Name: Tüp bebek Patojen Kaynaklı Nötrofil Trans-epitel Göçünü Değerlendirmek için Coculture Tahlili (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-06T15:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Keşfedin, insan nötrofillerinin epitel hücre katmanları arasında göçünü in vitro modelde nasıl kantitatif olarak değerlendirebilirsiniz. Bu yöntem mukozal enfeksiyonlara karşı immün yanıtları anlamak için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH (1 R01 AI095338-01A1) tarafından finansal olarak desteklendi.

<ol><li>Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+structural+features+that+influence+neutrophil+emigration+into+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung.</a> Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).</li>
<li>Hurley, B. P., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+defense+systems+protect+against+bacterial+threats%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gastroenterol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threats.</a> Curr. Gastroenterol. Rep. 6, 355-361 (2004).</li>
<li>McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial-induced+hepoxilin+A3+secretion+as+a+pro-inflammatory+mediator%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Bacterial-induced hepoxilin A3 secretion as a pro-inflammatory mediator.</a> FEBS J. 274, 3513-3518 (2007).</li>
<li>Mumy, K. L., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neutrophils+in+the+event+of+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The role of neutrophils in the event of intestinal inflammation.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 697-701 (2009).</li>
<li>Chin, A. C., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathobiology+of+neutrophil+transepithelial+migration%3A+implications+in+mediating+epithelial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury.</a> Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).</li>
<li>Segel, G. B., Halterman, M. W., Lichtman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+paradox+of+the+neutrophil%27s+role+in+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">The paradox of the neutrophil's role in tissue injury.</a> J. Leukoc. Biol. 89, 359-372 (2011).</li>
<li>Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+destruction+by+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue destruction by neutrophils.</a> N. Engl. J. Med. 320, 365-376 (1989).</li>
<li>Hurley, B. P., Thorpe, C. M., Acheson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shiga+toxin+translocation+across+intestinal+epithelial+cells+is+enhanced+by+neutrophil+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Shiga toxin translocation across intestinal epithelial cells is enhanced by neutrophil transmigration.</a> Infect. Immun. 69, 6148-6155 (2001).</li>
<li>Kohler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+regulates+intercellular+junction+proteins+and+facilitates+transepithelial+neutrophil+and+bacterial+passage%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Salmonella enterica serovar Typhimurium regulates intercellular junction proteins and facilitates transepithelial neutrophil and bacterial passage.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 178-187 (2007).</li>
<li>Gane, J., Stockley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neutrophil+transmigration+across+the+vascular+endothelium+in+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neutrophil transmigration across the vascular endothelium in COPD.</a> Thorax. 67, 553-561 (2012).</li>
<li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+neutrophils+to+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Contribution of neutrophils to acute lung injury.</a> Mol. Med. 17, 293-307 (2011).</li>
<li>Nakagome, K., Matsushita, S., Nagata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophilic+inflammation+in+severe+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Arch.+Allergy+Immunol.%22%5BJournal%5D)">Neutrophilic inflammation in severe asthma.</a> Int. Arch. Allergy Immunol.. 158 Suppl 1, 96-102 (2012).</li>
<li>Choi, E. Y., Santoso, S., Chavakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neutrophil+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neutrophil transendothelial migration.</a> Front. Biosci. 14, 1596-1605 (2009).</li>
<li>Louis, N. A., Campbell, E., Colgan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+to+investigate+neutrophil+adhesion+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Model systems to investigate neutrophil adhesion and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 412, 257-270 (2007).</li>
<li>Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+to+the+lungs+during+bacterial+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia.</a> Infect. Immun. 77, 568-575 (2009).</li>
<li>Hurley, B. P., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+tissue+culture+results+into+animal+models%3A+the+case+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Translating tissue culture results into animal models: the case of Salmonella typhimurium.</a> Trends Microbiol. 11, 562-569 (2003).</li>
<li>Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+neutrophil+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro neutrophil transepithelial migration.</a> Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).</li>
<li>Hurley, B. P., Siccardi, D., Mrsny, R. J., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphonuclear+cell+transmigration+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+requires+the+eicosanoid+hepoxilin+A3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Polymorphonuclear cell transmigration induced by Pseudomonas aeruginosa requires the eicosanoid hepoxilin A3.</a> J. Immunol. 173, 5712-5720 (2004).</li>
<li>McCormick, B. A., Colgan, S. P., Delp-Archer, C., Miller, S. I., Madara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+attachment+to+human+intestinal+epithelial+monolayers%3A+transcellular+signalling+to+subepithelial+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils.</a> J. Cell Biol. 123, 895-907 (1993).</li>
<li>McCormick, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+attachment+of+Salmonella+typhimurium+to+intestinal+epithelia+imprints+the+subepithelial+matrix+with+gradients+chemotactic+for+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Surface attachment of Salmonella typhimurium to intestinal epithelia imprints the subepithelial matrix with gradients chemotactic for neutrophils.</a> J. Cell Biol. 131, 1599-1608 (1995).</li>
<li>Mrsny, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hepoxilin+A3+in+inflammatory+events%3A+a+required+role+in+neutrophil+migration+across+intestinal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of hepoxilin A3 in inflammatory events: a required role in neutrophil migration across intestinal epithelia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7421-7426 (2004).</li>
<li>Tamang, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepoxilin+A%283%29+facilitates+neutrophilic+breach+of+lipoxygenase-expressing+airway+epithelial+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hepoxilin A(3) facilitates neutrophilic breach of lipoxygenase-expressing airway epithelial barriers.</a> J. Immunol. 189, 4960-4969 (2012).</li>
<li>McCormick, B. A., Parkos, C. A., Colgan, S. P., Carnes, D. K., Madara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+secretion+of+a+pathogen-elicited+epithelial+chemoattractant+activity+in+response+to+surface+colonization+of+intestinal+epithelia+by+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattractant activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by Salmonella typhimurium.</a> J. Immunol. 160, 455-466 (1998).</li>
<li>Boll, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroaggregative+Escherichia+coli+promotes+transepithelial+migration+of+neutrophils+through+a+conserved+12-lipoxygenase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enteroaggregative Escherichia coli promotes transepithelial migration of neutrophils through a conserved 12-lipoxygenase pathway.</a> Cell Microbiol. 14, 120-132 (2012).</li>
