Pankreas Kanseri İlerleme Bioluminescent Ortotopik Model

Bu prosedürün genel amacı, tümör gelişimini non-invaziv olarak izlemek için in vivo biyolüminesans görüntüleme kullanan ortotopik bir pankreas kanseri fare modeli hazırlamaktır. Bu, Matrigel'de lusiferaz etiketli kanser hücrelerinin ilk resus süspansiyonu ile gerçekleştirilir. İkinci adım, karın boşluğunu açmak ve pankreası bulmak ve sabitlemek için bir laparotomi yapmaktır.

Daha sonra, matrigel içindeki tümör hücrelerinin bir süspansiyonu pankreasa enjekte edilir. Son adım, pankreasın değiştirilmesi ve karın boşluğunu kapatmak için dikişlerin kullanılmasıdır. Sonuç olarak, biyolüminesans görüntüleme, tümör ilerlemesini izlemek ve terapötik müdahalelere yanıtı izlemek için kullanılır.

Bu modelin in vitro tabanlı hücre tahlillerine veya pankreas kanserinin deri altı modellerine göre en büyük avantajı, pankreas tümör hücreleri ile pankreas mikroçevresi arasındaki etkileşimleri gerçekten araştırmamızı sağlamasıdır. Bu modeldeki hastalık ilerlemesinin kinetiği yüksek oranda tekrarlanabilir ve kısa bir zaman diliminde ortaya çıkar, bu da bu modeli pankreas kanserinde yeni terapötiklerin incelenmesi için yararlı kılar, Bu modelin gerçekten gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Tümör hücrelerinin enjeksiyonu sızıntıyı önlemek için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır Bu işleme başlamak için kültür

% 70 birleşene kadar yazılı protokolde tarif edildiği gibi lusiferazı eksprese etmek için transdüksiyon yapılan pankreas kanseri hücreleri, daha sonra% 0.05 tripsin EDTA ile hücreleri toplayın ve bunları bir hemo sitometre kullanarak sayın, canlılığın% 90'dan büyük olduğundan emin olunDaha sonra, santrifüjlemeyi takiben beş dakika boyunca yerçekiminin 200 katı ile hafifçe santrifüjleyerek hücreleri peletleyin, Süpernatanı çıkarın ve pankreas kanseri hücrelerini mililitre başına 20 milyon hücrede yeniden askıya alın. Üç ila iki matrigel ve soğutulmuş PBS karışımında, karışımı buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra 0.3 mililitre 29 gauge insülin şırıngası kullanarak.

Hazırlanan matrigel hücre süspansiyonunu şırınganın içine çekin. Bu işleme başlamak için, fareyi %iki ila 3 oranında inhale izofluran kullanarak uyuşturun. Bir ila iki dakika sonra, pedal refleksi eksikliğini kontrol etmek için farenin ayak parmağını hafifçe sıkıştırarak anestezi derinliğini kontrol edin.

Ardından, ameliyat sırasında kurumayı önlemek için her göze yeterli kayganlaştırıcı uygulayın. Ardından fareyi 37 derecelik bir ısıtma yastığının üzerine sırt üstü yerleştirin ve karnın sol tarafını kaldırmak için fareyi hafifçe çevirin. Doğru yönlendirildikten sonra, farenin karnını ameliyat için hazırlayın.

Steril cerrahi aletler kullanarak, orta hattan yaklaşık iki milimetre yana bırakılan ciltten 1,5 santimetrelik bir kesi yapın. Daha sonra alttaki karın kasında 1,5 santimetrelik bir kesi yapın. Daha sonra, steril forseps kullanarak dalağı bulun ve karın boşluğu için nazikçe çıkarın.

Altta yatan pankreası ortaya çıkarmak için dalağı steril bir pamuklu çubuk boyunca sabitleyin. Sonra dalak resüsüne bitişik pankreasın kuyruğunu bulun. Matrigel hücre süspansiyonunu askıya alın ve enjeksiyonu takiben pankreasın kuyruğuna 20 mikrolitre enjekte edin.

