Name: Tek Mitokondriyal süperoksit Bozulmamış Kalp Flaşlar veya konfokal Görüntüleme In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Öğrenin, konfokal mikroskopi ile fare iskelet kası ve perfüze kalpte tek mitokondriyal süperoksit parlamalarını ve membran potansiyeli dalgalanmalarını canlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, fizyolojik ve patolojik koşullarda mitokondriyal fonksiyonun gerçek zamanlı değerlendirilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Dr teşekkür etmek istiyorum. Heping Cheng, onların yararlı yorumlarından ve bu yöntemi geliştirerek teknik destek için Huiliang Zhang ve Stephen Kolwicz. Bu çalışma NIH hibe ve Amerikan Kalp Derneği WW Scientist Kalkınma Grant tarafından desteklenmiştir.

1.. Deney Hazırlama <ol><li> 140 mM NaCI, 5 mM KCI, 2.5 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, in vivo görüntüleme için iskelet kası (pH 7.2) ihtiva eden izotonik bir dengelenmiş tuz çözeltisi (50 ml) hazırlayın. </li><li> 118 mM NaCI, 5.3 mM KCI, 1.2 mM MgSO 4, 0.5 mM EDTA ve 25 mM NaHCO 3: içeren Krebs-Henseleit tamponu (KHB) 1 L hazırlayın. </li><li> Kabarcık gaz ihtiva eden% 95 O 5/2 önceden 2 mM CaCl2 eklenmesinden 10-15 dakika boyunca% CO2 ile KHB. Metabolik substratlar (örn., 10 mM glükoz ve 0.5 mM piruvat) eklenir. </li><li> % 70 etanol içinde kelepçe, makas ve forseps sterilize edilmesi ve daha sonra steril GKD 2 O. durulama ile cerrahi aletler hazırlanması </li><li> , Kalp perfüzyon sistemine açın su banyosu ve sirkülasyon üzerinde sıcaklığını ayarlamak, 6 ml / dak peristaltik pompanın hızını ayarlamak. </li><li> % 95 O 2 ile kabarcık KHB/% 5 CO2 gaz ve çıkış maddesi akış oranı ve (a fiber optik sıcaklık probu ile 37 ° C,) sıcaklığını izlemek. Sistem, gaz ve ısı dengelenmesi için yaklaşık 20 dakika gerektirir. </li></ol> 2. In Vivo İskelet Kaslar konfokal Görüntüleme <ol><li> Pentobarbital (80 mg / kg, ip) ile fare anestezisi. Hayvan, 10-15 dakika içinde cerrahi anestezi (ayak tutam hiçbir yanıt) ulaşmak ve iskelet kaslarının in vivo görüntüleme için yeterli 1-1.5 saat, bu durum kalır. </li><li> Arka ayaklarında biri tüyleri ve% 70 etanol ile cilt sterilize. </li><li> Gastroknemius kasları ortaya çıkarmak için kolun dış kenarı boyunca deride bir kesi olun. </li><li> Keskin bir forseps ile yavaşça epimysium pick up ve makas ile ile bir kesi yapmak. Dahası epimysium kaldırmak ve onun altındaki kas lifleri maruz teşrih. </li><li> Iskelet içine TMRM bölgesinin in vivo olarak yüklenmesi içinkas, 30 dakika boyunca kas sokmak ve daha sonra gösterge içermeyen çözeltisi ile yıkamak için izotonik dengeli tuz çözeltisi içinde TMRM (500 nM) içerir. </li><li> Konfokal mikroskop (Zeiss LSM 510) aşaması ile ilgili yan fare koyun ve açıkta kalan iskelet kası, odacığın alt kısmını oluşturan lamel karşı karşıya olan bir pozisyonda, arka uzuv kısıtlamaktadır. Lamel kas dokusu ve ters objektif (40X yağ) arasında yer almaktadır. </li><li> Doku ve lamel arasında sıkı bir temas sağlamak için hafifçe aşağı bacak basın. Izotonik dengeli tuz çözeltisi içinde açıkta kalan kaslar bırakın. </li><li> Kare başına bir saniye bir örnekleme hızında kayıt iki boyutlu (2B, xy) konfokal görüntüler. Her pikselin şiddeti 8-bit derinliği dijitalize edilir. Genellikle, bir seri tarama 100 kare içerir. </li><li> &gt; 505 nm de ilk 405 nm&#39;de heyecanlı ve toplayarak ardışık görüntüleri toplayın sonra 488 nm&#39;de çift dalgaboyu excitatio için&gt; 505 nm toplanırkenmt-cpYFP n görüntüleme. Mt-cpYFP ve TMRM üçlü dalga boyu uyarım görüntüleme için, sırasıyla 405, 488 ve 543 nm sıralı uyarma kullanın, ve, 505-545 de 505-545 emisyon toplamak, ve&gt; 560 nm. </li></ol> 3. Perfüze Fare Kalp Eşodaklı Görüntüleme <ol><li> Hemen iskelet kaslarının in vivo görüntüleme ile, heparin (ip) 200 birim ile fare enjekte edilir. On