Ekson yakalama ve Devasa Paralel Dizilimine tarafından Tümör Örneklerinin somatik genetik değişiklikler tespit

Bu prosedürün genel amacı, barkodlu çoğullanmış, DNA kütüphaneleri ve ardından büyük ölçüde paralel dizileme kullanarak tümör dokusundan alınan hücrelerin kanserle ilişkili genlerindeki somatik mutasyonları tanımlamaktır. Bu, ilk olarak korunmuş tümörlerden izole edilen DNA parçalarına barkodlu dizileme adaptörlerinin bağlanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, 279 onkogenin ve tümör baskılayıcı genlerin tüm protein kaplama ekzonlarını tamamlayan özel biyotinile oligonükleotidlere hibridizasyondur.

Üçüncü adım, yakalanan kitaplıklardan barkodlu havuzların büyük ölçüde paralel sıralamasını gerçekleştirmektir. Son adım, hedeflenen 279 gen için kanserle ilişkili değişiklikler için dizi verilerini aramaktır. Bu prosedür, dizi mutasyonlarını, küçük eklemeleri, küçük delesyonları, kopya sayısı değişikliklerini ve yapısal değişiklikleri seçebilir.

Bu nedenle, bu tekniğin mevcut yöntemlere göre ana avantajları, hem yaygın hem de nadir mutasyonlar için tüm ekzonların araştırılmasına izin vermesinin yanı sıra, kopya sayısı kayıpları ve kazançları gibi ek genomik değişiklikleri tanımlamasına ve heterojen Örneklerde daha fazla hassasiyet elde etmesine izin vermesidir. Bu yöntem, çeşitli kanser türlerinde temel itici mutasyonların neler olduğu ve klinik örneklerdeki bu mutasyonların sonuçlarla veya hedefe yönelik tedavilere verilen yanıtla ilişkili olup olmadığı gibi kanser genomiği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, kanserin tanı ve tedavisine kadar uzanır, çünkü mutasyonlar prospektif olarak tanımlanabilir ve hastaları uygun tedavilere ve klinik çalışmalara yönlendirmeye yardımcı olmak için kullanılabilir.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi çok önemlidir, çünkü boncuklardan DNA'yı yıkarken ve çıkarırken gereken bir dikkat tekniği nedeniyle arı temizleme adımının öğrenilmesi zordur Son onarım ana karışımını hazırlayın. Numune başına 50 mikrolitre olacak şekilde uygun hacimleri karıştırın. Her bir saf DNA'nın 50 mikrolitresini, bir ID altı kuyulu plakanın ayrı kuyucuklarına ayırın.

Daha sonra, her reaksiyona 50 mikrolitre hazırlanmış son onarım ana karışımı ekleyin ve reaksiyonu temizlemek için plakayı bir termosiklerde 20 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İlk olarak, her numuneye 200 mikrolitre AMP saf XP boncukları ekleyin ve çok kanallı bir pipetleyici kullanarak tüm hacmi 10 kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin. Bunu, plakayı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe ederek takip edin.

Ardından, plakaları manyetik standa taşıyın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca sertleşmelerine izin verin. Temizlendikten sonra, boncukları rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatantın çoğunu nazikçe çıkarın ve atın. Kuyularda bir miktar sıvı kalabilir.

Daha sonra her numuneye 200 mikrolitre taze hazırlanmış% 80 etanol ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 30 saniye inkübe edin. Etanolü dikkatlice pipetleyin ve yıkamayı bir kez daha tekrarlayın. Ardından, tüm alkol çıkana kadar plakayı oda sıcaklığında kurumaya bırakın.

Şimdi kurutulmuş boncukları 44,5 mikrolitre steril suda tekrar süspanse edin. Son çıkarma ile her bir numuneyi pipetten 10 kez yavaşça akıtın. Kuyu kenarına bağlı boncukları durulayın.

Şimdi su asılı boncukları oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin ve ardından kuyucuklar berraklaşana kadar beş dakika boyunca manyetik standa taşıyın. Son olarak, numuneyi içeren her bir oyukta 42 mikrolitre berrak süpernatanı nazikçe yeni bir kuyuya aktarın. Numuneler artık eksi 20 santigrat derecede bir haftaya kadar saklanabilir.

D tailing master karışımını steril bir mikro santrifüj tüpünde hazırlayarak başlayın. Hazırlanan DA kuyruk ana karışımından sekiz mikrolitreyi, onarılmış DNA'nın her bir oyuğuna ekleyin. Daha sonra reaksiyonu temizlemek için plakayı bir termosikleratör içinde 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Önceki bölümde özetlenen işlemin aynısını iki kat daha fazla hacimde kullanın ve Resus'un boncukları 33,75 mikrolitre steril suda askıya almasıyla bitirin. Bu noktada, numuneler daha sonra eksi 20 santigrat derecede bir haftaya kadar saklanabilir. Devam etmek için, reaksiyon başına 15 mikrolitre için bir ligasyon ana karışımı hazırlayın.

D kuyruk DNA'sını içeren her oyuğa 15 mikrolitre ligasyon ana karışımı ekleyin. Ardından, uygun 25 mikromolar'dan 1.25 mikrolitre ekleyin. Sonraki esnek barkodlu adaptör.