<li>Hurley, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two-component+sensor+response+regulator+RoxS%2FRoxR+plays+a+role+in+Pseudomonas+aeruginosa+interactions+with+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The two-component sensor response regulator RoxS/RoxR plays a role in Pseudomonas aeruginosa interactions with airway epithelial cells.</a> Microbes Infect. 12, 190-198 (2010).</li>
<li>Hurley, B. P., Williams, N. L., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+phospholipase+A2+in+Pseudomonas+aeruginosa-mediated+PMN+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-mediated PMN transepithelial migration.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290, L703-L709 (2006).</li>
<li>McCormick, B. A., Siber, A. M., Maurelli, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+the+Shigella+flexneri+virulence+plasmid+in+the+ability+to+induce+trafficking+of+neutrophils+across+polarized+monolayers+of+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Requirement of the Shigella flexneri virulence plasmid in the ability to induce trafficking of neutrophils across polarized monolayers of the intestinal epithelium.</a> Infect. Immun. 66, 4237-4243 (1998).</li>
<li>Savkovic, S. D., Koutsouris, A., Hecht, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+a+noninvasive+enteric+pathogen%2C+enteropathogenic+Escherichia+coli%2C+to+cultured+human+intestinal+epithelial+monolayers+induces+transmigration+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Attachment of a noninvasive enteric pathogen, enteropathogenic Escherichia coli, to cultured human intestinal epithelial monolayers induces transmigration of neutrophils.</a> Infect. Immun. 64, 4480-4487 (1996).</li>
<li>Agbor, T. A., Demma, Z. C., Mumy, K. L., Bien, J. D., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ERM+protein%2C+ezrin%2C+regulates+neutrophil+transmigration+by+modulating+the+apical+localization+of+MRP2+in+response+to+the+SipA+effector+protein+during+Salmonella+typhimurium+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ERM protein, ezrin, regulates neutrophil transmigration by modulating the apical localization of MRP2 in response to the SipA effector protein during Salmonella typhimurium infection.</a> Cell Microbiol. 13, 2007-2021 (2011).</li>
<li>Pazos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug+resistance-associated+transporter+2+regulates+mucosal+inflammation+by+facilitating+the+synthesis+of+hepoxilin+A3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multidrug resistance-associated transporter 2 regulates mucosal inflammation by facilitating the synthesis of hepoxilin A3.</a> J. Immunol. 181, 8044-8052 (2008).</li>
<li>Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+induces+transuroepithelial+neutrophil+migration+by+an+intercellular+adhesion+molecule-1-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism.</a> Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).</li>
<li>Bhowmick, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Disease+during+Streptococcus+pneumoniae+Acute+Lung+Infection+Requires+12-Lipoxygenase-Dependent+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Systemic Disease during Streptococcus pneumoniae Acute Lung Infection Requires 12-Lipoxygenase-Dependent Inflammation.</a> J. Immunol. , (2013).</li>
<li>Hurley, B. P., Pirzai, W., Mumy, K. L., Gronert, K., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+eicosanoid-generating+capacity+of+cytoplasmic+phospholipase+A2+in+Pseudomonas+aeruginosa-infected+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Selective eicosanoid-generating capacity of cytoplasmic phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-infected epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 300, 286-294 (2011).</li>
<li>Hurley, B. P., Sin, A., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+molecules+involved+in+hepoxilin+A3-mediated+neutrophil+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adhesion molecules involved in hepoxilin A3-mediated neutrophil transepithelial migration.</a> Clin. Exp. Immunol. 151, 297-305 (2008).</li>
<li>Frank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+Topic+on+Pseudomonas+aeruginosa%2C+Biology%2C+Genetics%2C+and+Host-Pathogen+Interactions.%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions.</a> Front. Microbiol. 3, 20 (2012).</li>
<li>Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+infections+associated+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Lung infections associated with cystic fibrosis.</a> Clin. Microbiol. Rev. 15, 194-222 (2002).</li>
<li>Bucior, I., Mostov, K., Engel, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa-mediated+damage+requires+distinct+receptors+at+the+apical+and+basolateral+surfaces+of+the+polarized+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa-mediated damage requires distinct receptors at the apical and basolateral surfaces of the polarized epithelium.</a> Infect. Immun. 78, 939-953 (2010).</li>
<li>Kierbel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+exploits+a+PIP3-dependent+pathway+to+transform+apical+into+basolateral+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa exploits a PIP3-dependent pathway to transform apical into basolateral membrane.</a> J. Cell Biol. 177, 21-27 (2007).</li>
<li>Lee, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+Salmonella+protein+induces+a+proinflammatory+response+in+epithelial+cells%2C+which+promotes+neutrophil+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial cells, which promotes neutrophil migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12283-12288 (2000).</li>
<li>Zurawski, D. V., Mumy, K. L., Faherty, C. S., McCormick, B. A., Maurelli, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+flexneri+type+III+secretion+system+effectors+OspB+and+OspF+target+the+nucleus+to+downregulate+the+host+inflammatory+response+via+interactions+with+retinoblastoma+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shigella flexneri type III secretion system effectors OspB and OspF target the nucleus to downregulate the host inflammatory response via interactions with retinoblastoma protein.</a> Mol. Microbiol. 71, 350-368 (2009).</li>
<li>Brazil, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+across+intestinal+epithelium%3A+evidence+for+a+role+of+CD44+in+regulating+detachment+of+migrating+cells+from+the+luminal+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration across intestinal epithelium: evidence for a role of CD44 in regulating detachment of migrating cells from the luminal surface.</a> J. Immunol. 185, 7026-7036 (2010).</li>
<li>Lawrence, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiadhesive+role+of+apical+decay-accelerating+factor+%28CD55%29+in+human+neutrophil+transmigration+across+mucosal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Antiadhesive role of apical decay-accelerating factor (CD55) in human neutrophil transmigration across mucosal epithelia.</a> J. Exp. Med. 198, 999-1010 (2003).</li>
<li>Hodges, K., Hecht, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+communication+in+the+gut%2C+from+bacterial+delivery+to+host-cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Interspecies communication in the gut, from bacterial delivery to host-cell response.</a> J. Physiol. 590, 433-440 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Mukozal epitel yüzeylerde nötrofil göçü bakteriyel patojenlerle enfeksiyonu takiben hastalık patolojisinde yaygın bir özelliktir3. Burada açıklanan metodoloji, bakteriyel enfeksiyonların tetiklediği enflamatuar sürecin bir özelliğini modelleyen bir insan hücresi türetilmiş in vitro kokültür tahlil sistemini kullanarak bu ayrık olayı deneysel olarak izole etmek için hızlı ve basit bir yaklaşım sunmaktadır. Bu sistem başlangıçta Salmonella typhimurium, Shigella flexnerive çeşitli patoj...