dakika sonra, torakotomi fare euthanize ve hızlı bir şekilde ona bağlı akciğerler ve timus ile kalp kaldırmak. </li><li> Hızla buz gibi soğuk tampon maddesi içinde akciğer çıkarın. Timus lobları belirlenmesi ve yavaşça çıkan aort maruz geri soyma. </li><li> Timus çıkarın ve dikkatle herhangi bir çevre doku kaldırarak aorta izole. </li><li> Aort arkın ilk dalı öncesinde çıkan aorta üst ucunda bir kesim olun. </li><li> Lümen maruz iki mikro dikiş forseps ile yavaşça aort duvarı tutun ve dikkatle ca üzerine aorta yerleştirinnnula (PE50 tüp). Dikiş hızla aort etrafında bağlı ise aorta bir mikro damar kelepçe ile yerinde tutulur. </li><li> Kanül ucu aort kökü üzerinde olduğundan emin olmak için forseps ile kanül dikkatle kontrol edin, kelepçesini sökün. Ek bağları yerine kalp tutmak için gerektiğinde eklenir. </li><li> Peristaltik pompa açın ve 1 ml / dk da kalp serpmek. Kalp perfüzyon üzerine yenerek devam edecektir. </li><li> Perfüzyon sistemi konumunu ayarlayın ve mikroskop sahnede kalp koydu. Sahne kalbi tutan odasının ısıtılmasını sağlayan bir adaptörü vardır. </li><li> Kısmen kalp daldırın odası içinde KHB perfüzyon çözeltisi 1 ml ilave edilir. 37 ° C de, bölmenin sıcaklığını izlemek Peristaltik bir pompa kullanılarak odasından çıkış maddesinin çıkarın. </li><li> Giderek kalp için yeterli akımı (yaklaşık olarak 2 ml / dak) elde etmek için peristaltik bir pompa hızını artırmaktır. </li><li> Stabilizasyon 10 dakika sonra hea perfüze10 uM Blebbistatin ve 100-500 nM TMRM ile oda sıcaklığı. Kalp atışı 10 dakika sonra yavaşlar. </li><li> Bölmenin altındaki lamel ile kalbin sıkı bir temas sağlamak için ve ayrıca kalp atışı bastırmak için kalp üzerine hafif bir basınç uygulanır. </li><li> Yukarıda adım 2.8 &#39;de açıklandığı gibi sağlam miyokardiyumun konfokal görüntüleme için aynı prosedürü uygulayın. Dikkatle mümkün net bir görüntü ortaya odak düzlemi ayarlayın. </li></ol> 4. Görüntü İşleme ve Veri Analizi <ol><li> Tek mitokondriyal yanıp söner ve membran potansiyeli değişiklikleri analiz etmek konfokal yazılımın &quot;Fizyolojik Analizi&quot; modülü tarafından sağlanan araçlarını kullanın. Bu modül, genellikle konfokal sistemin görüntü edinme yazılım dahil ve görüntüde belli alanların belirlenmesi hem de zaman etiketleri ile floresan yoğunluğunun çıkış izin verir. </li><li> Veritabanı ve analiz edilecek daha sonra seri 2D görüntü dosyasını açın. </li><li> &quot;Bölge tıklayınFaiz (ROI) ortalama İB&#39;nin &quot;geçmek için&quot; anlamına ortalamaları İB&#39;nin &quot;modunda&quot; geçmek için &quot;Region of Interest (ROI) demek&quot; modunda. tıklayınız. &quot; </li><li> Yanıp seçmek için cpYFP 488 nm kanal hariç diğer kanalların ekranını kapatın. </li><li> Görüntü ve manuel zoom seri 2D görüntüleri oynatmak için kaydırma çubuğunu hareket ettirin. </li><li> Nerede floresan sinyal artar geçici siteyi bularak tek mitokondriyal süperoksit yanıp tanımlayın. Yanıp işaretlemek için uygun ROI aracını kullanın. Her ROI zaman bağımlı floresan değişimi gösteren iz görüntünün yanında görünecektir. </li><li> Tüm yanıp seçtikten sonra, diğer kanalların ekranda açın. Arka sinyal çıkarma için hücre dışında görüntü üzerinde bir ROI seçin. Birlikte zaman etiketleri ile çıkış her ROI ortalama floresan. </li><li> Tarama zaman ve alan ile birlikte seri tarama görüntü dosyasının her basması sayısını kaydedinHücre. Excel kullanın 100 sn / 1,000 mikron 2 hücre alanının başına yanıp sayısı olarak flaş frekansı hesaplamak için. </li><li> Her flaş (genlik, zirve için zaman ve çürüme zaman) parametrelerini hesaplamak için Interactive Data Language (IDL, ResearchSystems) yazılı geliştirilmiş özel bir program kullanın. IDL yazılım ticari olarak mevcuttur ve flaş parametre analizi için özel olarak geliştirilen program, istek üzerine yazar elde edilebilir. </li></ol>

