Name: Kordon Kanı gelen Prekürsör B-hücreli altkümeleri İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: Öğrenin, kordon kanından prekürsör B-hücre alt kümelerini izole etme yöntemini. Yoğunluk gradyanı santrifüjasyon, manyetik ayrıştırma ve akış sitometrisi kullanılarak yüksek kaliteli nükleik asit elde edilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma KT Ulusal Sağlık Enstitüleri (NCI R00 CA132784) tarafından desteklenmiştir

1. Kordon Kanı gelen Mononükleer Hücreleri İzolasyon <ol><li> EDTA-PBS 95 ml durulama tamponu (1:20 seyreltme) 5 ml sığır serum albumini (BSA) stok solüsyonu tampon ekleyin hazırlayın. Degas tampon ve buz üzerinde arabellek tutmak ÖNEMLİ:. Degas uyulmaması CD19 izole ederken tampon optimum sonuçlar daha az neden olabilir + kabarcıklar yalıtım sütun engelleyebilir B-hücreleri çünkü. </li><li> Yoğunluk gradiyenti santrifüj için 50 ml konik tüpler hazırlayın. Kordon kanı işleme için gerekli tüp sayısı (1 tüp 8 ml kan işleyebilir) belirleyin ve her tüpe Ficoll-Paque PLUS 15 ml ekleyin. </li><li> 24 ml DPBS (1X) ve dikkatli bir tabaka 50 ml konik tüpler her Ficoll-Paque PLUS üstüne seyreltilmiş kordon kanı karışımı ile kordon kanı 8 ml seyreltin. Kan ve Ficoll-Paque PLUS karıştırmayınız ÖNEMLİ:. Kordon kanı ve Ficoll-Paque PLUS karışmalarını önlemek için, 45 derecelik bir açıyla tüp tutun vetabaka kan karışım yavaşça. </li><li> 20 ° C&#39;de 40 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüjleyin Mononükleer hücreler (MNC) kalacaktır plazma Ficoll-Paque PLUS arayüzü Ficoll-Paque PLUS ozmotik basınç daha yüksek yoğunluğu nedeniyle sediman granülosit ve eritrosit oysa. Örnek kimliği, tarihi ve aşağıdaki ile Bölüm 3 kullanılmak üzere Etiket yedi 5 ml yuvarlak tabanlı tüpler: </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Tüp </td><td> Etiket </td><td> Amaç </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Renksiz </td><td> Akım sitometri sırasında normalleşmesi için boyanmamış hücreler </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 7AAD </td><td> Flow sitometri esnasında canlılığını belirlemek için </td></tr><tr><td> 3 </td><td> + + + </td><td> Sıralanır hücreleri içerir </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 34 + </td><td> CD34 + / CD19 toplamak için +(Geç pro-B - erken pre-BI) hücreler </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Düşük 45 </td><td> / CD19 düşük + / CD45 (pre-BI) hücreleri - CD34 toplamak için </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 45 med </td><td> / CD19 + / CD45 med (pre-BII) hücreleri - CD34 toplamak için </td></tr><tr><td> 7 </td><td> Yüksek 45 </td><td> / CD19 + / CD45 yüksek (immatür B) hücreleri - CD34 toplamak için </td></tr></tbody></table> Coat boruları 4, 5, 6, 7 ve% 2 FBS ile ve buz üzerinde her tüpleri. <ol start="5"><li> Dikkatle üst plazma tabakası aspire ve mononükleer hücre tabakası ile temasından kaçının. 10 ml&#39;lik cam pipet kullanarak dikkatlice yeni bir 50 ml konik tüp mononükleer hücre tabakası aktarın. Tek bir 50 ml tüp içine birlikte üç tüpler mononükleer hücreleri birleştirin. </li><li> PBS ile tüp doldurun, 10 dakika boyunca 300 xg&#39;de hafifçe karıştırın ve santrifüj20 ° C. Hücre pelletini bozmadan süpernatant dikkatlice aspire. 1x tekrarlayın. İlk yıkama sonra, pelet tekrar süspansiyon haline getirin ve tek bir 50 ml&#39;lik konik tüpe aktarılır. </li><li> Yavaşça PBS içinde 200 ul hücre pelet tekrar süspansiyon. , Hücre süspansiyonu 1 ul çıkarın 1,5 ml mikrosantrifüj tüp PBS 1 ml ekleyin ve (santrifüj 50 ml hücre süspansiyonu yerleştirdikten sonra hücreleri saymak) sayım için kenara koyun. PBS ile tüp doldurun ve trombositleri uzaklaştırmak için 15 dakika için 200 x g&#39;da santrifüjlenir. Hücre pelletini bozmadan tamamen Süpernatantı. </li></ol> 2. MACS Ayrılması Mononükleer Hücreler Modifiye B hücre izolasyonu <ol><li> 160 ul soğuk (4 ° C) EDTA-PBS tampon ile adım 1.7 &#39;den pelet yeniden süspanse edin. </li><li> 40 ul B KLL biotin antikor kokteyli ekleyin. 4 ° C&#39;de karıştırın ve 10 dakika için inkübe pipet </li><li> Yıkayın hücrelerini - 1 ml soğuk (4 ° C) EDTA-PBS tampon milyon başına 10 hücreleri (hücre nu eklemekmber adım 1.7) belirlenen ve 10 dakika boyunca 300 xg&#39;de santrifüj. Tamamen süpernatan aspire ve daha sonra 320 ul soğuk (4 ° C) EDTA-PBS tampon içinde tekrar süspansiyon hücre peleti. </li><li> 80 ul anti-biotin mikro-küreler ekleme, 4 ° C&#39;de karıştırın ve 15 dakika için inkübe </li><li> Yıkayın hücrelerini - 1 ml soğuk 10 dakika boyunca 300 xg&#39;de (4 ° C) EDTA-PBS tampon milyon hücre başına 10 ve santrifüj ekleyin. Soğuk 500 ul (4 ° C) EDTA-PBS tamponu içinde 100 milyon hücre kadar tekrar. Hücre sayısına göre Ölçeği tampon hacmi. </li><li> Santrifüj (Adım 2.5) sırasında MACS Sütunlar ve MACS Ayırıcılar hazırlayın. MACS ayırıcı bir manyetik alan içinde bir LS sütun yerleştirin, 3 ml soğuk (4 ° C) EDTA-PBS tampon sütun üzerine eklemek ve tampon sütunu boyunca damla izin verir. Aracılığıyla akış yakalamak için bir kap kullanın. Aracılığıyla akış atın. </li><li> Sütununun altındaki bir 50 ml konik boru yerleştirin ve sütun üzerine hücre süspansiyonu pipetle. Etiketsiz hücreleri Throug damla izin verh kolon ve 50 ml konik bir tüp içine. Önemli: Bu antikor etiketleme ve hücre sıralama için kullanılacak olan hücrelerdir. Aracılığıyla akış atmayın. Adım 2,5 hücrelerin tümü kurtarmak için, konik boru duvarları ile soğuk (4 ° C) EDTA-PBS tampon ilave bir 1 ml ekleyin. İyice karıştırın ve sütun üzerine, geri kalan hücre süspansiyonu pipetle. 1x tekrarlayın. Sütun geçtikten sonra konik tüp toplanan etiketsiz hücreleri kullanılarak 2.8 adıma geçin. </li><li> 10 dakika boyunca 300 xg&#39;de PBS ve santrifüj ile etiketsiz hücreleri içeren konik tüp doldurun. Dikkatle hücre pelletini bozmadan süpernatant kaldırmak. EDTA-PBS 200 ul ekleyin ve hafifçe hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. </li></ol> 3. Hücre Ayırma için antikor Etiketleme ve Hazırlık <ol><li> (Adım 1.4) &quot;lekesiz&quot; etiketli tüpe hücre süspansiyonu ve yerin 1 ul aspire. 500 ul EDTA-PBS tamponu ekleyin ve buz üzerinde tüp saklayın. </li><li> 20 EkleKalan hücre süspansiyonu içine milyon hücre başına her bir antikorun ul (CD19, CD34 ve CD45). İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika süreyle karanlıkta tüpü yerleştirin. Işıklar kapalı CD antikorlar 2-4 ışığa duyarlı, tam adımlardır. </li><li> Antikor ile inkübasyon 30 dakika sonra, hücre süspansiyonu, 40 ul aspire ve &quot;7AAD&quot; etiketli tüp içine yerleştirin. 2 dakika süreyle 500 xg&#39;de boru ve santrifüj içine 1 ml PBS ekleyin. Süpernatantı ve bağlayıcı tampon içinde 100 ul hücre tekrar süspansiyon. 7AAD 7 ul (7-Aminoactinomycin D) eklenir ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca karanlıkta inkübe edilir. 10 dakika inkübasyon tam adım 3.4 sırasında. </li><li> CD antikorlar ile etiketlenmiş kalan hücreler içeren tüpün üst PBS ekleyin. 3 dakika boyunca 500 xg&#39;de tüp santrifüjleyin. Süpernatantı, 500 ul EDTA-PBS tamponu ekleyin ve hücre pelet tekrar süspansiyon haline getirin. &quot;+ + +&quot; Etiketli tüpe hücre süspansiyonu tüm hacmi aktarın. Hücre süspansiyonu bir bütün kurtarmak için&quot;+ + +&quot; etiketli tüpe 50 ml konik tüp ve transfer için dd ek 1 ml EDTA-PBS tamponu. </li><li> Inkübasyondan sonra (Adım 3.3), 7AAD tüpüne 300 ul bağlayıcı tampon eklemek. &quot;Lekesiz&quot;, &quot;7AAD&quot; ve &quot;+ + +&quot; örnekleri ve &quot;34 +&quot;, &quot;45 düşük&quot; &quot;45 med&quot; ve &quot;45 yüksek&quot; tüpleri Akım sitometri için hazırız. </li></ol> 4. MoFlo XDP Akış Sitometresi kullanma Hücre Ayırma <ol><li> Sıralama için Set-up MoFlo: lazerler hizalayın; damlacık akışı stabilize; damla gecikme belirler. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre Invitrogen ABC Fare boncuk seti (veya benzeri) kullanarak tek renk telafisi denetimleri hazırlayın. Pozitif ve negatif popülasyonları optimum ayrılması için floresans kanallarının voltaj ayarlayarak, tek renk kontrolleri çalıştırın. Kompanzasyon katsayılarını ayarlayın ve telafi parametre koleksiyonu protokolü uygulanır. Kompanzasyon katsayılarını antikor yeni bir sürü elde edilir her seferinde yeniden kurmak. </li><li> Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi çizer dahil protokol oluşturur. </li><li> , Boyanmamış örnek Çalıştır gerilim ve ileri ve yan dağılım için kazancı ayarlayın ve negatif floresan popülasyonları tanımlamak. DNA kurtarma tür hedefi olduğundan, eşik DNA içeren enkaz kurtarıldı örnekleri kontamine etmez (≤ ​​1%) düşük şekilde ayarlanmış olmalıdır. * Aerosol Tahliye Sistemi insan hücrelerinde MoFlo üzerinde yürütülüyor yaşamak her zaman çalıştığından emin olun. </li><li> Yolluk stratejisi (Şekil 2) ayarlamak için + + + örnek (~ 50.000 olay) küçük bir kısım çalıştırın. B-hücre progenitörlerinin B-hücrelerinin olgunlaşması için aynı dağılım yok Çünkü, lenfosit kapısı potansiyeli Pro-B hücreleri içeren sağlamak için SSC vs FSC arsa üzerine + / CD34 + nüfus ungated CD19 backgate. Bu örnekten de 7AAD için negatif floresans nüfus ayarlayın. </li><li> Örnek canlılığı belirlemek için 7AAD örnek çalıştırın. Yüksek canlılığı ile örnek sadece tür hücrelerölü hücreler olarak başından (≥% 95) gelişigüzel leke olacaktır ve sıralama nüfus kirletebilir. </li><li> Dört nüfus toplamak tür kararlar ayarlayın: CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 düşük; CD19 + / CD34 - / CD45 med ve CD19 + / CD34 - yüksek / CD45. Tüm nüfus tür kararlarında lenfosit ve çiftleri ayrımcılık kapıları ekleyin. </li><li> Sıralama ucu takunya önlemek için, filtre + + hemen sıralama ve herhangi bir kümeleme sıralama sırasında örnek oluşursa yeniden filtresi önce 40 mikron hücre süzgecinden + örnek. </li><li> Bir soğutmalı veya buz dolu bir tüp tutucu PBS içinde% 2 FBS ile kaplı toplama tüpleri (Adım 1.4) içine hücreleri sıralayın. </li><li> Sıralama tamamlandıktan hemen sonra, DNA ayıklayın. </li></ol>