Mukozal yüzeyler, çevreye nüfuz eden dış tehditlere karşı koruma sağlayan fiziksel ve immünolojik bariyerler görevi görer1,2. Patojenik organizmalar istila ettiğinde bu koruyucu epitel bariyeri tehlikeye atılabilir2. Bakteriyel bir patojen durumunda, bu karşılaşma genellikle doğuştan gelen bağışıklık sistemini aktive ederek ve nötrofiller2-4olarak bilinen ilk müdahale granülositlerinin hızlı bir şekilde harekete geçirilmesine neden olarak enflamatuar bir süreci tetikler. Nötrofil alımını kolaylaştıran kemotaktik ajanlar kısmen, konukcu patojen2-4'tenkurtulmak isteyen mukozal epitel hücreleri tarafından üretilir. Mukozal epitel yüzeyinin aşırı veya çözülmemiş nötrofil infiltonu önemli patolojiye neden olabilir1,5. Bu, anti-bakteriyel nötrofil cephaneliğinin neden olduğu spesifik olmayan doku hasarının bir sonucudur5-7. Bu gibi durumlarda, nötrofillerin bakteriyel boşluk kapasitesi, bulaşıcı bir hakaret sırasında konak dokusunun tahrip edilmesiyle gölgelenmiştir.  Koruyucu epitel bariyer fonksiyonunun bozulması, alttaki dokunun mikroorganizmalara ve/veya toksinlere daha fazla maruz kalmasına yol açarak hastalık patolojisini daha da kötüleştirebilir8,9. Bu sonuçlar akciğer ve sindirim sistemi de dahil olmak üzere birden fazla organ sisteminde görülebilir1,5. Ayrıca, şiddetli astım nöbetleri, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS) ve inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) gibi noninferektif inflamatuar durumlar, mukozal epitel bariyerinin patolojik ihlali ile aşırı nötrofik yanıt4,5,10-12ile işaretlenmiştir.
Mukozal enfeksiyonu takiben nötrofil işe alımının karmaşık süreci, birkaç bölümlere ayrılmış adım1,5,13,14içerir. İlk olarak, nötrofiller trans-endotel göçini kolaylaştıran bir dizi hücreden hücreye etkileşim yoluyla dolaşımdan kalkmalıdır1,13. Nötrofiller daha sonra hücre dışı matris1,14içeren mevcut geçiş boşluğunda gezinir. Enfekte mukozanın lümenine ulaşmak için, nötrofillerin daha sonra epitel bariyeri1,4,5boyunca göç etmesi gerekir. Bu karmaşık multistep fenomeni genellikle enfeksiyonun in vivo hayvan modelleri kullanılarak agregada araştırılır15. Bu tür modeller, kemokinler, yapışma molekülleri veya genel sürece katılan ancak her ayrı bölümlere ayrılmış adım16için kritik olan moleküler katkıları çözmek için büyük ölçüde yetersiz olan sinyal yolları gibi belirli faktörlerin gerekliliğini belirlemek için yararlıdır. Nötrofillerin trans-endotel, trans-matris veya trans-epitel göçünü modelleyen kokültüre in vitro sistemler bu konuda özellikle yararlı olmuştur1,14,16,17.
Patojenik enfeksiyon18-22'yeyanıt olarak nötrofil trans-epitel göçünden sorumlu mekanizmaların deşifre edilmesi amacıyla sağlam bir kokültür tahlil sistemi geliştirilmiştir. Bu model, polarize insan epitel hücre katmanlarının apikal yüzeyini bakteriyel bir patojenle enfekte etmeyi ve ardından yeni izole edilmiş insan nötrofillerinin bazolateral yüzeye uygulanmasını içerir18-22. Nötrofiller, patojenik enfeksiyon18,21-23'ünardından salgılanan epitel türevi kemotektik ürünlere yanıt olarak epitel bariyeri boyunca göç eder. Bu model sistemi, uygun doku spesifik bakteriyel patojenlere maruz kalan bağırsak ve akciğer epitel kültürleri kullanılarak kullanılmıştır ve mukozal enfeksiyon sırasında nötrofil işe alım süreci için önemli olan yeni moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmıştır3,8,19,24-28. Bu in vitro kokültür modelinin gücü, indirgemeci bir yaklaşımın araştırmacının iyi kontrol edilen, oldukça tekrarlanabilir, oldukça ucuz bir sistemde patojeni, epitel bariyerini ve/ veya nötrofili deneysel olarak manipüle etmesini sağlar. Bu yaklaşımdan toplanan içgörü, in vivo enfeksiyon modelleri22,29,30kullanarak nötrofil alımı sırasında bölümlere ayrılmış olayların odaklanmış analizini yapmak için etkili bir şekilde kullanılabilir.
Bu makalede, patojen kaynaklı nötrofil trans-epitel göçini keşfetmek için bu tekrarlanabilir modelin başarılı bir şekilde kurulması için gerekli birden fazla adım göstermektedir.  Pseudomonas aeruginosa patojeni ile enfekte olan akciğer epitel bariyerleri bu makalede yer almaktadır; bununla birlikte, diğer doku epitelleri ve patojenleri küçük değişikliklerle değiştirilebilir. Ters kollajen kaplı geçirgen transwell filtrelerinde polarize akciğer epitel hücre katmanlarının tohumlaması ve kültleştirilmesi, patojenik P. aeruginosa'nın büyümesi ve nötrofillerin tam kandan izolasyonu gibi burada ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu bileşenlerin patojen kaynaklı nötrofil trans-epitel göçünü gözlemlemek için nasıl birleştirildiği, tekrarlanabilir bir test oluşturmak için uygun pozitif ve negatif kontrollerle birlikte sunulmaktadır. Patojen kaynaklı nötrofil trans-epitel göçünün çeşitli yönlerini incelemek için bu yaklaşımın çok yönlülüğü literatürdeki belirli çalışmalara atıfta bulunularak tartışılmaktadır.