<ol><li>Brookes, P. S., Yoon, Y., Robotham, J. L., Anders, M. W., Calcium Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium%2C+ATP%2C+and+ROS%3A+a+mitochondrial+love-hate+triangle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium, ATP, and ROS: a mitochondrial love-hate triangle.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, 817-833 (2004).</li>
<li>Scheffler, I. E. Mitochondria. , 2nd, J. Wiley and Sons, Inc. (2008).</li>
<li>Rosca, M. G., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in heart failure.</a> Cardiovasc. Res. 88, 40-50 (2010).</li>
<li>Griffiths, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and heart disease.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 942, 249-267 (2012).</li>
<li>Winklhofer, K. F., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).</li>
<li>Pieczenik, S. R., Neustadt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+molecular+pathways+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Mol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and molecular pathways of disease.</a> Exp. Mol. Pathol. 83, 84-92 (2007).</li>
<li>Szentesi, P., Zaremba, R., van Mechelen, W., Stienen, G. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+utilization+for+calcium+uptake+and+force+production+in+different+types+of+human+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">ATP utilization for calcium uptake and force production in different types of human skeletal muscle fibres.</a> J. Physiol. 531, 393-403 (2001).</li>
<li>Lemieux, H., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bioenerg.+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in the human heart.</a> J. Bioenerg. Biomembr. 41, 99-106 (2009).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+III.+The+steady+state%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state.</a> J. Biol. Chem. 217, 409-427 (1955).</li>
<li>Lambert, A. J., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+production+by+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species production by mitochondria.</a> Methods Mol Biol. 554, 165-181 (2009).</li>
<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435, 297-312 (2011).</li>
<li>Robinson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+fluorescent+imaging+of+superoxide+in+vivo+using+ethidium-based+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15038-15043 (2006).</li>
<li>Dickinson, B. C., Srikun, D., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial-targeted+fluorescent+probes+for+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial-targeted fluorescent probes for reactive oxygen species.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 14, 50-56 (2010).</li>
<li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279, 22284-22293 (2004).</li>
<li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279, 13044-13053 (2004).</li>
<li>Belousov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+fluorescent+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nat. Methods. 3, 281-286 (2006).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+Flashes+in+Single+Mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Superoxide Flashes in Single Mitochondria.</a> Cell. 134, 279-290 (2008).</li>
<li>Wei-Lapierre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respective+Contribution+of+Mitochondrial+Superoxide+and+pH+to+Mitochondria-targeted+Circularly+Permuted+Yellow+Fluorescent+Protein+%28mt-cpYFP%29+Flash+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Respective Contribution of Mitochondrial Superoxide and pH to Mitochondria-targeted Circularly Permuted Yellow Fluorescent Protein (mt-cpYFP) Flash Activity.</a> J. Biol. Chem. 288, 10567-10577 (2013).</li>
<li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+superoxide+flash+and+metabolism-coupled+mitochondrial+permeability+transition+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging superoxide flash and metabolism-coupled mitochondrial permeability transition in living animals.</a> Cell Res. 21, 1295-1304 (2011).</li>
