İzolasyon ve Kültür Yetişkin Fare Hücre Sinyal için kardiyomiyositlerin ve In vitro Kalp hipertrofisi

[Anlatıcı] Bu prosedürün genel amacı, fonksiyonel yetişkin fare kardiyomiyositlerinin kültürü için tutarlı bir hazırlık sağlamaktır. Önce fare kalbini anestezi ve kanülasyon altında çıkarın. Kalbi perfüze edin ve kollajenaz ile sindirin. Sonra hücreleri ayırın ve kalsiyumu yeniden ekleyin. Daha sonra hücreleri tohumlayın ve birincil kardiyomiyositleri kültürleyin. Western blots ve tritiated lösin dahil etme testlerinden elde edilen sonuçlar, PI3 kinaza bağlı AKT fosforilasyonunun aktivasyonu ve Ouabain tarafından indüklenen protein sentez hızının artması gibi işlevleri gösterebilir.

- Kalbin izolasyonundan sonra, aortu diğer birçok damardan hızlı bir şekilde havalandırın, ardından aortu çok dikkatli bir şekilde tutun ve ilk denemede hızlı bir şekilde bağlayın. Pratik yaparak, renk ve yumuşaklık değişimini doğru bir şekilde izleyerek kalbin kollajenaz sindirimini ne zaman durduracağınızı belirleyebileceksiniz.

- Prosedürü göstermek, laboratuvarımda doktora sonrası bir araştırmacı olan Dr Daxiang Li olacak.