<table><tbody><tr><td>NCl-H292 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-1848</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 orta</td><td>ATCC</td><td>30-2001</td><td></td></tr><tr><td> Pseudomonas aeruginosa PAO1</td><td>ATCC</td> <td># 47085</td><td></td></tr><tr><td> Escherichia coli MC1000</td><td>ATCC</td> <td># 39531</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (1x) sıvı</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td>kalsiyum ve magnezyum olmadan</td></tr><tr><td>Isı ile İnaktive Fetal sığır serumu</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>%10 kültür ortamına eklendi</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>100x: 10.000 birim penisilin ve 10.000 &mikro; ml başına g streptomisin.</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.05)</td> <td>İnvitrojen</td><td>25300-062</td><td>50 ml alikotlar -20 ° C'de donmuş olarak saklanır. Kullanımda olan alikot 4 &gtm'de saklanabilir; C kısa vadeli.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi - HBSS(-)</td><td>Invitrogen</td><td>14175-079</td><td>Steril, kalsiyum ve magnezyum içermez</td></tr><tr><td>Tripan Mavisi Çözeltisi</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061.</td><td>Stok = %0,4</td></tr><tr><td>Kollajen, Sıçan Kuyruğu</td><td>Invitrogen</td><td>A10483-01</td><td>Standart protokoller kullanılarak laboratuvarda doğrudan sıçanların kuyruklarından da izole edilebilir</td></tr><tr><td>Sitrik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909-500G</td><td>1 M sitrat tamponu ve asit sitrat dekstroz (ACD) çözeltisi</td></tr><tr><td>Sodyum Sitrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641-500G</td><td>1 M sitrat tamponunun</td></tr><tr><td>bileşeni Dekstroz susuz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8066-250G</td><td>Asit sitrat dekstroz (ACD) çözeltisinin bileşeni</td></tr><tr><td>Amonyum Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213330-500G</td><td>Kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tamponunun bileşeni</td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-500G</td><td>Kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tamponunun bileşeni</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED-100G</td><td>Kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tamponunun bileşeni</td></tr><tr><td>HBSS (+) toz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1387-10L</td><td>HBSS +</td></tr> <tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-500G'nin</td> ana bileşeni <td>HBSS +</td></tr> <tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-25ML'nin</td> bileşeni <td>Cam pipet uçlarını kaplamak için satıcının talimatlarını izleyin</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>2,2'-Azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit) diamonyum tuzu (ABTS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9941-50TAB</td><td>ABTS substrat çözeltisinin ana bileşeni</td></tr><tr><td>%30 Hidrojen Peroksit Çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ML</td><td>ABTS substrat çözeltisinin bileşeni</td></tr><tr><td>N-Formil-Met-Leu-Phe (fMLP veya fMLF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-3506</td><td>DMSO'da 10 mM'lik bir Stok çözeltisi hazırlanmalı ve alikotlar -20 &ordm;C'de saklanmalıdır.</td></tr><tr><td>Jelatin Tip B</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-12026</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas izolasyon agar&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0927-17-1</td><td>Üreticiyi takip edin PIA plakaları yapmak için talimatlar</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-749</td><td>İsteğe bağlı, nötrofil saflığını artırabilir</td></tr><tr><td>24 oyuklu migrasyon plakası</td><td>Corning Incorporated</td><td>#3524</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu yıkama plakası</td><td>Falcon</td><td>35-1147</td><td>%70 etanole batırılırsa ve yeniden kullanımdan önce iyice yıkanırsa tekrar kullanılabilir</td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka</td><td>Fisher Scientific</td><td>#12565501</td><td></td></tr><tr><td>Transwell Geçirgen Destekler&nbsp;</td><td>Corning Incorporated</td> <td># 3415</td><td>Polikarbonat; Çap: 6,5 mm; Büyüme alanı: 0.33 cm2; Çanak stili: 24 oyuklu plaka; Gözenek boyutu: 3.0 ve mikro; m</td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>Falcon</td><td>35-1013</td><td>Her Petri kabı 24 adet ters 0,33 cm 2 Transwells içerir. &nbsp;</td></tr><tr><td>500 ml 0.2 &mu; m filtre / şişe</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-25A</td><td>Asit sitrat dekstroz (ACD) solüsyonunu</td></tr><tr><td>5-3 / 4 camda sterilize etmek için Pastör pipeti</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>Kullanmadan önce uçları Sigmacote ile kaplayın</td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-14</td><td>Kavisli, Tırtıklı</td></tr><tr><td>İnvertoskop Ters Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>#342222</td><td></td></tr><tr><td>Versa-Max Mikroplaka Okuyucu</td><td>Moleküler Cihazlar</td> <td># 432789</td><td></td></tr></tbody></table>

tüp bebek patojen kaynaklı nötrofil trans-epitel göçünü değerlendirmek için coculture tahlili