<li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+superoxide+flashes%3A+metabolic+biomarkers+of+skeletal+muscle+activity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial superoxide flashes: metabolic biomarkers of skeletal muscle activity and disease.</a> FASEB J. 25, 3068-3078 (2011).</li>
<li>Sheu, S. S., Wang, W., Cheng, H., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+flashes%3A+illuminating+new+insights+into+cardiac+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Superoxide flashes: illuminating new insights into cardiac ischemia/reperfusion injury.</a> Future Cardiol. 4, 551-554 (2008).</li>
<li>Wei, L., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on%3A+SGP+symposium+on+mitochondrial+physiology+and+medicine%3A+mitochondrial+superoxide+flashes%3A+from+discovery+to+new+controversies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Perspectives on: SGP symposium on mitochondrial physiology and medicine: mitochondrial superoxide flashes: from discovery to new controversies.</a> J. Gen. Physiol. 139, 425-434 (2012).</li>
<li>Johnson, I., Spence, M. T. Z. Ch. 12.2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+I+%22The+Molecular+Probes+Handbook%2C+A+Guide+to+Fluorescent+Probes+and+Labeling+Technologies%22">The Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies</a>. , Life Technologies Corp. 510-511 (2013).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+flashes%3A+elemental+events+of+mitochondrial+ROS+signaling+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Superoxide flashes: elemental events of mitochondrial ROS signaling in the heart.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 52, 940-948 (2012).</li>
<li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+flashes+reveal+novel+properties+of+mitochondrial+reactive+oxygen+species+excitability+in+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Superoxide flashes reveal novel properties of mitochondrial reactive oxygen species excitability in cardiomyocytes.</a> Biophys. J. 102, 1011-1021 (2012).</li>
<li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+heart+perfusion%3A+The+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).</li>
<li>Pasdois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+diazoxide+on+flavoprotein+oxidation+and+reactive+oxygen+species+generation+during+ischemia-reperfusion%3A+a+study+on+Langendorff-perfused+rat+hearts+using+optic+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of diazoxide on flavoprotein oxidation and reactive oxygen species generation during ischemia-reperfusion: a study on Langendorff-perfused rat hearts using optic fibers.</a> Am. J. Physiol. 294, H2088-H2097 (2008).</li>
<li>Granville, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+ischemia+and+reperfusion-induced+myocardial+damage+by+cytochrome+P450+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Reduction of ischemia and reperfusion-induced myocardial damage by cytochrome P450 inhibitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1321-1326 (2004).</li>
<li>Davidson, S. M., Yellon, D. M., Murphy, M. P., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+calcium+waves+and+redox+changes+precede+mitochondrial+permeability+transition+pore+opening+in+the+intact+heart+during+hypoxia+and+reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Slow calcium waves and redox changes precede mitochondrial permeability transition pore opening in the intact heart during hypoxia and reoxygenation.</a> Cardiovasc. Res. 93, 445-453 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Canlı hayvan veya perfüze organ tek mitokondriyal olayları görüntüleme mitokondrial fonksiyon değerlendirme 17,19,21,22,24,25 için geleneksel yöntemlere göre önemli bir avantaja sahiptir. Burada anlatılan teknik, hücre içi çözünürlükte gerçek bir fizyolojik duruma mitokondriyal fonksiyon in situ tespiti gerçek zaman elde edilebilir. Sistemik olarak, in vivo olarak belirli bir organ veya hücre tipinde normal fonksiyonu, mitokondri rolünü incelemek için, diğer ölçümler ile birlikte, b...