<ol><li>Song, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+tissue-specific+differentially+methylated+regions+%28TDMs%29+with+differential+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Association of tissue-specific differentially methylated regions (TDMs) with differential gene expression.</a> PNAS. 102 (9), 3336-3341 (2005).</li>
<li>Ohgane, J., Yagi, S., Shiota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+The+DNA+methylation+profile+of+tissue-dependent+and+differentially+methylated+regions+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: The DNA methylation profile of tissue-dependent and differentially methylated regions in cells.</a> Placenta. 29 (S), 29-35 (2008).</li>
<li>Brown, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sequential+determination+model+of+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The sequential determination model of hematopoiesis.</a> Trends Immunol. 28 (10), 442-448 (2007).</li>
<li>Clark, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+subsets+in+normal+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte subsets in normal bone marrow.</a> Blood. 67 (6), 1600-1606 (1986).</li>
<li>Loken, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+human+bone+marrow.+II.+Normal+B+lymphocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of human bone marrow. II. Normal B lymphocyte development.</a> Blood. 70 (5), 1316-1324 (1987).</li>
<li>Caldwell, C. W., Poje, E., Helikson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+precursors+in+normal+pediatric+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">B-cell precursors in normal pediatric bone marrow.</a> American Journal of Clinical Pathology. 95 (6), 816-823 (1991).</li>
<li>Tucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+cord+blood+B+cells+functionally+mature%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Are cord blood B cells functionally mature?</a> Clin. Exp. Immunol. 84 (3), 389-394 (1991).</li>
<li>Ghia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordering+of+human+bone+marrow+B+lymphocyte+precursors+by+single-cell+polymerase+chain+reaction+analyses+of+the+rearrangement+status+of+the+immunoglobulin+H+and+L+chain+gene+loci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Ordering of human bone marrow B lymphocyte precursors by single-cell polymerase chain reaction analyses of the rearrangement status of the immunoglobulin H and L chain gene loci.</a> J. Exp. Med. 184, 2217-2219 (1996).</li>
<li>Noordzij, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+of+precursor+B-cell+compartment+in+bone+marrow+from+patients+with+X-linked+agammaglobulinemia+compared+with+healthy+children%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Composition of precursor B-cell compartment in bone marrow from patients with X-linked agammaglobulinemia compared with healthy children.</a> Pediatric Research. 51 (2), 159-168 (2002).</li>
<li>van Zelm, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ig+gene+rearrangement+steps+are+initiated+in+early+human+precursor+B+cell+subsets+and+correlate+with+specific+transcription+factor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ig gene rearrangement steps are initiated in early human precursor B cell subsets and correlate with specific transcription factor expression.</a> J. Immunol. 175 (9), 5912-5922 (2005).</li>
<li>Rauch, T. A., Pfeifer, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIRA+method+for+DNA+methylation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The MIRA method for DNA methylation analysis.</a> Methods Mol. Biol. 507, 65-75 (2009).</li>
<li>Kanof, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Current Protocols in Immunology. , Suppl 19. 7.1.1-7.1.7 (1996).</li>
<li>LeBien, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+human+B-cell+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Fates of human B-cell precursors.</a> Blood. 96 (1), 9-23 (2000).</li>
<li>Schmid, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+society+for+analytical+cytology+biosafety+standard+for+sorting+of+unfixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">International society for analytical cytology biosafety standard for sorting of unfixed cells.</a> Cytometry A. 71 (6), 414-437 (2007).</li>
<li>Malaspina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+of+immature%2Ftransitional+B+cells+in+HIV-infected+individuals+with+advanced+disease%3A+correlation+with+increased+IL-7%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Appearance of immature/transitional B cells in HIV-infected individuals with advanced disease: correlation with increased IL-7.</a> PNAS. 103 (7), 2262-2267 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa etmek başka bir şey var.

