Kordon Kanı gelen Prekürsör B-hücreli altkümeleri İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, göbek kordonu kanından öncü B hücrelerinin alt kümelerini izole etmektir. Bu, ilk olarak mononükleer hücrelerin yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile kordon kanından izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, hücre yüzeyi antijenleri, kalan B olmayan hücrelerin herhangi birini manyetik olarak tüketmek için biyotin konjuge antikorlarla etiketlenir.

Daha sonra, izole edilen B hücreleri, CD 19, CD 34 ve CD 45 hücre yüzey antijenlerine karşı antikorlarla floresan olarak etiketlenir. Son adımda, hücreler, öncü B hücresi alt kümelerini geri kazanmak için akış sitometrisi ile sıralanır. Sonuç olarak, yüksek kaliteli DNA ve RNA gerektiren aşağı akış tahlillerinde kullanılmak üzere yeterli sayı ve kalitede hücreler elde edilebilir.

Hücre sıralama stratejisinin alternatif yöntemlere göre bir avantajı, stratejimizin akış sitometresinde daha az zaman gerektirmesi ve sadece üç floresan antikor gerektirmesi ve deneyin maliyetini büyük ölçüde azaltmasıdır. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, göbek kordonu kanı hücrelerini akış sitometrisi için hazırlamak için mevcut olan çeşitli yöntemler ve akış Sitometresinin hazırlanmasının karmaşıklığı ile mücadele edeceklerdir. Bu yöntem, sağlıklı öncü B hücreleri hakkında bilgi sağlayabilse de, T hücreleri gibi göbek kordonu kanında bulunan diğer hücre tiplerine veya lösemi veya lenfoma gibi herhangi bir hematopoietik hücreyi içeren hastalıkların çalışmalarına da uygulanabilir.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü göbek kordonu kanını ve hücrelerini, hücre canlılığını en üst düzeye çıkaracak ve kirletici kalıntıların varlığını azaltacak şekilde işlemek için gerekli uygun teknikleri tanımlamak zordur. Mononükleer hücreleri göbek kordonu kanından izole etmek için, önce kordon kanının sekiz mililitre alikotunu 24 mililitre DPBS ile seyreltin. Daha sonra, her seyreltilmiş kan karışımını 50 mililitrelik konik tüplerde 15 mililitre ALI watt fipa plus'ın üzerine yavaşça katmanlayın ve katmanları ayrı tutmaya özen gösterin.

Daha sonra, hücreler yoğunluk gradyanı ile ayrılırken, kanı 40 dakika boyunca 40 kez G ve 20 santigrat derece ile santrifüjleyin, numune kimlik tarihi ve tabloda belirtildiği gibi diğer uygun bilgilerle birlikte yedi beş mililitrelik yuvarlak tabanlı tüpleri etiketleyin. Ayrılmadan sonra, mononükleer hücreler plazma fi opak artı arayüzünde kalırken, granülositler ve eritrositler şimdi üst plazma katmanlarını aspire edecek ve mononükleer hücre katmanları ile temastan kaçınacaktır. Ardından, 50 mililitrelik tüplerin üçünden mononükleer hücre katmanlarını tek bir yeni 50 mililitrelik tüpe dikkatlice toplamak için 10 mililitrelik bir cam pipet kullanın.

Bu yeni tüpü PBS ile doldurun, hücre süspansiyonunu nazikçe karıştırın ve ardından hücreleri 300 kez G ve 20 santigrat derecede 10 dakika boyunca iki kez yıkayın. İlk yıkamadan sonra, peletleri tekrar süspanse edin ve 50 mililitrelik tek bir konik tüpe aktarın. İkinci yıkamadan sonra, hücre peletini 200 mikrolitre PBS içinde nazikçe askıya alın, hücre süspansiyonunun bir mikrolitresini saymak için 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde bir mililitre PBS'ye aktarın.

Daha sonra 50 mililitrelik tüpteki hücreleri daha fazla PBS ile yıkayın, ardından peleti bozmadan süpernatanı tamamen çıkarın. B hücrelerini mononükleer hücrelerden izole etmek için, önce Resus, yeni yıkanmış peleti dört santigrat derece 160 mikrolitrede askıya alır. Taze hazırlanmış DGA'lar E-D-T-A-P-B-S tamponu.