- [Anlatıcı] Perfüzyondan hemen önce, tip II kollajenaz içeren taze sindirim tamponu hazırlayın ve izolasyona hazır olduğunda tamponu 37 santigrat dereceye ısıtın. Makas ve forsepsleri %70 etanole batırın ve kurumaya bırakın. Şimdi fareyi bir gramın en yakın 10'da birine kadar tartın. Vücut ağırlığını, suşunu, cinsiyetini ve doğum tarihini kaydedin. Koroner arterlerde kanın pıhtılaşmasını önlemek için intraperitoneal olarak 200 mikrolitre Heparin enjekte edin. 10 dakika sonra fareyi uyuşturun. Beş ila 10 dakika sonra, farenin kuyruk veya ayak parmağı sıkışmasına yanıt vermediğini kontrol edin, ardından ön ve arka pençeleri bir çalışma yüzeyine nazikçe sabitleyerek fareyi sırtüstü pozisyonda sabitleyin. Göğsü ve karnı %70 etanol ile silin, ardından orta karın bölgesinden diyaframa kadar orta hat cilt kesisi yapın. Sternumu tutun ve iki taraflı kesin. Ardından, diyaframı kesin ve kalbi ortaya çıkarmak için göğüs kafesini geriye doğru çekin. Şimdi kalbi hafifçe kaldırın ve kalbi göğüs boşluğundan dorsal torasik duvara mümkün olduğunca yakın bir şekilde inceleyin. Kalbi 100 milimetrelik bir tabakta soğuk füzyon tamponuna aktarın. Akciğerler, timus, bronşlar ve yemek borusu gibi bağ dokularını dikkatlice kesin. Şimdi aortu ve timus ve yağ yastığı tarafından gizlenen kraniyal dallarını tanımlayın. Aortu ilk dalının altından kesin, aort duvarını kavrayın ve kalbi kaldırın. Füzyon sıvısının damladığını kontrol edin, ardından kanülün ucunu aort kapağının hemen üzerinde tutarak kalbi perfüzyon sıvısı dolu aort kanülünün üzerine hafifçe kaydırın. Aortu kanüle klempleyin ve aortu 6-0 cerrahi ipek ile kanüle bağlayın. Kalbi, atık sular berraklaşana kadar yaklaşık dört ila beş dakika boyunca dakikada dört mililitre akış hızında kalsiyum içermeyen füzyon tamponu ile perfüze edin, ardından 50 mikromolar kalsiyum klorür içeren sindirim tamponuna geçin. Mümkünse, sindirirken yükleme sonrası basıncı 70 ila 80 milimetre cıvaya yükseltin. Kalp hafifçe solgun ve sarkık hale geldiğinde, hafifçe sıkıştırıldığında süngerimsi olup olmadığını kontrol edin, ardından sindirimi durdurun. % 70 etanole batırılmış forseps ile aortu kanülden çekin ve kalbi 2,5 mililitre sindirim tamponu içeren 60 milimetrelik steril bir tabağa koyun. Şimdi hücre kültürü başlığına geçin ve steril malzemeler ve steril teknikler kullanın. Aort, kulakçık ve büyük damarları ince cerrahi makasla çıkarın. Ardından ventrikülü nazikçe 10 ila 12 küçük parçaya bölün. 10 mililitrelik bir transfer pipeti ile kalp parçalarını ve hücrelerini nazikçe pipetleyin ve numuneyi 15 mililitrelik polipropilen konik bir tüpe aktarın. Çanağı 7,5 mililitre kalsiyum çözeltisi I ile durulayın ve yıkamayı konik tüpe aktarın, böylece 10 mililitrelik bir nihai hacim elde edin. Ardından, ince uçlu bir transfer pipeti ile hafifçe pipetleyerek büyük kalp dokusu parçalarını dağıtın. Daha sonra, endotel hücreleri ve fibroblastlar gibi küçük miyosit olmayan hücreleri ayırmak için 20 G'de üç dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin. Miyosit peletini ATP ile takviye edilmiş 10 mililitre kalsiyum çözeltisi içinde yeniden süspanse edin ve üç ila beş dakika dengeleyin. Daha sonra çift 10 mikrolitrelik alikotları bir hemositometreye aktarın. Çubuk şeklindeki ve yuvarlak miyositleri sayın, ardından toplam miyosit sayısını hesaplayın ve çubuk şeklindeki miyositlerin yüzdesini belirleyin. Miyositleri santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatanları çıkarın ve peleti art arda 10 mililitre artan kalsiyum konsantrasyonlarında yıkayın. Fare miyosit birincil kültürü için, kalsiyuma toleranslı kardiyomiyositler elde etmek için son miyosit peletini beş mililitre kaplama ortamında yeniden süspanse edin. Toplam miyosit sayısını sayın ve çubuk şeklindeki siyositlerin yüzdesini hesaplayın. Çubuk şeklindeki miyositlerin konsantrasyonunu mililitre başına 25.000 çubuk şeklindeki miyosite ayarlayın. Her tabak veya tabak için eşit hücre yoğunluğunu sağlamak için miyositleri nazikçe pipetleyin. Laminen kaplama solüsyonunu kültür plakalarından aspire ettikten sonra, kardiyomiyositleri tohumlayın ve bulaşıkları kültür başlığının yüzeyinde çapraz benzeri bir desende hafifçe ileri ve geri ve yan yana kaydırarak hücreleri eşit şekilde dağıtın. Kültürleri, yaklaşık% 80 oranında miyosit bağlanmasına izin vermek için 37 santigrat derecede% 2'lik bir karbondioksit inkübatöre yerleştirin. Şimdi bağlanmamış miyositler ve hücre kalıntıları içeren ortamı nazikçe aspire edin. Bulaşıkların kenarlarına her seferinde bir tabak hedefleyerek kültür ortamını yenileyin. Hücreleri hemen kültür inkübatörüne geri koyun. Başarılı bir hazırlıkta, izole edilmiş miyositler normalde dikdörtgen uçları ve net çapraz çizgileri olan belirgin bir rode şekline sahiptir. Fonksiyonel bir test olarak, yetişkin C57 siyah altı fare kardiyomiyositleri kültürlendi ve Ouabain ve ET1 ile tedavi edildi. Bu veriler, Ouabain ve ET1'in AKT fosforilasyonunu doza bağlı bir şekilde artırabildiğini ve ayrıca protein sentezi sırasında tritiye lösin katılımını indükleyebildiğini göstermektedir. Bu teknik, kalp hastalığı alanındaki araştırmacıların genetiği değiştirilmiş farelerde kardiyak düzenleme mekanizmasını keşfetmelerinin yolunu açtı.