3: Drosophila melanogaster Embriyo ve Larva Toplama ve Hazırlama

Drosophila melanogaster embriyolarının ve larvalarının manipüle edilmesi kolaydır ve gelişimleri, memeliler de dahil olmak üzere diğer organizmalarda bulunan mekanizmalar tarafından yönlendirilir. Embriyoları ve larvaları toplamayı ve hazırlamayı öğrenmek, davranışsal biyolojiden gelişimsel biyolojiye kadar birçok deneysel süreçte bir ön adımdır. Bu video, bu çok yönlü model organizmanın kullanımında temel prosedürler olan Drosophila embriyolarını ve larvalarını toplamak ve hasat etmek için standart yöntemleri kapsayacaktır.

Drosophila embriyosu üzerinde yapılan çalışma, oositte bir gradyan olarak ifade edilen mRNA'dan, önden arkaya segmentli vücut planını oluşturan genlere kadar, genlerin gelişimi nasıl düzenlediğine dair büyük bir içgörü sağlamıştır. Bu genlerin bazıları, homeobox genleri gibi, bu böcek ve memeliler arasında yüksek oranda korunmuştur.

Drosophila embriyolarının doyurucu doğası, zorlu ortamlara ve kimyasallara maruz kalmaya dayanmalarına izin verir, bu da onları incelemeyi son derece pratik hale getirir.

Döllenmeden sonra bir dişi sinek günde 100'e kadar embriyo bırakabilir ve bu da 12-15 saat sonra larvalara yumurtadan çıkar.

Drosophila embriyolarını manipüle etmek için önce toplanmaları gerekir.

Embriyolar, genellikle "yumurtlama kapları" olarak adlandırılan yumurtlama odalarında toplanır.

Döşeme kabını monte etmek için önce delikler açın veya bir kabın bir kısmını kesin ve havalandırmaya izin vermek için gözenekli bir malzeme ile örtün. Daha sonra bir elma veya üzüm suyu agar tabağı alın, üzerine maya ezmesi sürün ve ortasındaki plakaları çizin. Maya ezmesinin varlığı yumurtlamaya neden olur.

Yumurtlama haznesine hızlı bir şekilde sinekler ekleyin, hazneyi plaka altta olacak şekilde ters çevirin ve kuluçkaya yatırın. İstenilen kuluçka süresinden sonra yumurta haznesini ters çevirin ve birkaç kez tezgahın üzerine vurun. Sinekler dibe düşer ve kısa bir süre şaşırır. Eski agar plakasını hızlı bir şekilde maya macunu ile kaplanmış taze plaka ile değiştirin. En iyi yaştaki embriyoları elde etmek için plakaları her 1-3 saatte bir değiştirin.

Plakalar, özellikle çiziklerin ve mayaların yakınında yüzlerce embriyoya sahip olacaktır.

Her cinsiyetten 20 sinek saatte 100-200 embriyo üretmelidir. Artık embriyolar toplanabilir.

Embriyo toplama için gerekli araçlar, boyut ve karmaşıklık açısından büyük ölçüde değişebilen bir süzgeç veya elek, bir boya fırçası ve damıtılmış sudur.

İlk olarak, plakayı damıtılmış suya batırarak, yüzeyi bir boya fırçasıyla hafifçe fırçalayarak embriyoları gevşetin. Ardından, karışımı elek içine dökerek sıvıyı süzün. Embriyoları suyla durulayın.

Durulamayı genellikle dekoryonasyon takip eder - embriyonun sert dış zarının çıkarılması veya koryon.

Dekoryonasyon, embriyonun koryon kılıfından diseksiyonu yoluyla manuel olarak yapılabilir. Alternatif olarak, embriyolar %50 çamaşır suyuna yerleştirilebilir. Dorsal eklerin kaybolmasıyla belirtildiği gibi, koryonun çözülmesi 2-10 dakika sürer. Çıplak embriyonun ağartıcıdan zarar görmediğinden emin olmak için damıtılmış suyla iyice durulayın. Dekoryonasyon, mikroenjeksiyon ve canlı hücre görüntüleme gibi teknikler için bir ön koşuldur.

