Tüp bebek Patojen Kaynaklı Nötrofil Trans-epitel Göçünü Değerlendirmek için Coculture Tahlili

Aşağıdaki deneyin genel amacı, enfeksiyona yanıt olarak bir epitel hücre tek tabakasını geçen nötrofillerin sayısını belirlemektir. Bu, ters çevrilmiş transwell filtre manevrası kullanılarak epitel hücresi tek katmanlarını dikkatli bir şekilde yetiştirmeden önce transwellleri kodlayan kollajen ile elde edilir. İkinci adım olarak, transwell filtreleri üzerinde büyüyen epitelyal tek tabakanın apikal yüzeyini enfekte etmek için bakteriyel patojen kültürlenir, bu da epitel hücrelerinin endojen nötrofil kemo cezbedici maddeler üretmesine neden olur.

Daha sonra, tam kandan izole edilen nötrofiller, nötrofillerin bazolateralden apikal tarafa göçünü test etmek için transwell filtreleri üzerinde büyütülen enfekte epitelyal tek tabakaların bazolateral tarafına eklenir. Migrasyon nötrofillerden miyelo peroksidazın miktar tayinine dayalı olarak enfekte epitelyal tek tabakalara yanıt olarak gözlenen trans epitelyal göç eden nötrofillerin sayısında önemli bir artış gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir, çünkü epitel bariyerlerini büyütmek ve enfekte etmek için ters çevrilmiş transwell filtre manevrası geleneksel değildir ve bu nedenle yabancı araştırma gruplarının laboratuvarlarında kurmaları için daha az ulaşılabilir olabilir.

Bu tekniğin etkileri, pnömoni veya kistik fibroz gibi enfeksiyonu içeren hava yolu enflamatuar hastalıklarının tedavisine kadar uzanır, çünkü nötrofil trans epitel göçünün miktarını azaltmak için yeni tedaviler geliştirilebilir ve test edilebilir, bu da aşırı hevesli nötrofilik, mukozal bariyerlerin ihlalinin zararlı etkilerini hafifletebilir. Laboratuvarımda klinik bir araştırmacı olan Mark ile birlikte, prosedürü gösteren kıdemli teknisyen Wahi Preza ve doktora sonrası araştırmacı Michael Pesos olacak. Başlamak için, 0.33 santimetre kare büyüme alanını, ambalajdan üç mikrometre gözenek boyutuna sahip Transwells'i çıkarın ve 12 transwell içeren 24 oyuklu plakayı davlumbazın içine baş aşağı yerleştirin.

Alt plakayı kaldırın ve bir kenara koyun. Transwell'ler artık baş aşağı olacak. 24 oyuklu plakanın kapağının üzerine dinlendirilen alev, sterilite için bir kanama durdurucu ve soğumaya bırakın.

Steril hemostat transfer transwell'lerini 150 x 25 milimetrelik bir Petri kabına kullanarak, ters pozisyonda tutarak, etanolde mililitre başına 30 mikrogram kollajen çözeltisinin 70 mikrolitresini her ters çevrilmiş transwell yüzeyinin filtre membranına pipetleyin Alt tarafın yüzeyine erişirken filtre membranının etrafında duvar olmadığı için gerilim bu hacimdeki çözeltiyi yerinde tutmalıdır. Kollajen solüsyonunun transwell'in yanından aşağı damlamamasına dikkat edin ve kaplama prosedürü sırasında transwell'leri hareket ettirmekten kaçının. Bu işlem sırasında steriliteyi korumak için etanolün buharlaşmasını sağlamak için Petri kabının kapağını en az dört saat kapalı bırakın.

Epitel hücrelerini metin protokolünde açıklandığı gibi paketledikten sonra davlumbaz fanını ve ultraviyole ışığını açık tutun. 15 mililitrelik bir tüpten 70 mikrolitre Resus askıda hücre solüsyonunu her bir ters çevrilmiş kollajen kaplı transwell içine ekleyin. Transwell'leri tohumlarken hücrelerin 15 mililitrelik tüpün dibine çökmesini önlemek için tüpü periyodik olarak hafifçe ters çevirerek hücre süspansiyonunu karıştırın.

Tüm ters çevrilmiş transwell'ler epitel hücreleri ile tohumlandıktan sonra, Petri kabı kapağını değiştirin ve hücreleri ertesi gün doku kültürü inkübatörüne dikkatlice yerleştirin. Orijinal steril 24 Kuyucuklu plakanın her bir oyuğuna bir mililitre ortam ekleyin ve her bir ters çevrilmiş trans kuyusunu bir mililitre ortam içeren her bir oyuğa çevirmek için sterilize edilmiş bir hemostat kullanın. Her trans kuyucuğunun üst haznesine 0.2 mililitre besiyeri ekleyin ve doku kültürü inkübatörüne geri dönün.