Protokolün başarısı üzerinde en büyük etkiye sahip faktör enkaz kirletici varlığıdır. Bir kordon kanı bankası kanı isteyen varsa bu kanın en kısa sürede toplama sonra mümkün sevk olması önemlidir. Buna ek olarak, lenfositoz olarak sınıflandırılan örnekleri lenfositlerin yüksek sayılar içeren, ancak bu örnekler prekürsör B-hücrelerinin yeterli sayıda yoktur ve kullanılmamalıdır. Biz kordon kanı en az 85 ml ile başlayan tavsiye habercisi altkümelerini her hücrelerin yeterli sayıda elde etme olasılığını artırmak için. Bu yetişkin periferik kan ayrımları aksine, göbek kordonu kanı fractionating zaman mononükleer katmanı çoğunlukla kırmızı kan hücreleri 12 ile kontamine olduğuna dikkat etmek önemlidir. Bu protokol, kontamine trombositleri uzaklaştırmak için ilave bir yıkama aşamasını içerir. Kordon kanı mononükleer ayrımları anlatan Protokoller lizis adım t dahil öneririzİstenmeyen kırmızı hücreleri çıkarmak o. Kontaminasyonu enkaz üretir ve hücrenin tür başarısı üzerinde olumsuz bir etkisi vardır, çünkü biz bu adımı önermiyoruz. Akış sitometrisi ile ayırt edilmesi gereken hücrelerin sayısını azaltmak için, bu önceki hücre sıralama için, bir B-hücresi zenginleştirme gerçekleştirmek için gereklidir. B-Hücre İzolasyon Kiti (B KLL) eşlik Miltenyi Biotec, tarafından sağlanan protokolü periferik kan için optimize edilmiş ve 10 milyon hücre başına 10 ul B KLL biotin antikor kokteyli kullanılmasını önerir edilmiştir. , CD4 (T hücreleri), CD11b (granülositler, monositler, makrofajlar), CD16 (NK hücreleri, makrofajlar, mast hücreleri), CD36 (trombosit), CD235a (eritroid hücreler); Bu adım, CD2 (NK hücreleri, T hücreleri) karşı antikorlar kullanan göbek kordon kanı olmayan B hücreleri tüketmek. Bu, eski kit pro-B hücreleri üzerinde mevcut olan CD43 karşı bir antikor içerir, çünkü tarif edilen kit olup, B-hücre izolasyon kiti II kullanımı için çok önemlidir. Bizim op sırasındaBu protokolün timization, biz B KLL biotin antikor kokteyli 40 ul toplam bir pozitif hücre sıralama sonucu üretmek için yeterli olduğunu buldular. Ayrıca biz B KLL biotin antikor kokteyli az 5 olarak ul fazla kullanarak hücre sıralama üzerinde olumsuz etkileri olduğunu bulmuşlardır. Bu nedenle, biz çok 175-250000000 arasındaki toplam mononükleer hücre numaraları için B KLL biotin antikor kokteyli 40 ul kullanmanızı öneririz. Hücrelerin daha düşük ya da daha yüksek sayılar ile başlangıç ​​durumunda buna uygun reaktifler büyütmek için gerekli olabilir. B-hücre alt-popülasyonları ayırmak için kullanılabilecek belirteçler anlatan sayısız çelişkili yayınlar vardır. Tutarsızlık çoğu farklılaşma devam eden bir işlem olup hücre yüzey işaretleyicileri arasında varlığında veya yokluğunda tedrici bir şekilde yerine bir bütün ya da hiç bir şekilde meydana geldiği gerçeği ile açıklanabilir. / CD19 + ve CD45 + (yoğunluk düzeyini - Bu protokol CD34düşük), yüksek, orta ifade farklılaşma 6 ilerlemesini tekabül eden CD45 ekspresyonunun seviyesinde bir artış ile ön-BI, önceden II ve olgunlaşmamış B hücreleri ayırmak için kullanılmıştır. Pro-B hücreleri CD19 Bazılarına göre tarif edilmiştir + / CD34 + 13 diğerleri pro-B hücreleri CD19 olduğunu göstermiştir iken - / CD34 + ve pre-BI hücreler CD19 + / CD34 + 9,10 vardır. Bu farklar dayanarak biz geç pro-B hücreleri / erken pre-BI hücreleri CD19 + / CD34 + hücrelerin tayin etmişler. Bu stratejinin öncüsü hastalık akut lenfoblastik lösemi etkilenen hücrelere karşılık B hücrelerinin alt yalıtmak için geliştirilen dikkat etmek önemlidir. Bununla birlikte, ilgi hücre alt tipi bağlı olarak kullanılabilecektir birden fazla ayırma stratejiler vardır. Antikor-florokrom kombinasyonları kullanılabilir hücre sıralayıcı yeteneklerine göre seçilmelidir. Bir cins olarakl kural, sizin panelinde parlak florokrom en kalabalık antijen ve tersi etiketlemek için kullanılmalıdır. Özellikle çift-lekeli nüfus, bu gibi nadir olaylar belirlenmesinde, çifti ayrımcılık (Şekil 2B) yolluk stratejisinin hayati önem taşımaktadır. Bu, çift pozitif olayların antikorlar ve birbirlerine yapışık değil, sadece iki tek-boyanan hücreleri hem lekeli gerçekten tek hücre olmasını sağlar. Yüksek hız, 4-yönlü hücre sıralama mutlaka kontrollü bir aerosol ortam oluşturur. Bu nedenle, canlı insan hücre sıralama büyük bir dikkatle yapılmalıdır. Yayınlandı emniyet ve dekontaminasyon kuralları mevcuttur ve sıralama 14 önce incelenir ve uygulamaya konulmalıdır. Kurumsal Biyogüvenlik Komiteleri veya eşdeğerleri gelen Onay sıralama öncesinde gerekli olabilir. Sıralama sonra uygun arındırma için, çamaşır suyu% 10 oranında bir nihai konsantrasyon için çöp bidonu ilave edilmelidir. Similarly, tüm örnekler boru şeklinde, hem de hemen alan bütün yüzeyleri tamamen yeni hazırlanmış bir% 10 çamaşır suyu solüsyonu ile arındırılır olmalıdır. Özetle, bu protokol prekürsör B-hücrelerinin nadir nüfus elde etmek için bir strateji sağlar ve hematopoetik kök hücreleri ve T hücreleri immatür dahil kordon kanında bulunan herhangi nadir nüfusa yalıtmak için modifiye edilebilir. Son zamanlarda, immatür B hücreleri ilerlemiş HIV 15 bireylerin periferik kan tespit edilmiştir. Bu nedenle, bu yöntemin yarar kan kanseri çalışma ötesine uzanır. Son olarak, henüz akış sıralanmış hücreleri üzerinde gerçekleştirilen RNA izolasyon değil, ancak, bu yöntem, hücre sırasında hücreler RNeasy kiti trizol ya da bu gibi RLT eşdeğer bir RNA uyumlu bir çözelti içine doğrudan sıralanması sıralamak uyarı ile uyumlu olmalıdır Qiagen aracılığıyla kullanılabilir.