Artık embriyo biyolojisi, toplama ve toplama hakkında bir fikir edindiğinize göre, Drosophila yaşam döngüsündeki bir sonraki aşamaya geçelim: larvalar.

Drosophila larvalarının üç "instar" veya tüy dökme aşaması vardır. İlk instar bir gün, ikincisi başka bir gün ve üçüncüsü iki gün daha sürer. Birinci ve ikinci instar larvaları, bir haç kurulduktan 1-3 gün sonra flakonun yeminde bulunur. 4. günde, üçüncü instar larvaları yukarı göç eder veya kabın kenarlarında "dolaşır", burada sonunda pupa adı verilen kozalar oluştururlar.

Larvalar, hayali diskleri nedeniyle genellikle deney için kullanılır. Hayali diskler, yetişkin sineğin bütün parçaları haline geldiği bilinen kısmen gelişmiş organlardır. Örneğin, hayali bir göz diski yetişkin gözü olacak, anten diskleri anten olacak ve hayali kanat diskleri kanat haline gelecektir. Hayali disklerin incelenmesi, Drosophila'da homeobox genlerinin desen oluşumundaki rolü gibi önemli keşiflere yol açmıştır.

Larva toplama, embriyo toplamadan daha basittir, çünkü sineklerin özel yuvalara aktarılmasını gerektirmez.

Bireysel larva cımbız veya bir spatula ile çıkarılabilir. Çok sayıda erken evre larva toplarken, larvalardan daha yoğun olan ve yüzmelerine neden olan bir sakaroz çözeltisi kullanarak alternatif bir toplama yöntemi kullanabilirsiniz.

Larvaları tepeye şamandıra yapan şişeye sükroz çözeltisi ekleyin. Şişeyi bir döndürücü üzerine yerleştirerek yiyeceği yerinden çıkarın. Daha sonra larvaları bir fırça veya pipetle çıkarın ve deneyler için hasat edin.

Artık embriyolar ve larvalar için toplama ve hasat tekniklerini ele aldığımıza göre, şimdi bunları deneylere nasıl uygulayacağımızı görelim.

Hareketli oldukları için Drosophila larvaları davranışsal deneyler için kullanılabilir.

Burada, belirli koşullar altında Drosophila lokomotor davranışını değerlendirmek için kullanılan bir "tarama testi" görüyorsunuz. Tarama testi, bir ilacın motor fonksiyon üzerindeki etkilerini gözlemlemek için larvaların kat ettiği mesafeyi ölçer. Toplanan larvalar, motiliteye müdahale ettiği tahmin edilen ilaçlı bir sükroz çözeltisine daldırılır.

Mikroenjeksiyon, özelleştirilmiş genetik materyali dairesel bir DNA plazmidi şeklinde yerleştirerek transgenik mutantlar olarak bilinen genetik olarak değiştirilmiş meyve sinekleri oluşturmak için bir prosedürdür.

Bu embriyolar, kimyasalların onlara zarar vermemesi için fiziksel olarak çift taraflı bant üzerinde yuvarlanarak dekoryona alınır. Embriyolara daha sonra, GFP gibi floresan raportör proteinlerle kaynaşmış tübülin gibi proteinleri kodlayan plazmitler enjekte edilebilir. Daha sonra, yerleşik transgenik sinek hatlarından mitoz gibi hücresel süreçleri görselleştirmek için deneyler yapılabilir.

Embriyolar, floresan in situ hibridizasyon yoluyla transkriptlerin varlığını görselleştirmek için kullanılabilir.

Bu deneyde, floresan mikroskobu ile istenen bir mRNA transkriptinin varlığı için tüm embriyolar gözlenir. Embriyolar, dekoriyonat yapan ve bu nedenle embriyoyu boyamaya hazırlayan bifazik bir çözelti kullanılarak sabitlenir. Çıplak embriyolar en alt tabakadadır. İmmünofloresan boyamadan sonra, floresan mikroskobu kullanılarak istenen proteinin varlığı görülebilir.

Az önce JoVE'nin embriyo ve larva toplama ve hazırlama videosunu izlediniz. Embriyo ve larvaların toplanması, toplanması ve hazırlanması ile erken evre organizmalara uygulanan bazı önemli uygulamaları gözden geçirdik. İzlediğiniz için teşekkürler!