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mukozal yüzeyler patojenik organizmalara karşı koruyucu bariyerler görevi eder. Doğuştan gelen immün yanıtlar, başta nötrofiller olmak üzere göç eden enflamatuar hücrelere sahip dokuların sızmasına yol açan patojeni algılayarak aktive edilir. Bu süreç aşırı veya çözülmemiş durumda tutulursa dokulara zarar verme potansiyeline sahiptir.  Kokültüre in vitro modeller patojen kaynaklı nötrofil trans-epitel göçünde rol oynayan benzersiz moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilir. Bu tür bir model, patojenin, epitel bariyerinin veya nötrofilin kontrollü manipülasyonu için fırsat ile deneysel tasarımda çok yönlülük sağlar. Geçirgen transwell filtrelerinde yetişen polarize epitel monolayerlerin apikal yüzeyinin patojenik enfeksiyonu, bazolateral yüzeye uygulanan nötrofillerin apikal trans-epitel göçüne fizyolojik olarak ilgili bazolateral instiakte eder. Burada açıklanan in vitro model, patojenik P. aeruginosa (PAO1) ile enfekte olmuş polarize bir akciğer epitel monolayerinde nötrofil göçünü göstermek için gerekli olan birden fazla adımı göstermektedir. geçirgen transwelllerin insan türevi akciğer epitel hücreleri ile tohumlandırılması ve kült örülmesi, nötrofillerin tüm insan kanından izolesi ve PAO1 ve nonpathojenik K12 E. coli 'nin (MC1000) kültürü ile birlikte tanımlanmıştır.  Patojenik enfeksiyona yanıt olarak harekete geçirilen başarılı göç etmiş nötrofillerin göç süreci ve nicel analizi, pozitif ve negatif kontroller de dahil olmak üzere temsili verilerle gösterilmiştir. Bu in vitro model sistemi manipüle edilebilir ve diğer mukozal yüzeylere uygulanabilir. Aşırı nötrofil infiltrasyonunu içeren enflamatuar yanıtlar konak dokular için yıkıcı olabilir ve patojenik enfeksiyonların yokluğunda ortaya çıkabilir. Burada açıklanan in vitro kokültür tahlil sisteminin deneysel manipülasyonu yoluyla nötrofil trans-epitel göçünü teşvik eden moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılması, bir dizi mukozal enfeksiyöz ve enflamatuar hastalık için yeni terapötik hedefleri belirlemek için önemli bir potansiyele sahiptir.

Çeşitli çalışmalar patojenle enfekte epitel katmanlarının nötrofil trans-epitel göçlerini kolaylaştırdığını göstermiştir3,8,19,24-28,31,32. Bu, epitel hücre türevi nötrofil kemotektik gradyanın patojene özgü indüksiyonu ile meydana gelir3,23. Örneğin, akciğer epitel hücrelerinin apikal yüzeyi ile etkileşime giren patojenik P. aeruginosa, epitel tabakası boyunca önemli sayıda nötrofilin göç etmesine neden olur18,22,25,26,33,34. Bu klinik olarak ilgili tahlil sistemi, uygun kontrol...

Mukozal bakteriyel enfeksiyona yanıt olarak nötrofil trans-epitel göçü epitel yaralanmasına ve klinik hastalığa katkıda bulunur. Bu fenomeni düzenleyen moleküler mekanizmaların çözülmesine yönelik araştırmaları kolaylaştırmak için transwell filtrelerinde yetişen patojen, insan nötrofilleri ve polarize insan epitel hücre katmanlarını birleştiren bir in vitro model geliştirilmiştir.

Tüp bebek Patojen Kaynaklı Nötrofil Trans-epitel Göçünü Değerlendirmek için Coculture Tahlili

