 300 G'de beş dakika boyunca pelletleyin ve süpernatantı atın.Eşlik eden metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği üzere, hücre peletleri yüksek miktarda doku ve lize olmuş kırmızı kan hücreleri nedeniyle kırmızı görünüyorsa, tümör hücrelerini 2 6 3 kuantumunda tekrar santrifüjleyin ve rutin pasaj hücrelerini %80 konfluense ulaştıklarında kültüre ekleyin. Primer hücre kültürünü bir mikroskop kullanarak fenotipik olarak analiz edin.Ardından, CD NA sentezini takiben RNA ekstraksiyonu için primer hücre kültüründen küçük bir miktar hasatlayın ve neoplastik melanoma, kök hücre ve stroma hücresi marker genlerine özgü primerlerle R-T-P-C-R gerçekleştirin. Analiz edilecek en önemli genler; fibroblast markerı CD 90, melanoma ve melanosit markerı, kanser kök hücre markerı CD 1 33, olgun dendritik hücrelerin markerı olan CD 83 ve HPRT veya GAAP dh gibi bir housekeeping gendir. Mikroskobik ve R-T-P-C-R analizlerinin kombinasyonu, primer melanoma kültüründe yüksek fibroblast kontaminasyonu olduğunu ortaya koyarsa, anti-fibroblast mikroboncuklar ve LD kolonlarını kullanarak fibroblastları uzaklaştırma işlemine geçin.%80 konfluense ulaşmış hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın, uygun miktarda Accutane ekleyin ve hücreler kültür yüzeyinden ayrılana kadar inkübe edin. Hücreleri quantum 2 6 3 ortamı ile toplayın ve 50 milliliter'lik bir tüpe aktarın. Hücreleri sayın, ardından gerekli sayıdaki hücreyi 300 G'de ve dört ila sekiz derece Celsius'ta beş dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatantı tamamen aspire edin ve yeniden süspanse edin. 350 µL max buffer içinde 1 × 10⁸ hücreye kadar süspanse edin; 100 µL FCR bloklama reaktifi ve 50 µL CD 1 33. One biotin ekleyin.İyice karıştırın ve 4 °C'de 10 dakika inkübe edin. Hücreleri 10 mL max buffer ile yıkayın, ardından 300 G'de, 4 ila 8 °C'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. İkinci yıkamadan sonra süpernatanı tamamen aspire edin.Hücre peletini 400 µL max buffer içinde yeniden süspande edin. 100 µL anti biotin mikroboncuk ekleyin ve iyice karıştırıp 4 ila 8 °C'de 15 dakika inkübe edin. Bu sırada, manyetik ayırma için max separator'ı hazırlamak amacıyla, quadro max'ı max separator multis stand'a takın.Gerekli sayıda LS kolonunu, kolon kanatları öne bakacak şekilde quadro max'in manyetik alanına yerleştirin. Her LS kolonuna bir ön ayırma filtresi ve uygun bir toplama tüpü yerleştirin. Her kolonun altında, filtreyi ve kolonu üç mililitre max tamponu ile durulayın ve süzüntüyü atın.Hücreler daha önce açıklandığı gibi max buffer ile yıkandıktan sonra, hücreleri 500 µL max buffer içinde yeniden süspande edin ve hücre süspansiyonunu hazırlanmış LS kolonuna uygulayın. Kolon başına üç mL max buffer ile üç kez yıkayın. İşaretlenmemiş cd 1 33 negatif hücre fraksiyonunun toplam akışını toplayın.Ardından, ön ayırma filtresini atın. Kolonu ayırıcıdan çıkarın ve uygun bir toplama tüpünün üzerine yerleştirin. Beş mililitre max buffer uygulayın.Negatif fraksiyonun saflığını artırmak için, pistonu kolonun içine kuvvetlice iterek etiketli CD 1 33 pozitif hücreleri hemen dışarı atın. Hücre süspansiyonunu yeni, dengelenmiş bir LS kolonuna uygulayın ve effluent CD 1 33 negatif fraksiyonunu toplayın. Bu rezekte lenf nodu metastazı, geç evre bir melanom hastasından alınmıştır.Dokunun mekanik ve enzimatik disosyasyonundan sonra, filtrelenmiş hücrelerin peleti yüksek miktarda eritrosit kontaminasyonu içeriyordu. Ardından, kırmızı kan hücrelerinin uzaklaştırılması sonucu açık kahverengi renkte bir hücre peleti elde edildi. Bu hücreler burada quantum 2 6 3 ortamında kültüre edildi; melanosit ve melanoma, fibroblast, dendritik ve kök hücre belirteçleri için bir R-T-P-C-R gerçekleştirildi.Hücrelerin çevreleyen stromadan değil, tümörden köken aldığını doğrulamak için genler kullanılmıştır. Yetişkin melanositler tear için normal kontrol hücreleri, embriyonik karsinoma hücre hattı N-C-C-I-T ise kök hücre belirteci CD 1 33 için pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Bu veriler, bazı primer hücrelerin gerçekten tear pozitif olduğunu ve dolayısıyla melanositik kökenli olduğunu ortaya koymaktadır.Kültür, olgun dendritik hücrelerin belirteci olan CD 83 için de negatiftir. İlginç bir şekilde, bu melanoma hücre hattı, asimetrik hücre bölünmesi için kritik olan bir gen ve bilinen bir kanser kök hücre belirteci olan CD 1 33'ü eksprese etmektedir. Burada, fibroblastların azaltılmasına yönelik işlem sonrası fibroblastlarla yoğun şekilde kontamine olmuş bir primer hücre kültürünün aydınlık alan mikrografı gösterilmektedir; kültürler primer melanoma hücrelerini temsil etmektedir.Primer melanoma hücreleri, CD 1 33 pozitif ve CD 1 33 negatif hücreler şeklinde ayrıştırılmıştır. İmmünofloresan boyama ve western blot analizinden elde edilen bu veriler, yüksek ayrıştırma etkinliğini ve saflığını göstermektedir. Bu yaklaşımın kişiselleştirilmiş tıp için büyük önemleri vardır; çünkü artık her bir hastanın ilaç yanıtını bireysel olarak daha iyi öngörmek için hastadan türetilen doku ve hücreleri kullanabilmekteyiz.Bu yöntem; tümörün nereden kaynaklandığı ve hastaların nasıl tedavi edilebileceği gibi temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olacaktır. Ayrıca, deneyleri doğrulayarak sistem biyolojisi yaklaşımlarının daha iyi yeniden tanımlanmasına katkı sağlayacaktır.