Daha sonra 40 mikrolitre B hücresi izolasyon kiti, bio ITIN antikor kokteyli ile hücre süspansiyonu karıştırın. Hücreleri dört santigrat derecede 10 dakika inkübe ettikten sonra, serbest antikoru 10 milyon hücre başına bir mililitre dört santigrat derece, E-D-T-A-P-B-S tamponunda yıkayın. Daha sonra hücre peletini 320 mikrolitre dört santigrat derece E-D-T-A-P-B-S tamponunda yeniden süspanse edin.

Şimdi 80 mikrolitre anti biyotin mikroboncukları, dört santigrat derecede 15 dakikalık bir inkübasyondan sonra hücre süspansiyonu ile karıştırın. Hücreler dönerken hücreleri tekrar yıkayın. Maksimum ayırıcının manyetik alanına bir LS sütunu yerleştirin ve sütundan üç mililitre dört santigrat derece E-D-T-A-P-B-S tamponu damlatın.

Daha sonra, yıkanmış hücrelerin 100 milyona kadarını 500 mikrolitre dört santigrat derece, E-D-T-A-P-B-S tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra hücre süspansiyonunu sütuna pipetleyin ve sütundan geçen etiketsiz hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpte toplayın. Orijinal konik tüpün duvarlarına, her seferinde bir mililitre olmak üzere, dört santigrat derece iki mililitre daha E-D-T-A-P-B-S tamponu ekleyin ve ardından artık hücre süspansiyonunu nazikçe karıştırın ve pipetleyin.

Son olarak, etiketlenmemiş hücreleri içeren konik tüpü PBS ile doldurun. Santrifüjlemeden sonra hücreler, hücre peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice uzaklaştırır. Daha sonra hücreleri 200 mikrolitre E-D-T-A-P-B-S tamponunda nazikçe tekrar askıya alın.

Antikor etiketlemesine başlayın. Önce hücre süspansiyonunun bir mikrolitresini önceden etiketlenmiş lekesiz tüpe aktararak adım atın. Tüpe 500 mikrolitre E-D-T-A-P-B-S tamponu ekleyin ve buz üzerinde saklayın.

Tüm ışıkları kapatın ve ardından kalan hücre süspansiyonuna 1 milyon hücre başına 20 mikrolitre CD 19, CD 34 ve CD 45 antikoru ekleyin. İyice karıştırın ve tüpü oda sıcaklığında 30 dakika karanlıkta bırakın. Daha sonra, antikor etiketli hücre süspansiyonunun 40 mikrolitresini yedi A D etiketli tüpe aktarın.

Hücreleri bir mililitre PBS'de yıkayın ve ardından paleti 100 mikrolitre bağlayıcı tamponda yeniden süspanse edin. Bu hücrelere yedi mikrolitre yedi A d ekleyin ve daha sonra hücreler yedi A d ile etiketlenirken oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika inkübe edin, PBS ile antikor etiketli hücrelerin tüpünü doldurun, antikor etiketli hücreleri yıkayın ve ardından peleti 500 mikrolitre E-D-T-A-P-B-S tamponunda yeniden süspanse edin. Şimdi antikor etiketli hücre süspansiyonunun tüm hacmini CD 19 pozitif CD 34 pozitif CD 45 pozitif etiketli tüpe aktarın.

Tüpü ilave bir mililitre E-D-T-A-P-B-S tamponu ile durulayın ve kalan hücre süspansiyonunu CD 19 pozitif CD 34 pozitif CD 45 pozitif etiketli tüpe aktarın. Son olarak, MO flow XDP akış sitometresini kullanarak hücreleri sıralamak için yedi A ve D tüpüne 300 mikrolitre bağlayıcı tampon ekleyin. Önce sıralama için MO akışını ayarlayın, uygun telafi denetimlerini çalıştırın ve ardından bu şekilde gösterildiği gibi grafikleri içeren bir protokol oluşturun.

Aerosol tahliye sisteminin her zaman çalıştığından emin olun ve ardından ön ve yan saçılma grafikleri için voltajı ve kazancı ayarlamak için lekelenmemiş numuneyi kullanın. Negatif floresan popülasyonlarını tanımlamak. Kalıntı içeren herhangi bir DNA'nın geri kazanılan numuneleri kirletmemesi için eşiği %1'e eşit veya daha az olacak şekilde ayarlayın.