Mitokondri hücre Bioenerji merkezi rol, serbest radikal sinyalizasyon, redoks hemostazını, iyon düzenlenmesi ve hücre kaderinin belirlenmesi 1,2 oynamaktadır. Mitokondri disfonksiyon sıklıkla eşlik eder ve hastalık 3-6 patogenezi yatmaktadır. Özellikle bu kalp ve iskelet kasları gibi kas sistemlerinde, mitokondriyal solunum hücre içi kalsiyum ve sağlam, güç geliştirme 7,8 zamanında düzenleme desteklemek için ATP çoğunluğu içerir. Bu kaslar, genellikle, toplam hücre hacmi% 20-40 kadar işgal myofilaments 2 arasında &quot;sabit&quot; olan mitokondri içinde çok sayıda sahiptirler. Çok sayıda araştırmaya rağmen, özellikle in vivo ve fizyolojik ilgili koşullar altında mitokondriyal fonksiyon yönetmelik, anlayışımız, sınırlıdır. Bunun nedenlerinden biri, mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için geliştirilmiş yöntemlerin çoğunluğu vitr olarak itimato ya da eski tür yapay substratlar ile takviye izole mitokondri oksijen tüketimi ve morfoloji yoluyla mitokondriyal fonksiyonun belirlenmesi dolaylı (örneğin elektron mikroskopisi), enzim aktivitesi (örneğin akonitaz aktivite) ya da hücre içi ATP seviyeleri 9-11 izlenmesi gibi vivo yaklaşımlar, . Son zamanlarda, göreceli mitokondriyal zenginleştirme ile küçük molekül floresan göstergeler sağlam hücrelerde zar potansiyeli, kalsiyum ve reaktif oksijen türlerinin (ROS), dahil olmak üzere 11-13 mitokondriyal sinyallerin bir belirti sağlamak için uygulanmıştır. Ayrıca, çok sayıda yeşil floresan protein (GFP) redoks bazlı ve ROS göstergeleri bölümlere hücre içi redoks veya ROS 14-16 sinyal daha özel bir değerlendirme elde etmek için geliştirilmiştir. Bu arasında, bir genetik olarak kodlanmış süperoksit göstergesi, dairesel sırası değiştirilmiş sarı floresan protein ve targete gelişmişmitokondri (mt-cpYFP) 17 içine d o. mt-cpYFP 515 nm &#39;de iki emisyon tepe ile 405 ya da 488 nm&#39;de uyarıldığında edilebilir. 488 nm eksitasyon emisyon in vitro ve in vivo kalibrasyon 17,18 önceki ile gösterildiği gibi, süperoksit özellikle duyarlıdır. 405 nm uyarma emisyon (çeşitli koşullar altında mt-cpYFP emisyon ve uyarma spektrumları hakkında detaylı bilgi için Ref 17 Şekil 1&#39;e bakınız), iç kontrol olarak kullanılmıştır. Time-lapse konfokal görüntüleme ile bu gösterge sağlam hücreler tek mitokondrilerinde süperoksit yanıp adlı süperoksit üretimi olayları, patlama algılar. Süperoksit flaş mitokondrial solunum, ekli geçici mitokondriyal membran depolarizasyon ve ROS üretiminin 17-20 bir bileşik fonksiyonu olarak hizmet vermektedir. Son zamanlarda, biz pUC&#39;den CAGGS-mt-cpYFP vektör C57/BL6 arka planda 17,19 kullanarak pan-doku mt-cpYFP transgenik fareler üretilen ve güçlü Expres doğruladıktankalp, iskelet kasları ve diğer dokularda (Şekil 2) Bu göstergenin sion. Transgenik fareler istek ve Washington Üniversitesi tarafından MTA onayıyla ilgilenen akademik araştırmacılar için geçerli olacak. Bu çalışmada, in situ Langendorff perfüze kalp süperoksit basmaları görüntüleme gibi anestezi uygulanmış mt-cpYFP transgenik farelerin 17,19 iskelet kaslarında flaş etkinlikleri in vivo görüntüleme açıklar. Bu teknoloji fizyolojik ilgili bir durum veya in vivo 21,22 tek mitokondriyal ROS üretim olayları gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak verir. Böyle uygun floresan gösterge ile membran potansiyeli ve kalsiyum gibi diğer tek mitokondriyal parametrelerini izlemek için sistemi kullanmak da mümkündür. Hücre içi olaylar (örn. kalsiyum geçici) veya kalp fonksiyonu (mitokondriyal fonksiyonu daha fazla, aynı anda ya da paralel değerlendirme örn.. Ejeksiyon fraksiyonu) elde edilebilir. Böyle iskemi reperfüzyon gibi patolojik tedirginlikler, sağlam miyokardiyumda tek mitokondriyal fonksiyonu üzerindeki stresin etkisini değerlendirmek için perfüze kalp uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Toronto Araştırma Kimyasalları</td><td>B592500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Acros Organics</td><td>AC34961-5000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>D-Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-1</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull; 6H < alt > 2 O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 ve boğa; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880-1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-1</td><td></td></tr><tr><td>Piruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256-25</td><td></td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Invitrogen</td><td>T-668</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td colspan="4">Konfokal Çizgi Tarama Mikroskobu (LSM 510 Meta, Zeiss), "Fizyolojik Analiz" modülünü içeren yazılım sürümü 4.2 SP1.</td></tr></tbody></table>

