Kas Uydu Hücreleri İzolasyon, Kültür ve Transplantasyon

Hareketsiz uydu hücrelerin saf nüfusun izolasyonu ve kültürü, kas kök hücre topluluğu, kas kök hücre biyolojisi ve rejenerasyon, hem de kas distrofisi ve diğer dejeneratif hastalıklarda tedavileri için kök hücre nakli anlaşılması için gereklidir.

Bu prosedürün genel amacı, iskelet kası yaralanmasının tedavisi için saflaştırılmış, hareketsiz yetişkin nöron iskelet kası uydu hücrelerini nakletmektir. Bu, önce yetişkin farelerden iskelet kasının diseksiyonu ve iskelet kasının enzimatik olarak sindirilmesi ve ardından hareketsiz uydu hücrelerinin manyetik boncuk ayrımı ile sıralanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, izole edilen hücreler kollajen kaplı kültür kapları üzerinde genişletilir ve son adımda, in vitro genişletilmiş hücreler, yetişkin farelerin kardiyo toin ile tedavi edilmiş iskelet kaslarına enjekte edilir.

Sonuç olarak, in vitro genişletilmiş uydu hücrelerinin aşılanması ve kas liflerinin yenilenmesine katkısı, xal boyama ile değerlendirilebilir. Merhaba, benim adım bir sushi ura. Minnesota Üniversitesi Kök Hücre Enstitüsü'nde doçentim.

Kitlesel bir kök hücre popülasyonu olan cent uydu hücresinin izolasyonu, kas kök hücre biyolojisinin anlaşılması ve rejenerasyonun yanı sıra kitle Duchenne musküler distrofileri gibi musküler distrofilerde tedaviler için kök hücre nakli için gereklidir. Bu tekniğin gerçekler gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, yöntemimizin yetişkin fare saçılma kasından hareketsiz uydu hücrelerinin hızlı, ekonomik ve güvenilir bir saflaştırma yöntemi olmasıdır. Gösterme prosedürleri laboratuvarlarımda Dr.Rio Moto, Hashi postdoc ve Yoko Asura genç bilim adamı tarafından gerçekleştirilecektir.

Mononükleer hücreleri fare iskelet kasından izole etmek için, ötenazi uygulanmış her üç ila sekiz haftalık yetişkin farenin karın derisini sıkıştırarak ve ardından keserek başlayın. Triseps ve arka bacak kasını tamamen ortaya çıkarmak için cildi zıt yönlerde soyun ve ardından tibialis anterior gastro kuadriseps ve triceps iskelet kaslarını çıkarmak için bacak kemikleri boyunca kesin. Kasları 10 santimetrelik bir plakada buz gibi, steril PBS'ye aktarın ve kanı yıkayın.

Sonra kasları altı santimetrelik yeni bir steril plakaya aktarın. Daha sonra, bir stereo mikroskop altında, bağ dokusunu, kan damarlarını, sinir demetlerini çıkarın ve kaslardan epijenik doku ekleyin. Daha sonra oftalmolojik makas kullanarak dokuyu kesin ve pürüzsüz bir hamur haline getirin.

Büyük parçalar bırakmamaya çalışıyorum. Kıyılmış kasları 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve dokuyu 37 santigrat derecede beş mililitre kollajenaz çözeltisinde sindirin. Bir saat sonra, doku bulamacını birkaç kez denemek için 18 gauge iğne ile donatılmış bir şırınga kullanın.

Karışımı homojenize etmek için, homojenatı 15 dakika daha inkübe edin ve ardından karışımı tekrar deneyin Bulamacı tek bir hücre süspansiyonuna ayırmak için 50 mililitreye kadar ortam ekleyin ve hücre çözeltisini karıştırın. Daha sonra hücre süspansiyonunu 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirerek yeni bir 50 mililitrelik falcon tüpüne süzün. Toplanan hücreleri sayın ve daha sonra hücreleri yıkadıktan sonra hücre süspansiyonunu döndürün, peleti 200 mikrolitre ortamda yeniden süspanse edin ve ardından hücreleri lekelemek ve ayırmak için hücreleri 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Mikro santrifüj tüpünü buzun üzerine yerleştirin ve daha sonra hücreleri listelenen antikor cisimlerinin her biri bir mikrolitre ile inkübe edin. 30 dakika sonra, hücreleri bir mililitre ortamda iki kez yıkayın. Daha sonra peleti 200 mikrolitre ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri 10 mikrolitre anti PE manyetik boncuk buz üzerinde inkübe edin.

30 dakika sonra, hücreleri bir mililitre maksimum tamponda iki kez yıkayın ve peleti bir mililitre tamponda yeniden süspanse edin. Ardından mıknatısa bir LD sütunu yerleştirin ve sütunu maksimum 1,5 mililitre tamponla durulayın. Hücre süspansiyonunu kolona dağıtın, PE negatif akışını fraksiyondan 1.5 mililitrelik bir tüpte toplayın.

