3D İnvaziv Kanser Hücrelerinin Sitoskeletal Örgütü ortaya

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kanser hücrelerinin morfolojisini ve bunların 3D kültürlerde hücre dışı matris ile etkileşimini gözlemlemektir, bu ilk olarak, 3D kollajen ağlarının görselleştirilmesine izin vermek için kırmızı floresan DTRA ile sıçan kuyruğu kollajeninin etiketlenmesiyle elde edilir. İkinci adımda, tek hücreler veya çok hücreli Steroidler olarak büyütülen kanser hücreleri, 3D Tamra etiketli kollajen matrislerine gömülür. Hücrelerin daha sonra bir ila üç gün boyunca kollajen boyunca dağılmasına izin verilir, bu da kanser hücrelerinin in vivo olarak çevredeki üç DS stroma istilasını ve göçünü taklit eder.

Daha sonra, hücreler sabitlenir ve ilgili proteinlerin hücre morfolojisini ve lokalizasyonunu görselleştirmek için uygun antikorlar ve Phin ile immüno-boyama yapılır. Sonuç olarak, 3D olarak kültürlenen kanser hücrelerinin ayırt edici morfolojisi ve bunların 3D hücre dışı matris ile etkileşimleri, konfokal mikroskopi ile numunelerin derin Zacks'lerinin elde edilmesi yoluyla analiz edilebilir. Bu yöntem, uzun yıllar boyunca 2B olarak analiz edilen 3B ortamlarda hücresel bileşenlerin moleküler bileşim işlevinin ve lokalizasyonunun daha iyi tanımlanmasına katkıda bulunarak hücre göçü alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu prosedürü benimle birlikte göstermek, laboratuvarımızda bir teknisyen olan Anton Smo olacak Kollajen birini Tamara ile etiketlemek için. Bir mililitrelik tek kullanımlık şırıngayı bir mililitre yüksek konsantrasyonlu sıçan kuyruğu kollajeni ile yavaşça doldurarak başlayın, bu da hava kabarcıklarını önleyen bir çözeltidir. 21 gauge hipodermik bir iğne takın ve daha sonra kollajeni, iğne ile zara zarar vermemeye dikkat ederek, 10.000 Dalton protein moleküler ağırlık kesimi ile önceden ıslatılmış üç mililitrelik bir diyaliz kasetine enjekte edin.

Kasetteki tüm havayı çıkarmak için pistonu geri çekin ve ardından kolajeni gece boyunca bir litre etiketleme tamponuna karşı diyalize edin. Ertesi sabah, kollajeni diyaliz kasetinden dikkatlice çıkarın ve ardından diyaliz edilmiş kollajen solüsyonunun bir mililitresini iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde bir mililitre soğuk taze seyreltilmiş Tamra solüsyonu ile karıştırın. Tüpü folyoya sarın ve gece boyunca rotasyonla inkübe edin.

Ertesi sabah, TAMRA etiketli kollajeni önceden ıslatılmış bir diyaliz kasetine aktarın ve fazla boyayı çıkarmak için kollajeni gece boyunca bir litre etiketleme tamponuna karşı diyalize edin. Daha sonra Tamara etiketli kollajeni korumak için, diyaliz kasetini hacim başına %0.2 hacimde bir litreye, pH'ı dört olan asetik asit solüsyonuna yerleştirin ve kaseti gece boyunca diyalize edin. Yine ertesi sabah, Tamara etiketli kolajeni diyaliz kasetinden bir mikro pipet kullanarak bir mikro santrifüj tüpüne aktarın, kolajenin son hacmini ölçün, ardından Tamara etiketli kolajenin son konsantrasyonunu hesaplayın.

Kullanılan kollajen çözeltisinin başlangıç hacmi ve konsantrasyonu göz önüne alındığında ve DY kollajeni, tek hücreleri gömmek için ışıktan korunarak dört santigrat derecede saklayın. Mililitre başına iki miligramın hacmini belirleyin. Deney için gerekli olan Tamara kollajen karışımını karıştırın ve ardından uygun hacimlerde 10 XPBS ve bir normal sodyum hidroksit karıştırın.

Daha sonra, mililitre başına iki miligramlık bir nihai toplam kollajen konsantrasyonu elde etmek için hem Tamara etiketli kollajen hem de etiketlenmemiş kollajenin uygun hacimlerini bir ila altı oranında karıştırın. Şimdi, ilgilenilen hücreleri FBS olmadan uygun hacimde soğutulmuş hücre ortamında askıya alın ve daha sonra hücreleri, mililitre başına 10 ila beşinci hücrelerin bir katı nihai hücre yoğunluğu elde etmek için Terah kollajen karışımına ekleyin. Karışımın 10 mikrolitresini bir pH test şeridi üzerinde test ederek pH'ı onaylayın ve ardından 100 mikrolitrelik Tamara kollajen hücre süspansiyonunu cam tabanlı tabaklara pipetleyin ve kollajen yaklaşık 30 ila 45 dakika beyazımsı bir jele dönüşene kadar karışımın oda sıcaklığında polimerize olmasına izin verin.

Daha sonra, kollajen gömülü hücre damlalarını kaplamak için yeterli kültür ortamını dikkatlice ekleyin ve damlaları, hücrelerin matris boyunca göç etmesi için yeterli süre boyunca% 10 karbondioksit içinde% 37 santigrat derecede tutun. Hücre steroidlerini gömmek için tipik olarak bir ila üç gün. 100 mikrolitre damla taze seyreltilmiş terik kollajen pipetleyin.