tek mitokondriyal süperoksit bozulmamış kalp flaşlar veya konfokal görüntüleme in vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitokondri ökaryotik sistemlerde enerji üretimi ve hücre içi sinyal sorumlu kritik bir hücre içi organel. Mitokondriyal işlev bozukluğu, genellikle eşlik eden ve insan hastalığına neden olur. Mitokondriyal işlev bozukluğu ve değerlendirmek için geliştirilmiştir yaklaşımlar çoğunluğu in vitro ya da ex vivo ölçümler dayanmaktadır. Bu deneylerden elde edilen sonuçlar, in vivo olarak mitokondriyal fonksiyonu belirlenmesinde yeteneği sınırlıdır. Burada, in vivo olarak, gerçek zamanlı bir şekilde, tek bir mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesine olanak tanır, canlı aminaller sağlam dokuların görüntülenmesi için, konfokal tarama mikroskobu kullanan yeni bir yaklaşımı tarif eder. İlk olarak, mitokondriyal hedeflenen süperoksit göstergesi, dairesel sırası değiştirilmiş sarı floresan proteini (mt-cpYFP) ifade eden transjenik fareler üretir. Anestezi mt-cpYFP fare ısmarlama bir sahne adaptörü ve zaman atlamalı görüntüler f alınır sabittirhindlimb açıkta kalan iskelet kasları rom. Fare daha sonra kurban edilir ve kalp 37 ° C&#39;de fizyolojik çözümleri ile Langendorff perfüzyon için ayarlanmış Perfüze kalp konfokal mikroskop sahnede özel bir odasında konumlandırılmış ve hafif basınç kalp hareketsiz ve kalp atışını kaynaklı hareket yapaylığı bastırmak için uygulanır. Süperoksit yanıp saniyede bir çerçeve frekansında gerçek zamanlı 2D konfokal görüntüleme ile tespit edilir. Perfüzyon çözüm farklı alt tabakaların solunum ya da diğer floresan göstergeleri ihtiva edecek şekilde modifiye edilebilir. Perfüzyon, aynı zamanda, iskemi ve reperfüzyon gibi hastalık modeller üretmek için ayarlanabilir. Bu teknik, sağlam dokularda ve in vivo olarak bir mitokondri fonksiyonunu belirlemek için benzersiz bir yaklaşımdır.