Transwell filtre membranlarının alt tarafında en az sekiz gün boyunca kültürlenmiş epitel tabakalarını destekleyen 24 oyuklu plakayı inkübatörden çıkarın. Her transın kenarını bir hemostat ile iyice kavrayın ve 24 oyuklu plakadan kaldırın. Kültür ortamını Transwell'in iç haznesinden atmak için transwell'i bir atık kovası üzerinde ters çevirin.

Transwell'in iç haznesini doldurmak için her bir transwell'i Hank'in kalsiyum ve magnezyum ile dengeli tuz solüsyonu veya Hank's Plus içeren bir yıkama kabına batırın. Ardından sıvıyı iç hazneden bir atık kovasına atın. Bu adımı bir saniye boyunca tekrarlayın.

İki yıkamadan sonra Hank's plus'ta yıkayın. Transwell'leri bir mililitre Hank's Plus içeren 24 oyuklu yeni bir plakaya yerleştirin. Her kuyucukta, epitel hücre tabakası bütünlüğünü değerlendirmek için her bir transwell'in üst odasını gözlemleyin.

Hank's Plus, bir mililitre Hank's Plus içeren 24 oyuklu bir plakanın kuyusuna yerleştirildiğinde Transwell'in üst haznesine sızmamalı ve doldurmamalıdır. Her bir transwell'i dikkatlice gözlemledikten sonra, üst hazneye 0,2 mililitre Hanks Plus ekleyin. Nötrofil trans epitel migrasyon testini gerçekleştirmek için epitel hücre katmanlarını dengelemek için plakayı 30 ila 60 dakika inkübatöre yerleştirin.

Her bir transwell'i, Hank's Plus'ta dengelenmiş 24 oyuklu Wash Transwell plakasından bir hemostat ile kavrayın ve üst kuyudaki sıvıyı bir atık kovasına atın. Her bir transwell'i 150 x 25 milimetrelik bir Petri kabına ters çevrilmiş transwell'lerin altısına baş aşağı yerleştirin. Ters çevrilmiş transwelllerin üçüne 25 mikrolitre Hanks plus ekleyin.

Hücreleri 25 mikrolitre Pseudomonas, arosa veya Pao ile enfekte edin, biri Hanks'te seyreltilmiş ve metin protokolünde açıklandığı gibi son üçe kadar hazırlanmış, Ters çevrilmiş transwell, hücreleri 25 mikrolitre e Coli, K 12 veya Hanks Plus'ta seyreltilmiş mc 1000 ile enfekte eder, ayrıca nemlendirilmiş bir odada 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 60 dakika inkübe edildikten sonra metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlanır. Transwell'leri bir hemostat ile kavrayarak ve bir mililitre Hank's plus içeren 24 kuyulu bir yıkama plakasına geri çevirerek yıkayın. Alt odalarda.

Üst bölmelere 0,2 mililitre Hank's plus ekleyin. Transwell'i bir kanama durdurucu ile kavrayın ve ilk yıkama plakasından çıkarın. Üst haznedeki sıvıyı bir atık kovasına atın.

Transwells'i bir mililitre Hanks plus içeren ikinci bir 24 kuyulu yıkama plakasına yerleştirmeden önce, üst hazneye 0.2 mililitre Hanks plus ekleyin. Toplam üç yıkama için bu adımı bir kez daha tekrarlayın. Üçüncü yıkamadan sonra, trans kuyularının üst odalarındaki sıvıyı bir hemostat kullanarak bir atık kovasına atın, enfekte olmamış trans kuyucuklarından üçünü, bir mililitre Hanks Plus içeren 24 Kuyu migrasyon plakasının üç kuyusuna yerleştirin, bu da negatif kontrol pipetini temsil eden 10 mikrolitre 10 mikromolar FMLP çözeltisini, bir mililitre Hanks içeren 24 Kuyu migrasyon plakasının üç kuyusunun her birine 10 mikrolitre FMLC içerir ayrıca enfekte olmamış trans kuyularından üçünü, izole nötrofillerin göç etme kabiliyeti için pozitif bir kontrolü temsil eden 100 Nanomolar FMLP içeren 24 Kuyu göç plakasının üç kuyusuna yerleştirin.

Daha sonra, PAO ile enfekte olmuş üç trans kuyusunu, bir ve mc 1000 ile enfekte olmuş üç trans kuyusunu, bir mililitre Hanks içeren 24 Kuyu migrasyon plakasının karşılık gelen üç kuyusuna yerleştirin ve her trans kuyusunun üst odasına 0,1 mililitre Hanks plus ekleyin, her transta 0,1 mililitre Hanks plus'ın üstüne. Metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlanan 20 mikrolitre nötrofil süspansiyonunu dikkatlice ekleyin. Nötrofillerin trans epitelyal göçüne izin vermek için iki saat inkübe edin.