Cam tabanlı tabaklara karıştırın ve jel viskozitesini hafifçe artırmak için kollajenin iki ila beş dakika polimerizasyonu başlatmasına izin verin. Sonra bir hücre steroidi toplayın ve taze bir Petri kabına yerleştirin. Fazla sıvıyı çıkarın ve hücre ortamındaki kollajenin seyreltilmesini önlemek için steroidi 10 mikrolitre Tamara kollajen karışımında yeniden süspanse edin.

Daha sonra kollajen süspansiyonlu steroidi toplamak için bir P 20 pipeti kullanın ve 100 mikrolitre TEMA kollajen karışımı damlasının üst kısmının ortasına yerleştirin. Kollajenin iki ila beş dakika boyunca kısa bir süre polimerize olmasına izin vermek, OID'nizin kollajen damlasının hem üstünden hem de altından yüz mikrondan daha uzakta olmasını sağlamak için genellikle yeterlidir. Ancak steroidiniz hala batarsa, çanağı yaklaşık iki dakika ters çevirmeyi ve ardından dik konuma getirmeyi deneyin.

Kollajenin az önce gösterildiği gibi polimerize olmasına izin verin ve ardından kollajen steroid damlalarını kaplamak için yeterli kültür ortamını dikkatlice ekleyin. Daha sonra, hücrelerin immünofloresan boyama için matris boyunca göç etmesine izin vermek için damlaları inkübe edin. Hücre ortamını dikkatlice çıkararak ve steroid gömülü kollajen matrislerini PBS ile durulayarak başlayın.

Daha sonra, hücreleri ekstraksiyon fiksasyon tamponu ile inkübe edin. Beş dakika sonra, hücreleri PFA ve sükroz ile 30 dakika boyunca PBS'de sabitleyin. Sonra hücreleri durulayın.

Şimdi hücreleri, PBS'de seyreltilmiş birincil antikorlarla inkübe edin. Daha sonra matrisleri her seferinde 30 dakika boyunca üç kez yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, matrisleri ikincil antikorlar, Alexa konjuge Phin ve DPI ile PBS'de seyreltilmiş olarak inkübe edin.

Daha sonra matrisleri tekrar yıkadıktan sonra, fazla sıvıyı çıkarın ve bulaşıkların altını dolduran yaklaşık 500 mikrolitre montaj ortamı ekleyin. Şimdi her damlayı 24 milimetrelik bir kapak kaymasıyla kapatın, damlalara bastırmamaya ve matrislerin yapısına zarar vermemeye dikkat edin. Örnekleri görüntülemek için.

40 x objektifi kollajen damlasının ortasına yerleştirin. Daha sonra floresan lambayı kullanarak, hem XY hem de xz ekseninde numuneye genel bir bakış elde edin. Ardından, konfokal canlı görüntüleme moduna geçin.

561 nanometre lazeri kullanarak, kollajen lifleri görünmeye başlayana kadar camın altından odaklanmaya başlayın. Bu derinliği düşünün, Z sıfır mikrometreye eşittir. Şimdi hedefi 100 mikrometrenin üzerine ulaşana kadar yükseltin, Z sıfıra eşittir ve ardından z'de bulunan hücreleri 100 mikrometre veya üzerinde herhangi bir gerilim etkisinden kaçınmak için görüntüleyin, sert cam alt etiketleme sıçan kuyruğu kollajeninden herhangi bir gerilim etkisini önlemek için Tamara ile 3D kollajen ağlarının kolay bir şekilde hazırlanmasını ve görselleştirilmesini sağlar.

Yavaş oda sıcaklığında polimerizasyon, burada kırmızı olarak görüntülenen bu ağların oluşumuna izin verir in vivo bulunanlarla karşılaştırılabilir bir organizasyonla hücre iskeleti proteinleri burada mavi renkte görünen tübülin veya burada yeşil renkte gösterilen bir aktin gibi, 3D matrislerde görüntülendiğinde bu görüntülerde gösterildiği gibi immüno boyama ile görselleştirilebilir, kolon adenokarsinomu CT 26 hücreleri, Filip Podia ve lam podia'ya benzeyen f aktin açısından zengin hücresel çıkıntılarla uçlu, uzun bir hücre gövdesi ile karakterize tipik bir mezenkimal morfoloji sunar. Bu uzun morfoloji, kollajen matrisini istila ederek hücresel steroidden kaçmaya çalışan hücrelerde daha da belirgindir. Kültürde iki gün geçirdikten sonra, hücreler hücre steroidinden uzaklaşarak kollajen 3D matrisini istila etmeye başlar.

Bu görüntülerdeki hücrelerin tek tip bir 3D dağılımını sağlamak için toplanan Z yığınlarını tüm görüş düzlemlerinden analiz etmek çok önemlidir. Örneğin, maksimum bir XY projeksiyonu olarak görselleştirildiğinde, steroid olarak büyütülen CT 26 hücreleri, 3D kollajen matrisini yoğun bir şekilde istila ediyor gibi görünmektedir. Bununla birlikte, x XZ görünümü, hücrelerin aslında steroid hacmine kıyasla sınırlı bir Z aralığını istila ettiğini ve tercihli bir istila bölgesini önerdiğini ortaya koymaktadır.

Bu temsili steroid aslında tabağın cam tabanına çok yakın yerleştirildi, bu da hücrelerin steroidden uzaklaşmasına neden oldu, 3D kollajen matrisini istila ederek değil, bu prosedürü takiben 2D sert cam üzerinde sürünerek. TAMRA kollajen matrislerine gömülü GFP eksprese eden hücrelerin canlı görüntülenmesi gibi diğer yöntemler, hücre ve matris arasındaki dinamik etkileşimleri veya hücre kaynaklı matris deformasyonunu yakından izlemek için kullanılabilir.