Hastalık mevcut olan sapmaları tespit etmek amacıyla, sağlıklı dokuların ya da hastalıktan etkilenen doku ya da hücre tipine karşılık gelen hücreleri kullanılan son derece önemlidir. Bunun bir nedeni, doku tipleri arasındaki epigenetik varyasyon gen ekspresyonu düzenleyen sorumludur ve normal insan gelişiminin 1,2 sırasında hücresel farklılaşma için kritik olmasıdır. İkinci nedeni aberran doku spesifik gen regülasyonu normal gelişim korkunç sonuçlara neden olabilir ve kanser gibi hastalık durumları çok sayıda katkıda bilinir. Bu nedenle, hematopoietik hücreler içeren bir hastalık daha iyi anlaşılması sağlıklı hematopoietik hücrelerin bilinmesini gerektirir. Hücre yüzeyi ekspresyonu değişiklikleri ile karakterize edilen olayların sistematik bir düzen vasıtasıyla kemik iliği hematopoetik gelir hücrelerin gelişimi 3 markers. Yetişkin katılımcılar ile ilgili çalışmalar varPediatrik katılımcılar içeren çalışmalar prekürsör B-hücrelerinin yüzdesinin az 5 yaş 6 bireyler nispeten yüksek olduğunu göstermiştir iken; kemik iliği genellikle B-hücrelerinin 4,5 habercisi olarak düşük sayıda içerdiğini göstermiştir. Umbilikal kordon kanı, kan ile ilgili bozukluklar ve maligniteler tedavisinde hematopoietik kök hücre kaynağı olarak kullanılan kordon kanı bankalarının aracılığı ile kolay ulaşılabilir ve hedef lösemi olmak üzere birçok hastalıkların hücre ve olan immatür B ve T hücreleri 7 zenginleştirilmiştir edilir lenfomalar. Kemik iliği içinde Prekürsör B-hücrelerinin yaygın olarak 8,9 phenotyped edilmiştir ve ayrı alt bu hücrelerin sıralamak için kullanılan spesifik hücre yüzey işaretleyicileri arasında bulunması ile tanımlanır. Normal B-hücre farklılaşması erken pro-B hücreleri ile başlayan ve olgunlaşmamış ya da naif B hücrelerinin sonuçlanan kemik iliğinde aşamalarında bir dizi ilerler. Görevan Zelm ve meslektaşları 10, pro-B hücreleri CD34 varlığı ve evre 2 geçiş (Pre-BI) olarak CD19 kazanılır karakterizedir. 3. Aşama (Ön BII) hücreler artık CD34 ekspres ve sitoplazmik IgM ifade etmeye başlayacak. Nihayet, evre 4 bir belirleyici özelliği (B hücreleri immatür) yüzey IgM ifadesidir. Bu protokolü açıklanan sıralama stratejisi ilk Caldwell ve arkadaşlarının 6 tarafından tanımlanan ve büyük ölçüde karmaşıklığı ve hücre sıralama deneyler gerçekleştirme maliyetini düşürür sadece 3 hücre yüzey belirteçlerinin kullanımını içerir edildi. Onların çalışmasında, CD45 arasında bir ilişki ve B-hücre farklılaşması aşamaları kurulmuştur. Bunlar kemik iliği, B-hücreleri CD45 ekspresyonu değişken düzeyleri görüntülemek görülmektedir. Özel olarak, yüksek düzeyde CD45 hücrelerinin yüzeyinde ifade edilen IgM ifade hücreleri (B-hücreleri olgunlaşmamış) karşılık olarak, CD45, orta derecede ifade edilen, bu cytopl ifade hücreler denkasmic IgM (pre-BII hücreleri), ve CD45 düşük seviyelerde ifade olanların (pre-BI hücreleri) sitoplazmik IgM ifade vermedi hücreleri karşılık geldi. Bu protokol, örneğin metil-, CpG adası iyileşme testi gibi, yüksek kaliteli nükleik asit gerektiren alt-metodlarda kullanılan göbek bağı kanı (Şekil 1), B-hücrelerinin (MIRA haberci alt kümeleri izole etmek için Caldwell ve arkadaşları tarafından geliştirilen 6 strateji kullanır ) 11 ve kantitatif gerçek zamanlı PCR. Yöntemi göbek kordon kanı dışındaki tüm B hücreleri tüketmek için manyetik boncuklar kullanarak ilk ayrılık istihdam ediyor ve sadece 3 antikorlar (CD34, CD19 ve CD45) ile boyanarak gerektirir. Kurtarıldı hücreleri B-hücre farklılaşması 4 aşamaları temsil: 1) CD34 +, CD19 + (geç pro-B ve pre-BI erken); 2) CD34 -; CD19 +, CD45 düşük (geç ön-BI); 3) CD34 -; CD19 +, CD45 med (pre-BII) ve 4) CD34 -; CD19 +; CD45 yüksek (immatür B hücreleri).

<table><tbody><tr><td>DPBS (1X)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>LS Sütun</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS Çok Ayaklı</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS Ayırıcı</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>B-Hücre İzolasyon Kiti (B CLL)</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-660</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>ATLANTA Biologicals</td><td>S11195</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpü (1.5 ml)</td><td>MIDSCI</td><td>SS1500</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoaktinomisin D)</td><td>BD Biosciences</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>DB Pharmingen APC Fare Anti-İnsan CD19</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>555415</tr><tr><td>DB Pharmingen PE Fare Anti-İnsan CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>560941</td><td></td></tr><tr><td>CD45 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>347463</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Durulama Çözeltisi</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Stok Çözümü</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 5 ml Polistiren Yuvarlak Tabanlı Boru</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 50 ml Tüp</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>PuraFlow Kılıf Sıvısı, 8X</td><td>Beckman Coulter</td><td>CY30230</td><td></td></tr><tr><td>FlowCheck Hizalama boncukları</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605359</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Gökkuşağı Hizalama boncukları</td><td>Spherotech</td><td>URFP-30-2</td><td></td></tr><tr><td>ViroSafe Aerosol Tahliye Filtresi</td><td>Beckman Coulter</td><td>ML01330</td><td></td></tr><tr><td>ABC Fare boncuk kiti</td><td>Invitrogen</td><td>A-10344</td><td></td></tr><tr><td>40 & mu; m hücre süzgeci</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Hemositometre</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>accuSpin Model 3R Tezgah Üstü Santrifüj</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-516</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo XDP akış Sitometresi</td><td>Beckman Coulter</td><td>ML99030</td><td></td></tr><tr><td>Aerosol Tahliye Ünitesi</td><td>Beckman Coulter'ın fotoğrafı.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kordon kanı gelen prekürsör b-hücreli altkümeleri İzolasyonu