CD 19 pozitif CD 34 pozitif CD 45 pozitif numunenin yaklaşık 50.000 olayını çalıştırın. Geçit stratejisini az önce gösterildiği gibi ayarlamak için, açılmamış CD 19 pozitif CD 34 pozitif popülasyonunu yan saçılma ve ileri dağılım grafiğine geri geçitleme. Lenfosit yürüyüşünün potansiyel pro B hücreleri içerdiğinden emin olmak için.

Yedi a d boyama için negatif floresan popülasyonunu da ayarlamak için bu örneği kullanın. Daha sonra, numunenin canlılığını belirlemek için yedi a d numunesini çalıştırın, yalnızca başlangıçta %95'e eşit veya daha büyük bir canlılığa sahip bir numuneden hücreleri sıralayın, çünkü ölü hücreler ayrım gözetmeksizin lekelenecek ve sıralama popülasyonlarını kontamine edebilir, şimdi popülasyonlar için toplanacak sıralama kararlarını ayarlayın CD 19 pozitif, CD 34 pozitif CD 19 pozitif, CD 34 negatif, CD 45, düşük CD 19 pozitif, CD 34 negatif, CD 45 orta ve CD 19 pozitif. CD 34 negatif CD 45 yüksek.

Tıkanmaları önlemek için lenfosit ve ikili ayrım kapılarını tüm popülasyonların sıralama kararlarına dahil edin. Sıralama ucunda, CD 19 pozitif CD 34 pozitif CD 45 pozitif numuneyi sıralamadan hemen önce 40 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün. Daha sonra PBS'de %2 FBS ile kaplanmış etiketli toplama tüplerini buzla dolu bir tüp tutucuya yerleştirin ve sıralama tamamlandıktan hemen sonra hücreleri uygun toplama tüpüne sıralayın.

Örnekler arasındaki DNA'yı çıkarmak, hücrenin başarısında rol oynar, iyi bir sıralama yapar. Lenfosit yürüyüşünde yüksek oranda hücre vardır. İyi başarı oranlarına sahip numuneler, kapılı lenfosit popülasyonunun altına ve soluna düşen düşük olay sayısı ile kanıtlandığı gibi, düşük seviyelerde kirletici kalıntı içerir.

Başarı oranları düşük olan numuneler, yüksek düzeyde kirletici kalıntı içerir. Kötü örnekler bu olaylarda belirgin bir artış olduğunu göstermektedir. Akışla sıralanmış hücreler ve her bir öncü B hücresi alt kümesinden izole edilen müteakip DNA, aşağı akış analizlerini gerçekleştirmek için miktar ve kalitededir.

Bu DNA'yı Myra'da metillenmiş DNA'dan zenginleştirmek için rutin olarak kullandık, burada CD 19 pozitif, CD 34 pozitif hücrelerden izole edilen DNA, CD 34 pozitif, CD 45 düşük hücreler, CD 19 pozitif, CD 34 negatif CD 45 orta hücreler ve CD 19 pozitif CD 34. Negatif CD 45 yüksek hücreler, toplam dokuz dakika boyunca yüksekte sonikasyona tabi tutuldu, sütun saflaştırıldı ve daha sonra bu şeritte siber yeşil nükleik asit jel lekesi ile% 1'lik bir aros jeli üzerinde görselleştirildi. Myra'dan sonra aktif motif yöntemi toplayıcı ultra kit PCR kullanılarak bir kontrol 100 baz çifti merdiveni de çalıştırıldı, kontrol metillenmiş SLC 25 A 37 ile PCR ve metillenmiş DNA'nın zenginleştirilmesini doğrulamak için kontrol metillenmemiş APC bir geni yapıldı.

SLC 25'in daha yüksek amplifikasyonu. A 37, öncü B hücresi alt kümelerinde metillenmiş DNA zenginleşmesini doğrular Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 10 saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, hücreyi çok nazik bir şekilde tedavi etmeyi ve optimize edilmiş miktarda antikor kullanmayı unutmamak önemlidir, böylece kirletici kalıntı oluşumu en aza indirilir Bu prosedürü takiben.

Hangi genlerin metillendiği ve öncü B hücresi alt kümeleri gibi ek soruları yanıtlamak için yeni nesil dizileme gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Canlı insan hücreleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman bir aerosol tahliye sistemi çalıştırmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.