Matrigel katılaşmak için zaman bulana kadar şırıngayı 30 ila 60 saniye yerinde tutun, bu önemli adım hücre sızıntısını en aza indirir. İğne çıkarıldıktan sonra, sızıntı olmadığından emin olmak için enjeksiyon bölgesini inceleyin. Ardından dalak ve pankreası karın boşluğuna geri koyun.

Farenin karın kaslarını, sürekli bir dikiş kullanarak yuvarlak bir iğne ile emilebilir örgülü dört otomatik sütür ile kapatın. Ardından, dış cildi emilmeyen bir monofilament ile kapatın. Altı aut sütür ile bir kesme iğnesi ile sürekli bir dikiş ve Betadine uygulayın.

Daha sonra fareyi solunan anestezikten çıkarın ve deri altına kilogram buprenorfin başına 0,05 ila 0,1 miligram enjekte edin. Ameliyat sonrası bir analjezik olarak, farenin yiyecek ve suya ücretsiz erişimi olan 37 santigrat derecelik bir ısıtma yastığına yerleştirilen kafesinde iyileşmesine izin verin. Ameliyattan sonraki ilk birkaç gün fareyi yakından izlemeye devam edin.

Fare kamburlaşma veya hareket kabiliyetinin azalması gibi ağrı belirtileri gösteriyorsa, buprenorfin 36 saatlik bir süre boyunca her 12 saatte bir deri altına verilebilir. Ameliyat bölgesi yedi ila 10 gün içinde iyileştikten sonra, fareyi uyuşturun ve dış dikişleri çıkarın. Pankreas kanseri hücrelerinin biyolüminesan takibine başlamak için.

% iki ila% 3 oranında solunan flor kullanarak fareyi tekrar uyuşturun ve kuruyan boyamayı önlemek için gözlere kayganlaştırıcı sürün. Anestezi uygulandıktan sonra, kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla kilogram Lucifer başına 150 miligram enjekte edin ve luciferian'ın hücrelere gitmesi için bir ila iki dakika bekleyin. Fareyi, tümör kameraya doğru bakacak şekilde biyolüminesan görüntüleme sisteminde sağ tarafına yerleştirin.

Burada Illumina iki görüntüleme sistemini kullanıyoruz. Ardından, daha önce diğer JOV makalelerinde açıklandığı gibi görüntüleme yazılımını kullanarak beyaz ışık ve biyolüminesans görüntüleri yakalayın. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, fareyi solunan anestezikten çıkarın ve ev kafesinde iyileşmesine izin verin.

Tümör büyümesini araştırmak için tümör büyümesi süresi boyunca bu adımları tekrarlayın. Kinetik. Lusiferaz etiketli hücre hatlarının kullanılması, tümör büyümesini ölçmek için benzersiz bir yol sağlar. Non-invaziv olarak. Burada, enjeksiyondan 10 gün sonra, nispeten küçük bir tümör ile, enjeksiyondan 31 gün sonra tümörün büyüdüğü ve tümörün rezeke edilmesinden beş gün sonra bir fare gösterilmiştir.

Bu görüntüde görülen biyolüminesans, rezeksiyondan beş gün sonra pankreas tümörünün nüksetmesini ve yakındaki karaciğere metastazı göstermektedir. Burada gösterilen grafik, matrigel hücre enjeksiyon yöntemi için benzer büyüme oranlarını göstermektedir. Bu videoda anlatılan pankreas tümör parçalarının iniş yoluyla nakledildiği başka bir yöntemle karşılaştırıldı.

Hem pan one hem de capin one için benzer büyüme kinetiği görülebilir. Fedakarlığı takiben hücre hatları, pankreas kanseri hücrelerinin istilacı doğasını, burada gösterilen sarı yıldızlarla gösterilen çevredeki pankreas dokusuna ve burada gösterilen karaciğer de dahil olmak üzere diğer organlardaki metastazlara göstermek için H ve d boyaması yapılmıştır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu yöntemler yaklaşık 10 dakika içinde yapılabilir.

Ek olarak, metastatik ve tekrarlayan hastalık ilerlemesinin biyolojik olarak görüntülenmesi, şu anda çoğu kanser terapötiğinin palyatif olması nedeniyle bu modeli klinik olarak anlamlı kılmaktadır.