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, enfeksiyona yanıt olarak bir epitel hücre tek tabakasını geçen nötrofillerin sayısını belirlemektir. Bu, ters çevrilmiş transwell filtre manevrası kullanılarak epitel hücresi tek katmanlarını dikkatli bir şekilde yetiştirmeden önce transwellleri kodlayan kollajen ile elde edilir. İkinci adım olarak, transwell filtreleri üzerinde büyüyen epitelyal tek tabakanın apikal yüzeyini enfekte etmek için bakteriyel patojen kültürlenir, bu da epitel hücrelerinin endojen nötrofil kemo cezbedici maddeler üretmesine neden olur.Daha sonra, tam kandan izole edilen nötrofiller, nötrofillerin bazolateralden apikal tarafa göçünü test etmek için transwell filtreleri üzerinde büyütülen enfekte epitelyal tek tabakaların bazolateral tarafına eklenir. Migrasyon nötrofillerden miyelo peroksidazın miktar tayinine dayalı olarak enfekte epitelyal tek tabakalara yanıt olarak gözlenen trans epitelyal göç eden nötrofillerin sayısında önemli bir artış gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir, çünkü epitel bariyerlerini büyütmek ve enfekte etmek için ters çevrilmiş transwell filtre manevrası geleneksel değildir ve bu nedenle yabancı araştırma gruplarının laboratuvarlarında kurmaları için daha az ulaşılabilir olabilir.Bu tekniğin etkileri, pnömoni veya kistik fibroz gibi enfeksiyonu içeren hava yolu enflamatuar hastalıklarının tedavisine kadar uzanır, çünkü nötrofil trans epitel göçünün miktarını azaltmak için yeni tedaviler geliştirilebilir ve test edilebilir, bu da aşırı hevesli nötrofilik, mukozal bariyerlerin ihlalinin zararlı etkilerini hafifletebilir. Laboratuvarımda klinik bir araştırmacı olan Mark ile birlikte, prosedürü gösteren kıdemli teknisyen Wahi Preza ve doktora sonrası araştırmacı Michael Pesos olacak. Başlamak için, 0.33 santimetre kare büyüme alanını, ambalajdan üç mikrometre gözenek boyutuna sahip Transwells'i çıkarın ve 12 transwell içeren 24 oyuklu plakayı davlumbazın içine baş aşağı yerleştirin.Alt plakayı kaldırın ve bir kenara koyun. Transwell'ler artık baş aşağı olacak. 24 oyuklu plakanın kapağının üzerine dinlendirilen alev, sterilite için bir kanama durdurucu ve soğumaya bırakın.Steril hemostat transfer transwell'lerini 150 x 25 milimetrelik bir Petri kabına kullanarak, ters pozisyonda tutarak, etanolde mililitre başına 30 mikrogram kollajen çözeltisinin 70 mikrolitresini her ters çevrilmiş transwell yüzeyinin filtre membranına pipetleyin Alt tarafın yüzeyine erişirken filtre membranının etrafında duvar olmadığı için gerilim bu hacimdeki çözeltiyi yerinde tutmalıdır. Kollajen solüsyonunun transwell'in yanından aşağı damlamamasına dikkat edin ve kaplama prosedürü sırasında transwell'leri hareket ettirmekten kaçının. Bu işlem sırasında steriliteyi korumak için etanolün buharlaşmasını sağlamak için Petri kabının kapağını en az dört saat kapalı bırakın.Epitel hücrelerini metin protokolünde açıklandığı gibi paketledikten sonra davlumbaz fanını ve ultraviyole ışığını açık tutun. 15 mililitrelik bir tüpten 70 mikrolitre Resus askıda hücre solüsyonunu her bir ters çevrilmiş kollajen kaplı transwell içine ekleyin. Transwell'leri tohumlarken hücrelerin 15 mililitrelik tüpün dibine çökmesini önlemek için tüpü periyodik olarak hafifçe ters çevirerek hücre süspansiyonunu karıştırın.Tüm ters çevrilmiş transwell'ler epitel hücreleri ile tohumlandıktan sonra, Petri kabı kapağını değiştirin ve hücreleri ertesi gün doku kültürü inkübatörüne dikkatlice yerleştirin. Orijinal steril 24 Kuyucuklu plakanın her bir oyuğuna bir mililitre ortam ekleyin ve her bir ters çevrilmiş trans kuyusunu bir mililitre ortam içeren her bir oyuğa çevirmek için sterilize edilmiş bir hemostat kullanın. Her trans kuyucuğunun üst haznesine 0.2 mililitre besiyeri ekleyin ve doku kültürü inkübatörüne geri dönün.Transwell filtre membranlarının alt tarafında en az sekiz gün boyunca kültürlenmiş epitel tabakalarını destekleyen 24 oyuklu plakayı inkübatörden çıkarın. Her transın kenarını bir hemostat ile iyice kavrayın ve 24 oyuklu plakadan kaldırın. Kültür ortamını Transwell'in iç haznesinden atmak için transwell'i bir atık kovası üzerinde ters çevirin.Transwell'in iç haznesini doldurmak için her bir transwell'i Hank'in kalsiyum ve magnezyum ile dengeli tuz solüsyonu veya Hank's Plus içeren bir yıkama kabına batırın. Ardından sıvıyı iç hazneden bir atık kovasına atın. Bu adımı bir saniye boyunca tekrarlayın.İki yıkamadan sonra Hank's plus'ta yıkayın. Transwell'leri bir mililitre Hank's Plus içeren 24 oyuklu yeni bir plakaya yerleştirin. Her kuyucukta, epitel hücre tabakası bütünlüğünü değerlendirmek için her bir transwell'in üst odasını gözlemleyin.Hank's Plus, bir mililitre Hank's Plus içeren 24 oyuklu bir plakanın kuyusuna yerleştirildiğinde Transwell'in üst haznesine sızmamalı ve doldurmamalıdır. Her bir transwell'i dikkatlice gözlemledikten sonra, üst hazneye 0,2 mililitre Hanks Plus ekleyin. Nötrofil trans epitel migrasyon testini gerçekleştirmek için epitel hücre katmanlarını dengelemek için plakayı 30 ila 60 dakika inkübatöre yerleştirin.Her bir transwell'i, Hank's Plus'ta dengelenmiş 24 oyuklu Wash Transwell plakasından bir hemostat ile kavrayın ve üst kuyudaki sıvıyı bir atık kovasına atın. Her bir transwell'i 150 x 25 milimetrelik bir Petri kabına ters çevrilmiş transwell'lerin altısına baş aşağı yerleştirin. Ters çevrilmiş transwelllerin üçüne 25 mikrolitre Hanks plus ekleyin.Hücreleri 25 mikrolitre Pseudomonas, arosa veya Pao ile enfekte edin, biri Hanks'te seyreltilmiş ve metin protokolünde açıklandığı gibi son üçe kadar hazırlanmış, Ters çevrilmiş transwell, hücreleri 25 mikrolitre e Coli, K 12 veya Hanks Plus'ta seyreltilmiş mc 1000 ile enfekte eder, ayrıca nemlendirilmiş bir odada 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 60 dakika inkübe edildikten sonra metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlanır. Transwell'leri bir hemostat ile kavrayarak ve bir mililitre Hank's plus içeren 24 kuyulu bir yıkama plakasına geri çevirerek yıkayın. Alt odalarda.