patient-derived-cell-culture-isolation-cd133-putative-cancer-stem

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kanser kök hücreleri (CSCS) malignitelerin çok sayıda tespit edilmiştir. Bu protokolde, aldehit dehidrogenaz aktivitesi ve CD44 ve CD24 ifade kullanan bir insan pankreas adenokarsinomu xenografts CSCS yalıtmak için akım sitometri yöntemi açıklar. Bu canlı hücreler, sonra fonksiyonel ve analitik çalışmalar kullanılabilir.

İnsan Pankreas Kanseri Xenografts Kök Hücre İzolasyonu

İşte biz bütün fare karaciğer doku sindirim, hücre zenginleştirme ve flow sitometri izolasyonu gerektiren bir süreçten CD133 eksprese karaciğer kök hücre ve kanser kök hücrelerin izolasyonu tarif. Biz gelişmiş tek hücre izolasyonu ve klonal genişleme için yöntemler içerir.

Klonal Genişleme CD133 + Karaciğer Kök Hücre İzolasyonu

Bu makalede, insan pankreas duktal adenokarsinomu (PDAC) dokusundan pankreas kanseri kök hücrelerinin (CSC'ler) izole edilmesi tekniği açıklanmaktadır. Bu CSC'ler, daha etkili kanser tedavileri geliştirmek için ilaç tedavisinin CSC'lerin in vitro kendini yenileme kapasitesi üzerindeki fonksiyonel etkilerini incelemek için kullanılır.