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Göbek kordon kanı çok farklı soy bağlılığı aşamalarında hematopoetik progenitör hücreler için zenginleştirilmiştir. Biz B-hücrelerinin farklılaşma dört farklı aşamalarında öncüsü izole etmek için bir protokol geliştirmiştir. Genlerin ifade ve epigenetik değişiklikler bir doku belirli bir şekilde meydana Çünkü, bu genomu ve hastalığın gelişmesine yol açabilir epigenom değişiklikler tespit edebilmek amacıyla doku ve hücre tipleri arasında ayrım önemlidir. Bu yöntem, ayırt herhangi bir aşamasında, göbek kordonu kanı hücre içinde mevcut herhangi bir tür için adapte edilebilir. Bu yöntem, 4 temel aşamalarını kapsamaktadır. İlk olarak, mononükleer hücreler yoğunluk santrifüj ile ayrılır. İkinci olarak, B-hücreleri mononükleer hücrelerden non-B-hücreleri tanımak ve çıkarmak biyotin konjuge antikor kullanılarak zenginleştirilmiştir. Üçüncü olarak, B-hücrelerinin fluoresan ayrı aşamalara spesifik hücre yüzeyi proteini antikorları ile etiketlenmiştirB hücre gelişimi. Son olarak, floresan işaretli hücrelerin sıralanır ve bireysel nüfus geri kazanılır. Geri kazanılan hücreler aşağı nükleik asit tahlillerde kullanılmak için yeterli miktar ve kalitede.

Örnek arası varyasyon hücre tür (Tablo 1) başarısında bir rol oynar. Iyi başarı oranları ile örnekleri kontamine enkaz düşük seviyelerde (Şekil 3A) sahip ve düşük başarı oranları ile örneklerin kontamine enkaz yüksek düzeyde (Şekil 3B) var. Kordon kanı örneği gönderi 24 saat (O / N öncelikli) bünyesinde toplandı eğer numune arasındaki varyasyon biraz kontrol edilebilir. Her prekürsör B-hücre alt gelen akış sıralanmış hücreleri yeterli miktar ve nükleik asit izolasyonu gerçekleştirmek kalitede. Izole edilen DNA, yüksek kaliteli ve aşağı analizlerinde kullanılabilir. Biz rutin denatüre DNA (Şekil 4) için zenginleştirmek MIRA 11 bu DNA kullanır. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Kordon Kanı Tesis Veri </td><td> Kötü sırala </td><td><strong&gt; İyi sırala </td></tr><tr><td> Antikoagülan Çalışma Kan Hacmi (ml) </td><td> 110 </td><td> 104 </td></tr><tr><td> Beyaz Kan Hücreleri [10 3 / ul] </td><td> 8.68 </td><td> 11.19 </td></tr><tr><td> Lenfositler [10 3 / ul] </td><td> 3.88 </td><td> 3.76 </td></tr><tr><td> Lenfosit (%) </td><td> 44.70 </td><td> 33.6 </td></tr><tr><td> Kırmızı Kan Hücreleri [10 6 / ul] </td><td> 3.65 </td><td> 3.05 </td></tr><tr><td colspan="3"> In-house Veri </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque sonra Hücre Sayısı </td><td> 206 M </td><td> 309 M </td></tr><tr><td> MACS Ayrılık sonrası Hücre Sayısı </td><td> 22 M </td><td> 16,5 M </td></tr><tr><td> Toplam Etkinlik Sayısı (MoFlo XDP) </td><td> 30.57 M </td><td> 19,97 M </td></tr><tr><td> Canlılığı (%) </td><td> 98.00 </td><td> 98.00 </td></tr><tr><td> Lenfosit Gate Hücreleri (%) </td&gt; <td> 17.00 </td><td> 50.00 </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 + </td></tr><tr><td> Toplam Hücre Sayısı </td><td> 10959 </td><td> 48316 </td></tr><tr><td> Toplam Etkinlik% </td><td> 0.04 </td><td> 0.24 </td></tr><tr><td> Verim </td><td> 88% </td><td> 88% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - düşük / CD45 </td></tr><tr><td> Toplam Hücre Sayısı </td><td> 16619 </td><td> 26941 </td></tr><tr><td> Toplam Etkinlik% </td><td> 0.05 </td><td> 0.13 </td></tr><tr><td> Verim </td><td> 89% </td><td> 87% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 med </td></tr><tr><td> Toplam Hücre Sayısı </td><td> 469745 </td><td> 507540 </td></tr><tr><td> Toplam Etkinlik% </td><td> 1.54 </td><td> 2.54 </td></tr><tr><td> Verim </td><td> 89% </td><td> 89% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - yüksek / CD45 </td></tr><tr><td> Toplam Hücre Sayısı </td><td> 1896062 </td><td> 2047142 </td></tr><tr><td> Toplam Etkinlik% </td><td> 6.2 </td><td> 10.25 </td></tr><tr><td> Verim </td><td> 91% </td><td> % 90 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Örnek hücre sıralama istatistikleri. Satırlar 1-5 kordon kanı tesisi tarafından sağlanan sayıları vardır. Kalan satırların laboratuar toplanan veriler vardır. Yoksul çeşit enkaz yüksek düzeyleri ve lenfosit kapısı hücrelerin düşük bir oranda yer. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig1.jpg" /> Figu1 yeniden. Prosedürün Akış şeması. Göbek kordon kanı işlenir ve mononükleer hücreler Ficoll-Paque plus kullanılarak izole edilmiştir. Ek bir yıkama adımından kirletici trombositleri uzaklaştırmak için eklenmiştir. B-hücreleri MACS insan B-hücresi izolasyon kiti (B-CLL) kullanılarak mononükleer hücreler izole edilmiştir. Bu adım, tüm non-B hücreleri çıkarmak için (CD2, CD4, CD11b, CD36, anti-IgE ve CD235a) biotin-konjuge monoklonal antikorlar kullanır. Kurtarılan B-hücreleri daha sonra prekürsör B-hücre alt kurtarmak için MoFlo XDP akış sitometresi kullanılarak sıralanır CD19-APC, CD34-PE ve CD45-FITC antikorlar ile etiketlenir: CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 düşük ; CD19 + / CD34 - / CD45 med ve CD19 + / CD34 - yüksek / CD45. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50402/50402fig2.jpg" /> Şekil 2. Pop belirleme ve sıralama için gating stratejisiulations. Kırmızı oklar sonraki arsa uygulanır kapısı gösterir. R4, R5, R6 ve R7&#39;nin kapıları kriteri popülasyonları göstermektedir. A) ileri vs zenginleştirilmiş lenfosit popülasyonu yan dağılım gösteren bir arsa. R1, lenfosit kapısı. B) Yükseklik vs tek hücre karşısında çiftler belirlenmesi için forward scatter plot genişliği. R2, tek bir hücre kapısı. C) CD19-APC pozitif hücreler CD34-PE pozitif ve negatif popülasyonları içine düşmek. R3, CD19 + / CD34 - kapısı; R4, CD19 + / CD34 + kapı belirten istenen tür nüfus d) CD19 + / CD34 - hücreleri üç biraz farklı CD45-FITC nüfus girer.. R5 ve R6, CD19 + / CD34 + / - düşük CD45 ve CD19 + / CD34 + / - CD45 med popülasyonları, sırasıyla. R7, çünkü CD19 + / CD34 yüksek hücre sayıları arasında - yüksek nüfus / CD45, bu tür kapı sadece kapsarnüfusun bir bölümü. Bu nüfusun tüm hücreler aşağı analizler için toplanan gerekmez. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig3.jpg" /> Şekil 3 a.) Sütun zenginleştirme sonrası enkaz kirletici Düşük seviyede. R1, lenfosit kapısı. B) sütununda zenginleştirme sonrası enkaz kirletici düzeylerini yüksek. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/50402/50402fig4.jpg" /> Şekil 4. Prekürsör B-hücrelerinin kümelerine denatüre DNA Zenginleştirme. Prekürsör B-hücre alt grupları izole) sonicated DNA yüksek kalitede. Kütüphane yapımı DNA için 200-600 bp bir ortalama sonicated edilir. Lane 1: Promega 100 bp ladder (katalog # G2101); Lane 2: izole Toplam DNA CD19 gelen + / CD34 + hücreleri; Lane 3: CD19 izole Toplam DNA + </sup&gt; / CD34 - / CD45 düşük hücrelerin; Lane 4: CD19 + / CD34 izole 100 ng DNA - / CD45 med hücreleri; Lane 5: CD19 + / CD34 izole 100 ng DNA - / CD45 yüksek hücreler. DNA 9 dk (; 30 sn OFF 30 sn) toplam on High Diagenode Bioruptor kullanılarak sonike edildi. DNA sütun saflaştırılmış ve SYBR yeşil nükleik asit jel leke ile% 1 agaroz jel üzerinde görselleştirilebilir. B) MIRA ActivMotif MethylCollector Ultra kiti, SLC25A37 ile PCR (1-6) ve APC1 (7-12) kullandıktan sonra onaylamak için yapılır denatüre DNA zenginleştirme. 1 &amp; 7: sonicated genomik DNA (hayır MIRA); 2 ve 8: MIRA-CD19 + / CD34 + DNA; 3 ve 9: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 düşük DNA; 4 &amp; 10: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 med DNA; 5 &amp; 11: MIRA -CD19 + / CD34 - / CD45 yüksek DNA; 6 ve 12: Su kontrolü. SLC25A37 daha yüksek amplifikasyon metil DNA zenginleştirme teyitprekürsör B-hücrelerinin alt gruplarında.

