Tek Mitokondriyal süperoksit Bozulmamış Kalp Flaşlar veya konfokal Görüntüleme In Vivo

Bu prosedürün genel amacı, fizyolojik olarak ilgili bir bağlamda mitokondriyal fonksiyonun gerçek zamanlı değerlendirmesini elde etmek için süperoksit parlamaları ve zar potansiyel dalgalanmaları gibi tek mitokondriyal olayları yerinde veya in vivo olarak izlemektir. Bu, önce farenin arka bacağındaki iskelet kasının açığa çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İskelet kaslarının daha sonra hızlandırılmış konfokal görüntüleri in vivo olarak elde edilir.

Daha sonra fare kalbi perfüze edilir ve konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenir. Son olarak, görüntüler işlenir ve veriler analiz edilir. Sonuç olarak, zaman atlamalı ve iki boyutlu konfokal görüntüler yoluyla iskelet kaslarında, in vivo veya perfüze kalpte tek mitokondriyal süperoksit parlamaları ve zar potansiyel dalgalanmaları gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, mitokondriyi izole etmede mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi gibi mevcut kaslara göre en büyük avantajı, bu tekniğin fizyolojik olarak ilgili bir durumda tek mitokondriyal fonksiyonun gerçek zamanlı değerlendirmesine izin vermesidir. Bu yöntemin bir bıçak, hayvan veya bıçak dokusu olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü daha dik ve karmaşık bir prosedürdür çünkü konfokal görüntülemenin öğrenilmesi zordur. Metin protokolüne göre izotonik dengeli tuz çözeltisi veya IBSS, Krebs HENSEL Işık Tamponu veya KHB ve cerrahi aletler hazırladıktan sonra, bir fareyi intraperitoneal Pentobarbital enjeksiyonu ile uyuşturun ve hayvanın sakinleştirildiğini doğrulamak için bir ayak parmağı çimdikleme yapın.

Bir tıraş bıçağı kullanarak, bölgeyi% 70 etanol ile dezenfekte etmeden önce arka bacaklardan birindeki tüyleri alın. Daha sonra, mide anemi kaslarını ortaya çıkarmak için uzuvun dış tarafı boyunca cilt üzerinde bir kesi yapın. Sonra keskin forseps kullanarak, epimisyumu nazikçe alın ve içinden bir kesi yapmak için makas kullanın.

Epimisyumu çıkarmak ve altındaki kas liflerini ortaya çıkarmak için daha fazla diseksiyon yapın. IBSS'ye 500 nanomolar tetraetil, çubuk domin metil ester veya TMRM ekleyin ve kası 30 dakika boyunca çözeltiye daldırın. TMRM'yi kas içine yükledikten sonra, kası TMRM içermeyen IBSS ile 40 x yağ objektifi kullanarak yıkayın.

Fareyi konfokal mikroskop tablasına yan yatırın ve arka uzuvu, açıkta kalan iskelet kası kapak kaymasına karşı özel olarak yapılmış bir odada olacak şekilde tutun. Ardından, doku ile kapak kayması arasında sıkı temas sağlamak için bacağa hafifçe bastırın ve sekiz bitlik bir piksel derinliği ve kare başına bir saniyelik örnekleme hızı kullanarak açıkta kalan kasları IBSS'ye daldırın, kasın iki boyutlu bir seri taramasını kaydedin. Önce 405 nanometrede heyecan verici ve 505 nanometreden daha büyük bir hızda toplayarak sıralı görüntüler toplayın.

Daha sonra 505 nanometreden daha büyük toplarken 488 nanometrede heyecan verici. MT'nin çift dalga boylu uyarılması için. CCP YFP, 405, 488 ve 543 nanometrelerde sıralı uyarma kullanır ve sırasıyla 505 ila 5, 45.505 ila 5, 45 ve 560 nanometreden daha büyük emisyon toplar. Fare kalbini görüntülemek için M-T-C-P-Y-F-P ve TMRM'nin üçlü dalga boyu uyarma görüntülemesi için hayvana 200 ünite heparin enjekte edin.

10 dakika bekledikten ve fareyi torakotomi ile ötenazi yaptıktan sonra, kalbi ve akciğerleri ve ona bağlı timusu hızla çıkarın. İmplante edilen dokuyu hızlı bir şekilde buz gibi IBSS'ye aktarın. Sonra timusun loblarını tanımlayın ve nazikçe soyun.

Çıkan aortu ortaya çıkarmak için akciğeri ve timusu çıkarın ve çevredeki dokuları dikkatlice çıkararak aortu izole edin. Daha sonra, aort kemerinin ilk dalından önce çıkan aortun üst ucunda bir kesi yapın. Daha sonra iki mikro dikiş forsepsi ile, lümeni ortaya çıkarmak için aort duvarını nazikçe tutun ve dikkatlice bir kanül üzerine yerleştirin.

Aortu yerinde tutmak için bir mikro damar kelepçesi kullanın ve etrafına hızlı bir şekilde dikişler atın. Kelepçeyi çıkarın ve kanülün ucunun aort kökünün üzerinde olduğunu dikkatlice kontrol etmek için forseps kullanın. Kalbi yerinde tutmak için gerekirse ek bağları sabitleyin.