Bu protokole göre, tek mitokondriyal olayların in vivo görüntüleme anestezi farelerin iskelet kaslarında yapılabilir perfüze kalp yerinde görüntüleme (Şekil 1) izledi. Görüntüleme koşulları optimum ayarı bozulmamış kas dokularının net görüntüler sağlamak ve tek mitokondri çözünürlük (Şekil 2) ile olacaktır. TMRM genellikle mt-cpYFP konumunu kontrol etmek için kullanılır ve mt-cpYFP sinyali ile tam bir üst üste desen (Şekil 2) göstermelidir. TM...

Konfokal mikroskopi taraması, canlı bir hayvanda perfüze kalp ya da iskelet kaslarında bir mitokondriyal etkinlik görüntülenmesi için uygulanır. Süperoksit basması ve membran potansiyel dalgalanmalar gibi tek mitokondriyal süreçlerinin gerçek zamanlı izleme fizyolojik ilgili bir bağlamda ve patolojik tedirginlikler sırasında mitokondrial fonksiyon değerlendirilmesini sağlar.

Tek Mitokondriyal süperoksit Bozulmamış Kalp Flaşlar veya konfokal Görüntüleme In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Bu prosedürün genel amacı, fizyolojik olarak ilgili bir bağlamda mitokondriyal fonksiyonun gerçek zamanlı değerlendirmesini elde etmek için süperoksit parlamaları ve zar potansiyel dalgalanmaları gibi tek mitokondriyal olayları yerinde veya in vivo olarak izlemektir. Bu, önce farenin arka bacağındaki iskelet kasının açığa çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İskelet kaslarının daha sonra hızlandırılmış konfokal görüntüleri in vivo olarak elde edilir.Daha sonra fare kalbi perfüze edilir ve konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenir. Son olarak, görüntüler işlenir ve veriler analiz edilir. Sonuç olarak, zaman atlamalı ve iki boyutlu konfokal görüntüler yoluyla iskelet kaslarında, in vivo veya perfüze kalpte tek mitokondriyal süperoksit parlamaları ve zar potansiyel dalgalanmaları gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu tekniğin, mitokondriyi izole etmede mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi gibi mevcut kaslara göre en büyük avantajı, bu tekniğin fizyolojik olarak ilgili bir durumda tek mitokondriyal fonksiyonun gerçek zamanlı değerlendirmesine izin vermesidir. Bu yöntemin bir bıçak, hayvan veya bıçak dokusu olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü daha dik ve karmaşık bir prosedürdür

confocal-imaging-single-mitochondrial-superoxide-flashes-intact-heart

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Endotel Ca2 + sinyalizasyon parakrin türetilen ROS indüksiyon görüntülenmesi anlayışlar kazanmak için etkili bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, bir ko-kültür modeli vasküler endotelyal hücreler Ca2 + seferberlik tetikleyen parakrin elde edilen ROS ölçme yararlanır.

Vasküler Ca Görselleştirme 2 + Parakrin Türetilmiş ROS tarafından tetiklenmiş Sinyal

Mitokondriyal füzyon zamanla mitokondriyal ağ üzerinden photoconverted matris hedefli YFP dengelenme izleme ölçüldü. Şimdiye kadar, sadece bir hücre bir anda bir saat uzun kinetik analizine tabi olabilir. Biz aynı anda böylece veri toplama işlemini hızlandıracak, birden çok hücre ölçen bir yöntem sunuyoruz.

Paralel Konfokal Mikroskop kullanarak birden fazla Hücre Kinetik Veri Kazanılması A Daha hızlı, Yüksek Çözünürlük, MTPA-GFP tabanlı Mitokondrial Füzyon Deneyi

Objektif fizyolojik preload ve afterload baskıların kapsamında izole kalplerin mitokondriyal redoks izlemektir. Bir biventriküler çalışma tavşan kalp modeli sunulmuştur. NADH, yüksek çözünürlükte zamanmekansal floresans görüntüleme epikardiyal doku mitokondriyal redoks izlemek için kullanılır.

