Birincil Fare Colon Tümörler in vitro organoid Kültür

Bu prosedürün genel amacı, primer nöron, kolon, tümör, organoidleri oluşturmaktır. Bu, önce fare kolon tümör dokusunun toplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, bitişik normal kolon epitelini ayrıştırmaktır.

Daha sonra, kolon tümör hücreleri tek hücrelere sindirilir. Son adım, kolon tümör hücrelerini matrigel içine gömmek ve bunları sınırlı besin koşullarıyla seçici olarak kültürlemektir. Sonuç olarak, bir kolon tümörü organoid oluşumunun zaman seyrini göstermek için ışık mikroskobu kullanılır.

Bu tekniğin, dönüştürülmüş kolon kanseri hücre hatları gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, organoid kültürlerin in vivo durumu yakından taklit etmesi ve fizyolojik olarak daha ilgili veriler üretmesidir. Fareyi karbondioksit ile ötenazi yaptıktan ve kolonu topladıktan sonra, kolonu PBS ile yıkayın. Kolonu uzunlamasına açmak için makas kullanın, ardından stereo mikroskop altına yerleştirin ve tümör içeren bölgeleri çıkarmak için makas kullanın.

Tümör dokusunu toplayın ve PBS ile yıkayın. Yıkandıktan sonra, bağırsak parçalarını EDTA şelasyonuna aktarın, tamponlayın ve şelasyondan sonra 60 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin, normal bağırsak epitel hücrelerinin çoğu ayrılırken tümör hücreleri mekiğe bağlı kalacaktır. Normal epitel hücrelerini içeren şelasyon tamponunu aspire edin ve kalan tümör parçalarını yıkayın.

Bir kez daha. Beş mililitre soğuk şelasyon tamponu ile. Şelasyon tamponunu aspire ettikten sonra, tümör parçalarını beş mililitre soğuk bir XPBS ile yıkayın.

Bir XPBS'yi aspire ettikten sonra, doku parçalarına sindirim tamponu ekleyin ve iki saat inkübe edin. 37 santigrat derecede, tümör parçalarının bir dakika boyunca normal yerçekimi altında yerleşmesine izin verin ve ardından S süpernatantını 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın. Tek hücreli tümör süspansiyonunu üç dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyerek supinat edin.

Daha sonra beş mililitre PBS ve santrifüj ile bir kez yıkayın. Yine, tümör peletini 500 mikrolitre PBS ile yeniden askıya alın. Daha sonra bir hemo sitometre kullanarak izole edilmiş tek tümör hücrelerini sayın.

Daha sonra, tümör hücrelerini üç dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyerek reellin ve buz üzerinde mililitre matrijel başına beş miligram olarak yeniden gönderin. Daha sonra, 24 oyuklu bir plakada kuyu başına 50 mikrolitre matrigel hacminde 15.000 hücre plakalayın. Matrigel hücre karışımının 37 santigrat derecede 15 dakika polimerize olmasına izin verdikten sonra, her iki günde bir EGF içeren bazal kültür ortamını değiştirmek için mililitre idrar EGF'si başına 50 nanogram içeren 500 mikrolitre bazal kültür ortamı ekleyin ve masaj yapmak için haftada bir ila beş organoidlere masaj yapın.

Kültür ortamını taze bazal ortamla değiştirdikten sonra, organoidleri ve matrijeli mekanik olarak bozmak için kesilmiş pipet uçlu bir P 1000 pipeti kullanın. Organoid süspansiyonu 15 mililitrelik bir şahin tüpüne aktarın. Organoidleri daha da bozmak için ateşle parlatılmış bir makarna pipeti kullanın.

Ayrışmış organoidleri beş mililitre bazal kültür, orta ve iki dakika boyunca 200 kez G santrifüj ile yıkayın. Daha sonra supinatı atın, organoidleri dondurmak, ayrıştırmak, yıkamak ve santrifüjlemek için peleti daha önce tarif edildiği gibi matri jel ve plaka ile yeniden süspanse edin. Daha önce olduğu gibi, supinate ve resus'u atın.

Pelet% 20 fetal sığır serumu ve% 10 dimetil sülf oksit içeren DMEM'de askıya alın. Ardından, hücre süspansiyonunu 1.5 mililitrelik kriyo tüplerine aktarın. Tüpleri bir Nalgene Mr.Frosty dondurma kabına aktarın ve dakikada eksi bir santigrat derece soğutma hızı elde etmek için eksi 80 santigrat derece dondurucuda saklayın.

Gece boyunca inkübasyondan sonra, hücreleri sıvı nitrojene aktarın. Hücreler bu şekilde iki yıldan fazla saklanabilir. RNA ekstraksiyonu için hücreler toplanır.

Pasajlamaya gelince, RNA, pico saf RNA izolasyon kiti kullanılarak izole edilir. Üreticinin protein ekstraksiyonu talimatlarına göre, hücre peleti olağan şekilde toplanır ve daha sonra immünohistokimya için 100 mikrolitre radyo immünopresipitasyon test tamponunda bulunur. Hücre kültürü ortamını aspire ettikten sonra, tümör organoidlerini bir kriyo kalıba aktarmak için kesilmiş bir P 1000 pipeti kullanın.

Kalıbı kuru buz üzerine yerleştirin ve kalıba doku dondurma ortamı ekleyin Donmuş bölümleri yedi mikronda kesin ve boyayın Daha önce yayınlanmış protokollere göre, bu görüntü, kaplamadan kısa bir süre sonra üç aylık bir PC min fareden alınan bir kolon tümöründen türetilen temsili bir organoid oluşumunu göstermektedir. Bu görüntü, kaplamadan bir gün sonra aynı organoidi göstermektedir. Burada, organoid üç gündür kültürde.

Bu görüntü, kaplamadan altı gün sonra organoidi gösterirken. Burada 14 gündür kültürde olan iki organoid gösterilmektedir. Bu aşamada, her organoidin bir hücre kümesinden oluştuğunu unutmayın.

Bu histogram, iki farklı kollajenaz sindirim koşulu altında organoid oluşumunun başarılı oranını gösterir. Bu görüntüler, beta-katenin için immünofloresan boyamaya sahip bir PC min faresi olan üç aylık bir kolon tümöründen türetilen organoidleri göstermektedir. Çekirdekleri boyamak için DPI kullanıldı.

Bu videoyu izledikten sonra, enzim sindirimi ile primer idrar kolon tümörü OID'nin nasıl kurulacağını iyi anlamış olmalısınız.