Üst bölmelere 0,2 mililitre Hank's plus ekleyin. Transwell'i bir kanama durdurucu ile kavrayın ve ilk yıkama plakasından çıkarın. Üst haznedeki sıvıyı bir atık kovasına atın.Transwells'i bir mililitre Hanks plus içeren ikinci bir 24 kuyulu yıkama plakasına yerleştirmeden önce, üst hazneye 0.2 mililitre Hanks plus ekleyin. Toplam üç yıkama için bu adımı bir kez daha tekrarlayın. Üçüncü yıkamadan sonra, trans kuyularının üst odalarındaki sıvıyı bir hemostat kullanarak bir atık kovasına atın, enfekte olmamış trans kuyucuklarından üçünü, bir mililitre Hanks Plus içeren 24 Kuyu migrasyon plakasının üç kuyusuna yerleştirin, bu da negatif kontrol pipetini temsil eden 10 mikrolitre 10 mikromolar FMLP çözeltisini, bir mililitre Hanks içeren 24 Kuyu migrasyon plakasının üç kuyusunun her birine 10 mikrolitre FMLC içerir ayrıca enfekte olmamış trans kuyularından üçünü, izole nötrofillerin göç etme kabiliyeti için pozitif bir kontrolü temsil eden 100 Nanomolar FMLP içeren 24 Kuyu göç plakasının üç kuyusuna yerleştirin.Daha sonra, PAO ile enfekte olmuş üç trans kuyusunu, bir ve mc 1000 ile enfekte olmuş üç trans kuyusunu, bir mililitre Hanks içeren 24 Kuyu migrasyon plakasının karşılık gelen üç kuyusuna yerleştirin ve her trans kuyusunun üst odasına 0,1 mililitre Hanks plus ekleyin, her transta 0,1 mililitre Hanks plus'ın üstüne. Metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlanan 20 mikrolitre nötrofil süspansiyonunu dikkatlice ekleyin. Nötrofillerin trans epitelyal göçüne izin vermek için iki saat inkübe edin.İki saatlik migrasyondan sonra, bir hemostat ile kavrayarak transwell'leri kaldırın ve 24 kuyulu migrasyon plakasının iç duvarlarına hafifçe vurun. Trans kuyularını atmadan önce, 24 kuyulu migrasyon plakasının kuyularını 10 x objektif kullanarak ters çevrilmiş bir mikroskop altında inceleyerek kuyulardaki nötrofillerin göçünü brüt olarak değerlendirin. Daha sonra 24 kuyulu migrasyon plakasında kullanılan her bir kuyucuğa, her standart ve boşluğa 50 mikrolitre %10 Triton X 100 ekleyin.24 kuyu migrasyon plakası standardını döndürün ve 20 dakika boyunca düşük hızda boşaltın. Dört santigrat derecede. 50 mikrolitre sitrat tamponu ekleyin.İkişer kuyu içinde kullanılan 24 kuyulu migrasyon plakası her bir standarda ve boşluğa iyice yapılır. Çözeltiyi en az beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek her bir numunedeki içeriği iyice karıştırın. Daha sonra her bir numune kuyucuğunun 100 mikrolitresini iki parça halinde 96 oyuklu plaka transferine, her standarttan 100 mikrolitre ve boşluğu 96 oyuklu plakaya aktarın.Karıştırdıktan sonra, A BTS çözeltisine 50 mikrolitre% 30 hidrojen peroksit ekleyin ve girdap yapın. Ardından her numuneye 100 mikrolitre A BTS substrat çözeltisi ekleyin. 96 oyuklu plakada, plakanın karanlıkta beş ila 10 dakika gelişmesine izin verin.405 nanometre dalga boyunda okumadan önce lizen nötrofilleri içeren plakanın kuyucuklarında yeşil rengin gelişimini gözlemleyin. Nötrofil trans epitelyal migrasyonu değerlendirmek için bir mikroplaka okuyucu kullanarak, epitel tabakası boyunca apikal odaya tamamen göç eden nötrofiller, ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu kullanılarak burada görselleştirildiği gibi 24 kuyulu migrasyon plakasının alt kuyusunda görüntülenebilir. Çok az sayıda nötrofilin, kemotaktik gradyan uygulanmadan enfekte olmamış bir epitel tabakası boyunca göç ettiği ve testte arka plan seviyelerini temsil ettiği gözlendi.Buna karşılık, bir FMLP gradyanı sağlandığında bol miktarda transmi nötrofil belirgindi. Epitelin patojenik olmayan e coli mc 1000 ile enfeksiyonu, az sayıda görünür trans migrasyonlu nötrofil ile sonuçlanırken, epitel tabakaları akciğer patojenik pseudomonas aerojeni ile enfekte olduğunda birçok trans migrasyonlu nötrofil gözlenmiştir. Deneyde göç eden nötrofiller, miyelo peroksidaz aktiviteleri ölçülerek ölçülür.Nötrofillerin sayısı, nötrofillerin lizizini takiben ölçülen peroksidaz aktivitesi miktarı ile pozitif korelasyon gösterir ve değerler, standart eğri için seçilen nötrofil sayıları aralığında doğrusal bir ilişki sergiler. Önemli sayıda nötrofil, sağlanan FMLP gradyanına yanıt olarak veya PAO ile enfekte olmuş bir epitel tabakasına yanıt olarak epitel tabakaları boyunca göç eder. Uyaranların yokluğunda veya patojenik olmayan e coli mc 1000 ile apikal epitel enfeksiyonunu takiben göç eden nötrofillerin sayısı, test için tespit sınırının altındadır.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, epitel hücrelerinin transwell filtreleri üzerine kollajen kaplanması ve tohumlanması için beş saat içinde yapılabilir, ardından epitel hücrelerinin büyümesine izin vermek için en az bir hafta sürebilir. Epitelyal tek tabakalar hazır olduğunda. Migrasyon testi, nötrofillerin izolasyonu ve uygun şekilde yapılırsa bakterilerin hazırlanması dahil olmak üzere beş saat içinde gerçekleştirilebilir.Bu prosedürü denerken, kontaminasyonu önlemek için transwell filtrelerini steril koşullar altında hazırlamayı unutmamak önemlidir. Bu prosedür, bu enflamatuar süreçle ilgili ek soruları yanıtlamak için uyarlanabilir. Göç eden hücrelerin, epitelin, sırtın ve hatta patojenin analizi yapılabilir.