İzole Biventriküler ve NADH Floresans Görüntüleme Tavşan Kalpler Çalışma

Kaynak: Kennedy, L. H., et. al. Organotipik Beyin Dilimlerinde Oligodendrosit Organellerinin Adeno İlişkili Virüs ve Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Görselleştirilmesi ve Canlı Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, organotipik fare beyin dilimlerinde oligodendrosit mitokondrinin görüntülenmesini göstermektedir. Dilim, sürekli sıvı sirkülasyonu ve kontrollü sıcaklığa sahip bir banyo odasının içine yerleştirilir. Konfokal mikroskobun çeşitli parametrelerini ayarladıktan sonra, kırmızı...

Organotipik Beyin Dilimi Kültürlerinde Oligodendrositler İçindeki Mitokondriyal Hareketin Konfokal Görüntülenmesi

Mitokondriyal yapı-fonksiyon ilişkisinin analizi, mitokondriyal işlevselliğin düzenleyici mekanizmalarının tam olarak anlaşılması için gereklidir. Canlı ve sabit Drosophila yumurtalıklarında mitokondriyal yapı ve fonksiyonu incelemek için özel yöntemler bu yazıda açıklanmış ve gösterilmiştir.

Mitokondriyal Yapısı ve İşlevi incelenmesi Drosophila Yumurtalıklar

Genetik modifikasyondan sonra tüm hücrelerde mitokondri ve endoplazmik retiplinin dağılımını incelemek için bir protokol sunuyoruz, askorbat peroksidaz 2 ve horserpu peroksidaz boyama da dahil olmak üzere bağıntılı ışık ve hacim Elektron Mikroskopisi kullanılarak aynı bölümde hedef geni olan ve olmayan hücrelerin seri bölümlemesi ve elektron mikroskobu ile seri görüntüleme.

Göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme

Bu teknik, floresan tabanlı canlı görüntüleme kullanarak HeLa hücrelerindeki mitokondriyal membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini görselleştirmek ve nicel olarak ölçmek için etkili bir iş akışını tanımlar.

HeLa hücrelerinde canlı görüntüleme kullanılarak mitokondriyal membran potansiyelinin ve süperoksit seviyelerinin floresan bazlı ölçümü

Hidrojen peroksit (H2O2) hem oksidatif hasar kaynağı hem de bir sinyal molekülüdür. Bu protokol, canlı mayada genetik olarak kodlanmış bir oransal biyosensör olan mitokondri hedefli HyPer7 (mtHyPer7) kullanılarak mitokondriyalH2O2'ninnasıl ölçüleceğini açıklar. Ücretsiz olarak kullanılabilen yazılımı kullanarak görüntüleme koşullarının nasıl optimize edileceğini ve kantitatif hücresel ve hücre altı analizin nasıl gerçekleştirileceğini ayrıntılarıyla açıklar.

Mitokondriyal Peroksit için Oransal Bir Biyosensör olan mtHyPer7'nin Canlı Maya Hücrelerinde Görüntülenmesi

Bu protokol, sırasıyla mEosEM ve APEX2 ile etiketlenmiş mitokondri ve lizozomların etkileşimini görselleştirmek için bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu kullanmak için bir mekanizmayı açıklar.

Mitokondri ve Lizozomlar Arasındaki Etkileşimlerin Görselleştirilmesi için Çift Renkli İlişkili Işık ve Elektron Mikroskobu

Bu makale, Dendra2 foto-anahtarlama floresansı yoluyla mitokondriyal fisyon/füzyon dinamiklerini değerlendirmek için konfokal mikroskopi ve ImageJ'nin kullanımını açıklamaktadır.

Böbrek Proksimal Tübüler Hücrelerinde Mitokondriyal Fisyon/Füzyon Dinamiklerinin Değerlendirilmesi

Öğrenin, konfokal mikroskopi ile fare iskelet kası ve perfüze kalpte tek mitokondriyal süperoksit parlamalarını ve membran potansiyeli dalgalanmalarını canlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, fizyolojik ve patolojik koşullarda mitokondriyal fonksiyonun gerçek zamanlı değerlendirilmesini sağlar.

Tek Mitokondriyal süperoksit Bozulmamış Kalp Flaşlar veya konfokal Görüntüleme In Vivo

Daha fazla video keşfet