PDAC Kök Hücre İzolasyonu: Kanser Kök Hücrelerini Pankreas Tümörlerinden İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Bu videoda, manyetik olarak aktive edilmiş hücre sıralaması kullanılarak bir primer melanom hücre hattından CD133 negatif ve pozitif melanom kök hücrelerinin izole edilmesi tekniği açıklanmaktadır. CD133 pozitif melanom CSC'leri, melanom tümörigenezisinin mekanizmalarını anlamak için daha fazla incelenmiştir.

Melanom Kök Hücre İzolasyonu: Manyetik Aktivasyonlu Hücre Sıralaması Kullanılarak CD133 Pozitif ve Negatif Melanom Hücreleri Elde Etmek İçin Bir Yöntem

Kanser kök benzeri hücrelerin tümör nüksü ve tedavilere dirençteki rolünü anlamak son on yılda büyük ilgi gören bir konu haline gelmiştir. Bu makale, baş ve boyun skuamöz karsinom hücre hatlarından (HNSCC) kanser kök benzeri hücrelerin alt popülasyonunun izolasyonunu ve karakterizasyonunu açıklamaktadır.

Bir Baş-Boyun Skuamöz Hücre Karsinomu subpopülasyonu olması Kök Hücre Özellikleri İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Bu protokolün amacı, melanom tümörüne sızan lenfositlerin indüklenmiş pluripotent kök hücrelere yeniden programlanması için protokolü göstermektir.

İnsan Melanom tümör-süzücü lemfositler ile ilgili uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Bu metodolojinin amacı, kanser hücre hatlarındaki kanser kök hücrelerini (CSC) ve primer insan tümör örneklerini küre oluşturma protokolü ile sağlam bir şekilde, fonksiyonel tahliller ve akış sitometrisi ve Batı ile henotypik karakterizasyon kullanarak tanımlamaktır. Leke.

Jinekolojik ve Meme Kanseri Tümörlerinden Kanser Kök Hücre Kürelerinin Alınması

Bu makalede, melanom metastazının yeni aday aracılarını ve etki mekanizmalarını test etmek için kullanılan tekniklerin bir iş akışı açıklanmaktadır.

Melanom Metastazının Yeni Arabulucularının Belirlenmesi için Sağlam Bir Keşif Platformu

Bu makale, M-LMD'yi incelemek için klinik öncesi modeller geliştirmek üzere melanom ile ilişkili leptomeningeal hastalığı (M-LMD) olan hastalardan toplanan serebral omurilik sıvısı dolaşımındaki tümör hücrelerinin (BOS-CTC'ler) çoğaltılması için bir protokolü açıklamaktadır.

Canlı Çekim Melanom Hastalarından Beyin Omurilik Sıvısında Dolaşan Tümör Hücrelerinin Melanomla İlişkili Leptomeningeal Hastalığı İncelemek İçin Kültürü

Burada, taze melanom dokularından ayrışmış hücre süspansiyonlarını kültürleyerek melanom hastadan türetilmiş organoidler oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Bu organoidler, hastaya özgü tümörleri in vitro olarak aslına uygun olarak özetleyerek, tümör immünosupresif mekanizmalarını, ilaç taramasını, ilaç direnç mekanizmalarını ve kanser sürveyans yaklaşımlarını keşfetmek için yenilikçi bir yaklaşım sunar.

Melanom Hasta Kaynaklı Organoid Modellerle Terapötik Fırsatların Ortaya Çıkarılması

Öğrenin, melanom dokusundan hasta kaynaklı hücre kültürleri hazırlama ve MACS ile CD133+ kanser kök hücreleri izolasyonu yöntemini. Bu teknik, kişiselleştirilmiş tıp için ilaç yanıtı tahminlerini doğrulamada değerlidir.

Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu

Daha fazla video keşfet