Daha sonra PE negatif fraksiyonunu aşağı döndürün ve peleti 100 mikrolitre ortamda yeniden süspanse edin. Şimdi hücreleri buz üzerinde beş mikrolitre anti-US IgG manyetik boncuk içinde inkübe edin ve daha sonra 30 dakika sonra, hücreleri bir mililitre maksimum tamponda iki kez yıkayın ve peleti 500 mikrolitre tamponda askıya alın. Ardından, mıknatısın üzerine bir MS sütunu yerleştirin ve bir mililitre maksimum tamponla durulayın.

Daha sonra hücreleri sütuna dağıtın, alfa yedi negatif akışı fraksiyondan atın. Sütunu bir mililitre maksimum tamponla iki kez durulayın ve ardından mıknatıstan çıkarın. Ardından, manyetik olarak etiketlenmiş integrin yedi pozitif hücreyi yeni bir 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne boşaltmak için bir mililitre maksimum tamponu bir pistonla kolondan yıkayın.

Daha sonra hücre süspansiyonunu döndürdükten sonra, saflaştırılmış hücreleri miyoblast ortamında yeniden süspanse edin. Son olarak, hücreleri beş mililitre miyoblast ortamı içeren matrigel kaplı altı santimetrelik bir plaka üzerine yerleştirin. Hücre kültürünü korumak için, hücreleri her gün miyoblast ortamı büyüyen miyoblastlarla besleyin.

Küçük yuvarlak bir şekil sergileyin ve çekirdeklerinde myo D'yi ifade edin. Hücre füzyonuna başlamaya hazır olduğunuzda, hücreleri PBS ile bir kez durulayın ve ardından bunları 37 santigrat derecede% 5 CO2 inkübatörde anize edin. Üç dakika sonra, ayrışmış hücreleri miyoblast ortamında toplayın, hücreleri resüse doğru döndürün, peleti miyoblast ortamında süspanse edin ve hücreleri yeni matrigel kaplı plakalara yeniden dökün.

Hücre kültürünü farklılaştırmak için, hücreleri her gün farklılaşma ortamı ile besleyin. Bir gün sonra, miyoblastlar hücre döngüsünden çıkacak ve miyozin ağır zincirli veya MHC pozitif miyositlere farklılaşacaktır. Üç ila beşinci günde, hücreler birbirleriyle kaynaşır ve çok çekirdekli miyo tüpleri oluşturur.

Miyoblast naklinden 24 saat önce, sedasyonlu iki aylık bir başını sallayan kızak faresinin tibias anterior veya TA kası etrafındaki kılları tıraş edin. Ardından, kas içine 10 mikromolar kardiyo toin enjekte etmek için 31 gauge insülin şırıngası kullanın. Ertesi gün, çoğalan miyoblastları, az önce gösterildiği gibi tripsin ile matrigel kaplı plakalardan ayırın ve ayrışmış hücreleri döndürün, 50 mikrolitre ortamda hücrelerin 10 ila altıda birini yeniden süspanse edin.

Daha sonra hücreleri 31 gauge insülin şırıngasına yükleyin ve TBI'nin ön kas rejenerasyonu için hücreleri kas içi olarak alıcı hayvana nakledin. Enjeksiyondan bir ila dört hafta sonra, histolojik analiz için TA kaslarını hasat edin. Yeni izole edilmiş hareketsiz uydu hücreleri küçük bir yuvarlak şekil gösterir ve bu hücrelerin %90'ından fazlası kesin bir belirteç olarak PAC yediyi eksprese eder.

Ex vivo genişletilmiş miyoblastlar, kas lifi rejenerasyonuna ve uydu hücrelerinin kendini yenilemesine miyoblast katkısının incelenmesi için kas içi hücre enjeksiyon deneyleri için kullanılabilir. Farklılaşma ortamında kültürlendiğinde, miyoblastlar hücre döngüsünden çıkar ve transplantasyondan birkaç gün ila birkaç ay sonra miyozin ağır zincirini eksprese eden çok çekirdekli miyo tüpleri haline gelir. Proliferatif miyoblastlar, kendini yenileyen uydu hücreleri ve yeni oluşan kas liflerini içeren beta galakto tarafı pozitif donör türevli hücreler, her gelişmeden sonra kardiyotoin yaralı kasta tespit edilebilir.

Bu teknik, kas kök hücresi ve kas kökeni alanındaki araştırmacıların kas distrofisi için tetik kök hücre naklini keşfetmelerinin yolunu açtı, ben Fushi. Adım Yoko. Ben Norio.Teşekkürler.

İzlediğiniz için teşekkürler.