İki saatlik migrasyondan sonra, bir hemostat ile kavrayarak transwell'leri kaldırın ve 24 kuyulu migrasyon plakasının iç duvarlarına hafifçe vurun. Trans kuyularını atmadan önce, 24 kuyulu migrasyon plakasının kuyularını 10 x objektif kullanarak ters çevrilmiş bir mikroskop altında inceleyerek kuyulardaki nötrofillerin göçünü brüt olarak değerlendirin. Daha sonra 24 kuyulu migrasyon plakasında kullanılan her bir kuyucuğa, her standart ve boşluğa 50 mikrolitre %10 Triton X 100 ekleyin.

24 kuyu migrasyon plakası standardını döndürün ve 20 dakika boyunca düşük hızda boşaltın. Dört santigrat derecede. 50 mikrolitre sitrat tamponu ekleyin.

İkişer kuyu içinde kullanılan 24 kuyulu migrasyon plakası her bir standarda ve boşluğa iyice yapılır. Çözeltiyi en az beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek her bir numunedeki içeriği iyice karıştırın. Daha sonra her bir numune kuyucuğunun 100 mikrolitresini iki parça halinde 96 oyuklu plaka transferine, her standarttan 100 mikrolitre ve boşluğu 96 oyuklu plakaya aktarın.

Karıştırdıktan sonra, A BTS çözeltisine 50 mikrolitre% 30 hidrojen peroksit ekleyin ve girdap yapın. Ardından her numuneye 100 mikrolitre A BTS substrat çözeltisi ekleyin. 96 oyuklu plakada, plakanın karanlıkta beş ila 10 dakika gelişmesine izin verin.

405 nanometre dalga boyunda okumadan önce lizen nötrofilleri içeren plakanın kuyucuklarında yeşil rengin gelişimini gözlemleyin. Nötrofil trans epitelyal migrasyonu değerlendirmek için bir mikroplaka okuyucu kullanarak, epitel tabakası boyunca apikal odaya tamamen göç eden nötrofiller, ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu kullanılarak burada görselleştirildiği gibi 24 kuyulu migrasyon plakasının alt kuyusunda görüntülenebilir. Çok az sayıda nötrofilin, kemotaktik gradyan uygulanmadan enfekte olmamış bir epitel tabakası boyunca göç ettiği ve testte arka plan seviyelerini temsil ettiği gözlendi.

Buna karşılık, bir FMLP gradyanı sağlandığında bol miktarda transmi nötrofil belirgindi. Epitelin patojenik olmayan e coli mc 1000 ile enfeksiyonu, az sayıda görünür trans migrasyonlu nötrofil ile sonuçlanırken, epitel tabakaları akciğer patojenik pseudomonas aerojeni ile enfekte olduğunda birçok trans migrasyonlu nötrofil gözlenmiştir. Deneyde göç eden nötrofiller, miyelo peroksidaz aktiviteleri ölçülerek ölçülür.

Nötrofillerin sayısı, nötrofillerin lizizini takiben ölçülen peroksidaz aktivitesi miktarı ile pozitif korelasyon gösterir ve değerler, standart eğri için seçilen nötrofil sayıları aralığında doğrusal bir ilişki sergiler. Önemli sayıda nötrofil, sağlanan FMLP gradyanına yanıt olarak veya PAO ile enfekte olmuş bir epitel tabakasına yanıt olarak epitel tabakaları boyunca göç eder. Uyaranların yokluğunda veya patojenik olmayan e coli mc 1000 ile apikal epitel enfeksiyonunu takiben göç eden nötrofillerin sayısı, test için tespit sınırının altındadır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, epitel hücrelerinin transwell filtreleri üzerine kollajen kaplanması ve tohumlanması için beş saat içinde yapılabilir, ardından epitel hücrelerinin büyümesine izin vermek için en az bir hafta sürebilir. Epitelyal tek tabakalar hazır olduğunda. Migrasyon testi, nötrofillerin izolasyonu ve uygun şekilde yapılırsa bakterilerin hazırlanması dahil olmak üzere beş saat içinde gerçekleştirilebilir.

Bu prosedürü denerken, kontaminasyonu önlemek için transwell filtrelerini steril koşullar altında hazırlamayı unutmamak önemlidir. Bu prosedür, bu enflamatuar süreçle ilgili ek soruları yanıtlamak için uyarlanabilir. Göç eden hücrelerin, epitelin, sırtın ve hatta patojenin analizi yapılabilir.