Burada göbek kordon kanı habercisi alt B-hücreleri izole etmek için bir protokol açıklar. Nükleik asitlerin yeterli bir miktarı ve kalitesi hücrelerinden çıkarılır ve DNA ya da RNA kullanılarak daha sonraki deneylerde kullanılabilir.

Kordon Kanı gelen Prekürsör B-hücreli altkümeleri İzolasyonu

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Bu prosedürün genel amacı, göbek kordonu kanından öncül B hücresi alt kümelerini izole etmektir. Bu işlem, öncelikle yoğunluk gradyanı santrifügasyonu ile kordon kanından mononükleer hücrelerin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, geri kalan B hücresi dışındaki hücrelerin manyetik olarak uzaklaştırılması için hücre yüzeyi antijenleri biotin konjuge antikorlar ile işaretlenir.Ardından, izole edilen B hücreleri CD 19, CD 34 ve CD 45 hücre yüzey antijenlerine karşı antikorlarla floresan işaretlenir. Son adımda, öncül B hücresi alt gruplarını geri kazanmak için hücreler akış sitometrisi ile ayrıştırılır. Nihayetinde, yüksek kaliteli DNA ve RNA gerektiren sonraki analizlerde kullanılmak üzere yeterli sayıda ve kalitede hücre elde edilebilir.Hücre ayıklama stratejisinin alternatif yöntemlere göre bir avantajı, stratejimizin akış sitometresinde daha az zaman gerektirmesi ve yalnızca üç floresan antikor kullanmasıyla deney maliyetini büyük ölçüde düşürmesidir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, göbek kordonu kan hücrelerini akış sitometrisi için hazırlamaya yönelik mevcut yöntemlerin çeşitliliği ve akış sitometresinin hazırlık sürecinin karmaşıklığı nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Bu yöntem sağlıklı öncül B hücreleri hakkında bilgi sağlayabilse de, T hücreleri gibi göbek kordonu kanında bulunan diğer hücre tiplerine veya lösemi veya lenfoma gibi herhangi bir hematopoetik hücreyi içeren hastalık çalışmalarına da uygulanabilir.Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir çünkü göbek kordonu kanının ve hücrelerinin, hücre canlılığını maksimize edecek ve kontamine kalıntıların varlığını azaltacak şekilde işlenmesi için gereken uygun teknikleri tarif etmek zordur. Göbek kordonu kanından mononükleer hücreleri izole etmek için öncelikle kordon kanının 8 mL'lik alikotlarını 24 mL DPBS ile seyreltin. Ardından, her bir seyreltilmiş kan karışımını, katmanların ayrı kalmasına dikkat ederek, 50 mL'lik konik tüplerdeki 15 mL'lik fipashplus alikotlarının üzerine yavaşça ekleyin.Ardından, hücreler yoğunluk gradyanı ile ayrılırken kanı 400 ×g ve 20 °C'de 40 dakika boyunca santrifüjleyin; bu sırada tabloda belirtildiği üzere yedi adet 50 ml'lik yuvarlak tabanlı tüpü örnek kimliği, tarih ve diğer uygun bilgilerle etiketleyin. Ayrışmanın ardından, mononükleer hücreler plazma ile opak arayüzde kalacak, granülositler ve eritrositler ise çökecektir; şimdi mononükleer hücre katmanlarına temas etmeden üst plazma katmanlarını aspire edin. Daha sonra, 10 ml'lik bir cam pipet kullanarak üç adet 50 ml'lik tüpteki mononükleer hücre katmanlarını dikkatlice tek bir yeni 50 ml'lik tüpe toplayın.Bu yeni tüpü PBS ile doldurun, hücre süspansiyonunu nazikçe karıştırın ve ardından hücreleri 300 ×g'de ve 20 °C'de 10 dakika boyunca iki kez yıkayın. İlk yıkamanın ardından, peletleri yeniden süspande edin ve tek bir 50 mL'lik konik tüpe aktarın. İkinci yıkamadan sonra, hücre peletini 200 µL PBS içinde nazikçe yeniden süspande edin ve sayım işlemi için hücre süspansiyonundan 1 µL'yi, 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpündeki 1 mL PBS'ye aktarın.Ardından, 50 mililitrelik tüpteki hücreleri daha fazla PBS ile yıkayın ve pellet'e zarar vermeden süpernatantı tamamen uzaklaştırın. B hücrelerini mononükleer hücrelerden izole etmek için, yeni yıkanmış pellet'i 160 mikrolitre 4 °C'de taze hazırlanmış DGAs E-D-T-A-P-B-S tamponu içerisinde yeniden süspanse edin.Ardından, hücre süspansiyonu ile B-cell isolation kit, bio ITIN antikor kokteylinin 40 µL'sini karıştırın. Hücreleri 4 °C'de 10 dakika inkübe ettikten sonra, her 10 milyon hücre için 1 mL 4 °C E-D-T-A-P-B-S tamponu kullanarak serbest antikoru yıkayarak uzaklaştırın. Daha sonra hücre peletini 320 µL 4 °C E-D-T-A-P-B-S tamponu içerisinde yeniden süspande edin.Şimdi, dört derece santigrat sıcaklıkta 15 dakikalık inkübasyonun ardından, hücre süspansiyonu ile 80 µL anti-biotin mikroboncukları karıştırın. Hücreler santrifüj edilirken hücreleri tekrar yıkayın. Bir LS kolonunu bir max separatörün manyetik alanına yerleştirin ve kolon üzerinden üç mL dört derece santigrat sıcaklıkta E-D-T-A-P-B-S tamponu damlatın.Ardından, yıkanmış hücrelerin 100 milyona kadar olan kısmını 500 µL 4 °C E-D-T-A-P-B-S tamponunda yeniden süspande edin. Daha sonra hücre süspansiyonunu kolona pipetleyin ve kolondan geçen işaretlenmemiş hücreleri 50 mL'lik konik bir tüpte toplayın. Orijinal konik tüpün duvarlarına, her seferinde 1 mL olacak şekilde toplamda 2 mL daha 4 °C E-D-T-A-P-B-S tamponu ekleyin ve ardından tüm hücreleri geri kazandığınızdan emin olmak için her seferinde hafifçe karıştırıp kalıntı hücre süspansiyonunu kolona pipetleyin.Son olarak, işaretlenmemiş hücrelerin bulunduğu konik tüpü PBS ile doldurun. Santrifüj işleminden sonra, hücre peletini bozmadan süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın. Ardından, hücreleri 200 µL E-D-T-A-P-B-S tamponu içerisinde nazikçe yeniden süspanse edin.Antikor işaretleme işlemine başlayın. İlk adım olarak, hücre süspansiyonundan bir mikrolitre miktarını daha önce