Peristaltik pompayı açın ve kalbi perfüze edin. Dakikada bir mililitrede, kalp perfüzyon üzerine atmaya devam edecektir. 10 dakikalık stabilizasyondan sonra, kalbi 10 mikromolar BLE statin ve 100 ila 500 nanomolar TMRM ile perfüze edin.

Kalp atışı 10 dakika sonra yavaşlayacaktır. Daha sonra, perfüzyon sisteminin konumunu ayarlayın ve kalbi, odayı 37 santigrat dereceye kadar ısıtmak için bir adaptörle donatılmış mikroskop sahnesine koyun. Kalbi kısmen batırmak için hazneye bir mililitre KHB perfüzyon çözeltisi ekleyin.

Atık suyu hazneden çıkarmak için peristaltik bir pompa kullanın. Kalbin kapak kayması ile sıkı temasını sağlamak ve kalp atışını daha da bastırmak için kalbe yeterli akışı sağlamak için pompanın hızını kademeli olarak artırarak, kalbe hafif bir baskı uygulayın. Organı, bu videoda daha önce kas için anlatıldığı gibi görüntüleyin ve mümkün olan en net görüntüyü ortaya çıkarmak için odak düzlemini ayarlayın.

Konfokal mikroskop yazılımının fizyolojik analiz modülünün kullanılması. Otomatik olarak oluşturulan veritabanını ve ardından analiz edilecek 2B görüntü dosyasını açarak başlayın. İlgilendiğiniz bölgeyi veya YG ortalamasını tıklayın.

ROI modunun ortalamasına geçmek için. Flaşları seçmek için 488 nanometrede CP YFP dışındaki kanalların görüntüsünü kapatın. Görüntüyü yakınlaştırın ve seri 2D görüntüleri oynatmak için kaydırma çubuğunu manuel olarak hareket ettirin.

Daha sonra, floresan sinyalinin geçici olarak arttığı bölgeyi bularak tek mitokondriyal süperoksit flaşlarını tanımlayın. Yanıp sönmeleri işaretlemek için uygun ROI aracını kullanın, her ROI'nin zamana bağlı floresan değişimini gösteren iz görüntünün yanında görünecektir. Tüm flaşları seçtikten sonra, diğer kanalların ekranını açın.

Arka plan sinyali çıkarma işlemi için hücrenin dışındaki görüntüde bir ROI seçin. Ardından, zaman etiketleriyle birlikte her bir ROI'nin ortalama floresansını çıkarın. Seri tarama görüntü dosyalarının her birindeki yanıp sönme sayısını, tarama süresi ve hücrenin alanı ile birlikte kaydedin.

Flaş frekansını 100 saniye başına ve 1000 mikron kare hücre alanı başına yanıp sönme sayısı olarak hesaplamak için excel'i kullanın. Her flaş için zirveye kadar genlik süresini ve bozunma süresini hesaplamak için. Etkileşimli veri dilinde yazılmış özel olarak geliştirilmiş bir programın parçası olan flash parametre analizi için özel olarak geliştirilmiş bir program kullanın.

Bu protokol kullanılarak, anestezi uygulanmış farelerin iskelet kaslarında tek mitokondriyal olayların in vivo görüntülemesi yapılabilir, ardından perfüze kalpte insi görüntüleme yapılabilir. Burada gösterildiği gibi. Bir mitokondriyal membran potansiyel göstergesi olan TMRM, genellikle M-T-C-P-Y-F-P'nin konumunu doğrulamak için kullanılır ve M-T-C-P-Y-F-P sinyali ile tam bir örtüşme modeli göstermelidir.

Spektrumları CP YFP'ninkinden ayırt edilebilir ve sıralı uyarma yöntemini kullanarak, TMRM ve MTCP'nin emisyon sinyalleri birbiriyle etkileşime girmeyecektir. Bu görüntüler, hem iskelet kası dokularında hem de miyokardda arka plan sinyalleri üzerinde geçici bir floresan artışı gösteren seri 2D tarama görüntülerinde, membran depolarizasyonunun eşlik ettiği tek mitokondriyal süperoksit flaşının tanımlanabileceğini göstermektedir. Yüksek çözünürlüğün yanı sıra, yeterli floresan yoğunluğu da gereklidir.

Bu, lazer yoğunluğunun ve toplama kanallarındaki kazancın modüle edilmesiyle elde edilebilir. Genel olarak, hücreden gelen bazal floresan sinyali, kanalın maksimum yoğunluğunun üçte biri ila dörtte biri arasında ayarlanır. M-T-C-P-Y-F-P ekspresyon seviyesi ve TMRM yüklemesi hayvanlar arasında farklılık gösterebileceğinden, metabolik substratlar gibi hem fizyolojik hem de patolojik bozulmalar olmak üzere her deney için görüntüleme koşullarının ince ayarı yapılmalıdır.

Burada belirtildiği gibi elektriksel stimülasyon ve iskemik reperfüzyon, süperoksit flaş aktivitesinin hücresel metabolik durumdaki değişikliklere yanıt verdiğini göstermek için kullanılmıştır. Bu prosedürü denerken, ağzın uygun anestezisini ve perfüze edilmiş kalbin doğru durumunu korumayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, miyokardiyal lösemi ve reperfüzyon hasarı sırasında mitokondriyal disfonksiyon gibi ek soruları yanıtlamak için iskemi ve füzyon gibi diğer yöntemler uygulanabilir.