in-vitro-coculture-assay-to-assess-pathogen-induced-neutrophil-trans

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu makale ilk umblikal damarlar, insan endotel hücreleri izole etmek için bir yordam açıklanır ve sonra akış koşullarında nötrofil göçü incelemek için bu hücreleri nasıl kullanılacağını gösterir. Camın optik karakteristikler ile bir polimer elde edilen bir düşük hacimli akış odası kullanılarak, nadir hücre popülasyonlarının canlı-hücre flüoresan görüntüleme da mümkündür.

Akış Koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil Transmigration Çalışmaları Kullanılması İzolasyonu

Enfeksiyon bölgelerinde aktif endotele nötrofil bağlılık konağın inflamatuvar yanıt ayrılmaz bir bileşenidir. Için izin veren bir nötrofil bağlayıcı bir testtir Bu raporda...

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

Çeşitli büyüme faktörlerinin varlığında enterik nöral tepe hücre göçü potansiyelinin hassas miktar tayinine izin veren bir ex vivo hücre göçü deneyi mevcut.

Kemirgen Enterik Sinir progenitörlerin için Kantitatif Hücre Göç Tahlili

Aerobik koşullarda bakteri yapışma ve işgali araştırmak için hücre kültürü deneyleri Sahne genellikle temsil edici...

Bağırsak Epitel Hücreleri Of Enterik Bakteriyel Invasion<em&gt; In Vitro</em&gt; Dramatik bir Dikey Difüzyon Odası Modeli Geliştirilmiş mı

Biz üropatojenik Escherichia coli ile mesane enfeksiyonu sırasında akut inflamatuar yanıtın önemli bir bileşeni taklit eden bir in vitro modeli geliştirmiştir. Transuroepithelial nötrofil göçü deneyi, bakteriyel bir enfeksiyon ya da kemo-çekici maddelere cevap olarak, geçirgen destekler üzerinde kültürlenmiştir, mesane epiteli üzerinde insan nötrofil göçü kantitatif bir değerlendirmesini sağlar.

Bir kültür Mesane EPİTELİ karşısında İnsan Nötrofil Göç Kantitatif Değerlendirilmesi

Lökositler paraselüler veya transselüler yolu kullanarak endotel tek tabaka çapraz. Biz endojen junctional dağıtım VE-kaderin ve PECAM-1 lökosit transendotelyal göç sırasında fizyolojik akış altında iki âlemden yolları arasında ayrım için takip basit bir deney geliştirildi.

Nötrofil Hicret altında Fizyolojik Akış sırasında endotel hücre-hücre Eklemlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

Burada, peptidler etkisi bronş epitel hücrelerinin geçiş değerlendirmek için bir protokol mevcut. Bu yöntemi Nicel veri hücre göç ve yara kapatma hızı üzerinde hızlı ve son derece tekrarlanabilir elde olanak sağlar.

Roman Vitro hücre göç değerlendirmek için şifa tahlil yara

Düzensiz bağırsak epitel bariyer fonksiyonu ve immün yanıtlar, fizyolojik modellerin eksikliği nedeniyle kötü araştırılmaya devam eden enflamatuar bağırsak hastalığının ayırt edici özellikleridir. Burada, mukozal geçirgenliği ve lökosit işe alımını vivo olarak incelemek için iyi vaskülerleştirilmiş ve dışlanmış bir bağırsak segmenti kullanan bir fare bağırsak döngüsü modelini tarif ediyoruz.

Standartlaştırılmış Bağırsak Döngüsü Modeli Kullanılarak Farelerde Bağırsak Geçirgenliği ve Nötrofil Transepithelial Göçün Fonksiyonel Değerlendirmesi

Escherichia coli, doğum sırasında bakterileri yutan yenidoğanlarda sepsise neden olur. E. coli'nin enterik yoldan kan dolaşımına seyahat etme kabiliyetinde yer alan süreç tam olarak anlaşılamamıştır. Bu in vitro model, E. coli suşlarının bağırsak epitel hücrelerinden geçme yeteneğini değerlendirir.

Yenidoğan Escherichia coli Bakteriyemi İzolasyonlarının İntestinal Transsitozunun Değerlendirilmesi

Bu protokol, kantitatif analiz ile belirli çevresel koşullar altında primer murin T hücresi izolasyonu ve T hücresi göçünün hızlandırılmış mikroskobu için bir yöntem sağlar.

Primer Murin CD8 + T Hücreleri için Gerçek Zamanlı İn Vitro Migrasyon Testi

Çalışma, doku kök hücresinden türetilen bağırsak organoidleri kullanılarak bakteriyel enfeksiyonun in vitro incelenmesi için bir yöntem sunmaktadır. Protokol, organoidlerin iki boyutta nasıl kültürleneceğini ve farklılaştırılacağını, onları yapışkan-invaziv Escherichia coli ile enfekte edeceğini ve epitel bariyer sızıntısı, enfeksiyon görüntüleme ve epitel RNA yanıtı gibi önemli okumaları nasıl değerlendireceğini açıklar.

Konak-bakteri etkileşimlerini incelemek için invazin veya bazal zar ekstraktı üzerine iki boyutlu organoid kültürü

Keşfedin, insan nötrofillerinin epitel hücre katmanları arasında göçünü in vitro modelde nasıl kantitatif olarak değerlendirebilirsiniz. Bu yöntem mukozal enfeksiyonlara karşı immün yanıtları anlamak için kritik öneme sahiptir.

Tüp bebek Patojen Kaynaklı Nötrofil Trans-epitel Göçünü Değerlendirmek için Coculture Tahlili

Daha fazla video keşfet