etiketlenmiş olan boyanmamış tüpe aktarın. Tüpe 500 mikrolitre E-D-T-A-P-B-S tamponu ekleyin ve buz üzerinde muhafaza edin.Tüm ışıkları kapatın ve ardından kalan hücre süspansiyonuna 1 milyon hücre başına 20 µL CD 19, CD 34 ve CD 45 antikorlarının her birinden ekleyin. İyice karıştırın ve tüpü oda sıcaklığında 30 dakika boyunca karanlıkta bekletin. Daha sonra, antikorla işaretlenmiş hücre süspansiyonundan 40 µL'yi A'dan D'ye kadar etiketlenmiş yedi tüpe aktarın.Hücreleri 1 mL PBS ile yıkayın ve ardından çökeleği 100 µL bağlama tamponu içinde yeniden süspanse edin. Bu hücrelere 7 µL seven A a d ekleyin ve hücreler seven A a d ile işaretlenirken oda sıcaklığında, karanlıkta 10 dakika inkübe edin. Antikorla işaretlenmiş hücrelerin bulunduğu tüpü PBS ile tamamlayın, antikorla işaretlenmiş hücreleri yıkayın ve ardından çökeleği 500 µL E-D-T-A-P-B-S tamponu içinde yeniden süspanse edin. Şimdi, antikorla işaretlenmiş hücre süspansiyonunun tüm hacmini CD 19 pozitif CD 34 pozitif CD 45 pozitif işaretli tüpe aktarın.Tüpü bir mililitre daha E-D-T-A-P-B-S tamponu ile durulayın ve kalıntı hücre süspansiyonunu CD 19 pozitif CD 34 pozitif CD 45 pozitif etiketli tüpe aktarın. Son olarak, hücreleri MO flow XDP akış sitometresi kullanarak ayırmak için yedi A a D tüpüne 300 mikrolitre bağlama tamponu ekleyin. Önce MO flow cihazını ayıklama için kurun, uygun kompanzasyon kontrollerini çalıştırın ve ardından bu şekilde gösterilen grafiklerini içeren bir protokol oluşturun.Aerosol tahliye sisteminin her zaman çalıştığından emin olun ve ardından ileri ve yan saçılım grafikleri için voltaj ve kazancı ayarlamak amacıyla boyanmamış örneği kullanın. Negatif floresan popülasyonlarını tanımlamak için, DNA içeren herhangi bir debris'nin geri kazanılan örnekleri kontamine etmemesi için eşiği %1'e eşit veya daha düşük olacak şekilde ayarlayın.CD 19 pozitif CD 34 pozitif CD 45 pozitif örnekle yaklaşık 50.000 olay saydırın. Gating stratejisini, az önce gösterildiği gibi, seçilmemiş CD 19 pozitif CD 34 pozitif popülasyonunu yan saçılım (side scatter) karşıt ön saçılım (forward scatter) grafiğine geri yansıtarak (back gating) ayarlayın. Bu işlem, lenfosit gating'inin potansiyel pro B hücrelerini kapsadığından emin olmak içindir.Bu örneği, aynı zamanda 7-AAD boyaması için negatif floresan popülasyonunu belirlemek amacıyla kullanın. Ardından, örnek canlılığını belirlemek için 7-AAD örneğini çalıştırın; ölü hücreler ayrım gözetmeksizin boyanacağı ve sıralama popülasyonlarını kontamine edebileceği için, başlangıçta canlılığı %95 veya daha fazla olan bir örnekten hücre sıralaması yapın. Şimdi, şu dört popülasyonu toplamak üzere sıralama kararlarını ayarlayın: CD19 pozitif, CD34 pozitif; CD19 pozitif, CD34 negatif, CD45 düşük; CD19 pozitif, CD34 negatif, CD45 orta ve CD19 pozitif, CD34 negatif, CD45 yüksek.Tıkanmaları önlemek için tüm popülasyonların sıralama kararlarına lenfosit ve dublet ayrım kapılarını (gates) dahil edin. Sıralama ipucu olarak, CD 19 pozitif CD 34 pozitif CD 45 pozitif örneği, sıralamadan hemen önce 40 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin. Ardından, PBS içinde %2FBS ile kaplanmış etiketli toplama tüplerini buz dolu bir tüp tutucuya yerleştirin ve sıralama tamamlandıktan hemen sonra hücreleri uygun toplama tüpüne sıralayın.Örnek varyasyonu hücre başarısında rol oynadığından, DNA'yı iyi bir ayıklama ile ekstrakte edin. Lenfosit kapılamasında yüksek oranla hücre bulunmaktadır. Başarı oranları yüksek olan örnekler, kapılan lenfosit popülasyonunun altında ve solunda kalan olay sayısının azlığının kanıtladığı üzere, düşük seviyelerde kontamine debris içerir.Düşük başarı oranına sahip örnekler, yüksek seviyelerde kontamine kalıntı içerir. Kalitesiz örneklerde bu olaylarda belirgin bir artış görülür. Akışla ayrıştırılan hücreler ve ardından her bir öncül B hücresi alt kümesinden izole edilen DNA, alt analizleri gerçekleştirecek miktar ve kalitededir.Bu DNA'yı, CD 19 pozitif CD 34 pozitif hücrelerden, CD 19 pozitif, CD 34 negatif CD 45 düşük hücrelerden, CD 19 pozitif, CD 34 negatif CD 45 orta hücrelerden ve CD 19 pozitif CD 34 negatif CD 45 yüksek hücrelerden izole edilen metillenmiş DNA'yı zenginleştirmek için Myra'da rutin olarak kullandık. Bu hücreler toplam dokuz dakika boyunca yüksek ayarda sonikasyona tabi tutuldu, kolonla saflaştırıldı ve ardından %1 agaroz jel üzerinde Cygrreen nükleik asit jel boyası ile görselleştirildi. Bu şeritte, kontrol olarak 100 baz çiftlik bir merdiven de yürütüldü. Metillenmiş DNA'nın zenginleşmesini doğrulamak için, aktif motif yöntemi Collector Ultra Kit PCR'ı kullanılarak kontrol metillenmiş SLC 25 A 37 ve kontrol metillenmemiş APC 1 genleri ile çalışma gerçekleştirildi.SLC 25. A 37'nin daha yüksek amplifikasyonu, öncül B-hücresi alt kümelerindeki metillenmiş DNA zenginleşmesini doğrular. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütüldüğü takdirde 10 saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, hücrelere çok nazik davranılması ve kontamine debris oluşumunu en aza indirmek için optimize edilmiş miktarda antikor kullanılması önemlidir.Hangi genlerin metillendiği ve öncül B hücresi alt kümeleri gibi ek soruları yanıtlamak için yeni nesil dizileme gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Canlı insan hücreleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedür gerçekleştirilirken aerosol tahliye sistemi çalıştırmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