Her birine, her numuneye ayrı bir barkodlu adaptör verilmelidir. Adaptörler yüklendikten sonra, plakayı 20 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Şimdi 50 mikrolitre boncuk kullanarak, bir adaptör sonrası ligasyon temizliği yapın ve numuneyi steril suda 50 mikrolitreye kadar yeniden süspanse edin.

Ardından temizleme işlemini ikinci kez yapın ve 23 mikrolitre su ile bitirin. Bu noktada, numuneler daha sonra eksi 20 santigrat derecede bir haftaya kadar saklanabilir. Bir sonraki adım, buz çözme metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklanan her bir numuneyi, evrensel ve indeks oligonükleotid blokerlerini, CCAP kolay kütüphanesini ve con TNA iki X hibridizasyon tamponunu ve hibridizasyon bileşenini içeren çevik gen yakalama bileşenlerini kütüphaneleştirmektir.

A. Şimdi, kütüphane hazırlığında kullanılan belirli barkodlu adaptör dizilerine karşılık gelen bir milimolar indeks oligonükleotid bloker havuzu hazırlayın. Her blokerin bir mikrolitresini birleştirin ve 10 saniye boyunca birlikte girdaplayın Yeni bir 1,5 mililitrelik tüpte, mililitre başına bir miligramda beş mikrolitre conte A, iki mikrolitre üniversal bloker ve iki mikrolitre bloker havuzundan oluşan yakalama karışımını hazırlayın. 24 barkodlu kütüphaneyi tek bir reaksiyonda birleştirin.

Yakalama karışımına toplam bir ila üç mikrogram havuzlanmış barkodlu dizi kitaplığı ekleyin. 20 gauge veya daha küçük bir iğne hızı kullanarak kapakta 15 ila 20 delik açın, karışımı tamamen kuruyana kadar 60 santigrat derecede bir DNA vakum yoğunlaştırıcıda vakumlayın. Daha sonra, karışımı hibridizasyon tamponu ve hibridizasyon bileşeni A'da yeniden sulandırın. Kapaktaki delikleri bantla kapatın ve numuneyi 10 saniye boyunca girdaplayın.

Ardından karışımı maksimum hızda 10 saniye santrifüjleyin. Şimdi, DNA'yı denatüre etmek için karışımı 95 santigrat derecede kısaca inkübe edin. Bunu, 0,2 mililitrelik bir PCR şerit tüp karışımında oda sıcaklığında maksimum hızda 10 saniyelik santrifüjleme ile takip edin, 2,25 mikrolitre ccap kolay kütüphane yakalama problarını aynı hacimde steril nükleaz içermeyen suya karıştırın.

Daha sonra santrifüj reaksiyonunda tüpe karıştırın ve toplam hacmi bir pipet ucundan 10 kez yavaşça akıtın. Şimdi 0.2 mililitrelik tüpü 48 ila 96 saat boyunca 47 santigrat derecede bir termal döngüleyicide inkübe edin. Buharlaşmayı önlemek ve reaksiyon sıcaklığını günler sonra stabilize etmek için termal döngücünün kapak sıcaklığını 57 santigrat derecede tutun.

Yakalanan DNA'nın yıkanması ve geri kazanılması için adımları kullanın. Ardından, kübit yüksek hassasiyet tahlili kullanılarak amplifiye edilmiş yakalanan DNA'yı ölçerek yakalanan DNA kaplamasını amplifiye etmek için modifiye edilmiş bir Roche çevik gen protokolü kullanın. 12 tümör normal çifti içeren 24 barkodlu dizi kütüphanesinden oluşan bir havuz, 279 kanser geninin probları kullanılarak yakalandı ve 75'e iki olarak sıralandı.

HighSeq 2000 akış hücreli tümörün tek bir şeridinde baz çifti okumaları ve normal kütüphaneler ikiye bir oranında toplandı. IGV görüntüsü, bir akciğer kanserinde EGFR ekzonlarında dizi kapsamının özgüllüğünü gösterir, gri çubuklar benzersiz dizi okumalarını temsil eder. Sağdaki heterozigot T iki G mutasyonu, okumaların% 24'ünde mevcuttu, bu da bunun somatik bir L 8 58 R amino asit ikamesi olduğunu gösteriyor.

Normal akciğer dokusunun okumalarının hiçbiri bu TTA G mutasyonunu göstermedi, kolorektal kanser tümöründeki bazı indeller, normal çift bir PC'de somatik bir çerçeve kayması girişi veya yedi baz çiftinin somatik bir çerçeve kayması delesyonu gösterdi. TP 53'te tümör normal çiftleri arasında da kopya sayısı değişiklikleri görüldü. Her veri noktası, 279 hedef genden tek bir ekzonu temsil eder.

Kopya sayısı kazanımları ve kayıpları, tümör dizisindeki artış ve azalışlardan çıkarılır Kapsam Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde gerçekleştirilirse, kitaplık hazırlığının paylaşılması için altı buçuk saat ve yakalama hibridizasyonunun 48 ila 96 saat içinde yapılabilir. Bu tahlili gerçekleştirmek, kütüphane hazırlığı sırasında kirleticilere karşı dikkatli olmak son derece önemlidir, çünkü veri analizini karıştırabilir Bu prosedürü takiben, Sanger dizileme ve parça analizi gibi diğer yöntemler, şüpheli bir değişikliği nasıl doğrularım? Bu videoyu izledikten sonra, barkodlu DNA kütüphanelerinin nasıl hazırlanacağını ve bu havuzlanmış kütüphaneler üzerinde Exxon yakalamanın nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.