isolation-of-precursor-b-cell-subsets-from-umbilical-cord-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada ilk iyi üretim uygulamaları (GMP) uyumlu göbek kordon kanı, ağırlıklı naif T hücrelerinin kaynağı virüs-spesifik sitotoksik T lenfositler (CTL) üretme yöntemi açıklar.

Kordon Kanı adlı Sitotoksik T lenfositler genişletilmesi olduğunu Hedef Sitomegalovirüs, Epstein-Barr Virus ve Adenovirüs

Video, immünomanyetik hedefleme ve periferik kan mononükleer hücre süspansiyonundan ayırma yoluyla B hücrelerini saflaştırmanın bir yolunu açıklıyor. Yöntem, istenmeyen hücre tiplerinin, manyetik ayırma yoluyla heterojen hücre süspansiyonundan tükenecek olan spesifik hücre yüzey proteinlerini hedefleyen spesifik antikorlar veya ligandlar (manyetik parçacıklara bağlı) ile etiketlenmesini içerir.

Negatif İmmünomanyetik Seçim: Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden B Hücrelerini Saflaştırmak İçin Bir Yöntem

Bu videoda, B olmayan hücrelere özgü biyotinile antikorlar ve streptavidin konjuge manyetik mikro boncuklar kullanarak B hücrelerinin insan periferik kanından izolasyonunu gösteriyoruz.

İnsan Periferik Kanından B Hücrelerinin İzolasyonu ve Saflaştırılması

Bu videoda, insan bağışıklık sistemi (HIS) fareleri oluşturmak için bir teknik gösterilmektedir. CD34+ hematopoetik kök hücreler (HSC'ler), antikor kaplı manyetik boncuklar kullanılarak insan kordon kanı buffy coat hücrelerinden izole edilir. CD34+ HSC'ler, sitokinlerle zenginleştirilmiş ve kriyoprezervasyonlu bir büyüme ortamında genişletilir. Son olarak, çözülmüş HSC'ler, HIS fare modelini oluşturmak için immün yetmezliği olan bir fare yavrusuna enjekte edilir.

İnsan Bağışıklık Sistemi Fareleri Oluşturmak için Kordon Kanı Hematopoetik Kök Hücrelerinin İzole Edilmesi

Burada, yakın zamanda gösterdiğimiz gibi, ekstratimik bir αβ T hücresi progenitörü olan periferik Vδ1+CD4+ T hücrelerinin kıt T hücresi varlığının izolasyonu ve klonlanması için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu teknik, bu hücrelerin ex vivo kültürde kantitatif olarak izole edilmesine, klonlanmasına ve verimli bir şekilde genişletilmesine izin verir.

İzolasyon ve<em&gt; Ex Vivo</emVδ1 of&gt; Kültür<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T hücrelerinin bir Extrathymic αβT hücre Progenitör

İnsan periferik kanı, humoral immün yanıtın değerlendirilmesi için yaygın olarak kullanılır. Burada, insan B hücrelerini periferik kandan izole etme, insan B hücrelerini kültürde antikor (Ab) salgılayan B hücrelerine (ASC'ler) ayırma ve bir ELISpot testi ile toplam IgM ve IgG-ASC'leri numaralandırma yöntemleri açıklanmaktadır.

İzolasyon, Farklılaşma ve Niceleme İnsan Kanı B Hücreleri Antikor salgılayan: ELISPOT Hümoral Bağışıklık bir Fonksiyonel Göstergesi&#39;nin olarak

Bu iletişim kuralının amacı göbek kordon kanı endotelyal progenitor hücrelerini izole etmektir. Bazı uygulamalar bu hücreler bir biyomarker hastaların kardiyovasküler riski ile iskemik hastalıklar, tedavi tanımlamak için kullanmayı içerir ve oluşturma doku Mühendisliği vasküler ve kalp kapak oluşturur.

Yalıtım endotelyal Progenitor Hücre insan göbek kordon kanı

Megakaryocytes son derece saf bir nüfusa kablosunu elde edilebilir kan kaynaklı CD34+ hücreleri. CD34 için bir yöntem+ hücre izolasyon ve megakaryocyte farklılaşması burada açıklanmıştır.

Kordon kan kaynaklı CD34 megakaryocyte farklılaşma ve trombosit oluşumu insan+ hücreleri

Burada, dört miyeloid soya immünotipik karakterizasyon ve sitokin kaynaklı cd34+ hematopoetik kök ve ataat hücrelerinin farklılaşması için bir protokol sıyoruz. Bu protokolün uygulamaları cd34+ hücrelerin miyeloid farklılaşması üzerinde miyeloid hastalık mutasyonları veya küçük moleküllerin etkisi üzerine araştırmalar içerir.

İnsan Kordon Kanı Kaynaklı CD34 Pan-miyeloid Farklılaşması+ Hematopoetik Kök ve Progenitor Hücreleri

Periferik kan mononükleer hücrelerinin Sézary Sendromu tanısı alan hastalardan elde edilen tam kandan izole edilmesi, ardından CD4 + T hücrelerinin seçimi, forbol12-miristat13-asetat ve A23187 iyonofor ile uyarılmaları ve transkriptomik profilleme için RNA'nın hazırlanması için basit bir protokol sunuyoruz.

Transkriptomik Profilleme için İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin ve CD4 + T hücrelerinin Sézary Sendromu Hastalarından İzole Edilmesi

Bu protokol, biyobankacılık ve diğer amaçlar için insan periferik kan mononükleer hücrelerini izole etmek için yüksek verimli otomasyonla uyumlu bir yöntemi detaylandırır.

İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin Buffy Coats'tan Yüksek Verimli İmmünomanyetik Boncuk Ayırma ile İzole Edilmesi

Öğrenin, kordon kanından prekürsör B-hücre alt kümelerini izole etme yöntemini. Yoğunluk gradyanı santrifüjasyon, manyetik ayrıştırma ve akış sitometrisi kullanılarak yüksek kaliteli nükleik asit elde edilir.

Kordon Kanı gelen Prekürsör B-hücreli altkümeleri İzolasyonu

Daha fazla video keşfet