Serebellar Aksonlar Lazer Nanosurgery In Vivo

Bu prosedürün genel amacı, tek bir disseke nöronun dinamiklerini in vivo izleyerek tekil olarak yaralanmış nöronal hücrelerin dejenere olduğu ve yenilendiği mekanizmayı incelemektir. Bu, ilk olarak alt alt nöronun bir alt kümesini ve bunların aksonal uzamasını anter derece izleme yoluyla etiketleyerek gerçekleştirilir. İkinci adım, bir kraniyal pencere altında rastgele zaman noktalarında tırmanan lifleri tekrar tekrar izlemek için serebellar korteks üzerinde bir kraniyal pencere gerçekleştirmektir.

Sonraki görüntü ve tek aksonal dalları in vivo lazer ax otomi ile inceleyin. Son adım, lazer ex sodomiyi takip eden günlerde aksonun dejenerasyonunu ve nihai olarak yeniden şekillenmesini iki foton in vivo görüntüleme ile izlemektir. Foton taksotomisi için lazer kullanmanın ana avantajlarından biri çok, çok spesifik olmasıdır.

Büyük bir hasarla tek bir omurgayı bile kıvırabilirsiniz. Bu noktada, kesin bölgeyi ablate edemezsiniz. Ayrıca, bu durumda, in vivo görüntüleme ile, statik bir görünümle mümkün olmayan dinamikleri inceleyebilirsiniz.

Son olarak, rejenerasyon sürecinin ve plastisitenin nasıl gerçekleştiğini göstermek için ablasyonlu lifleri liflerin geri kalanıyla bağlamak çok önemlidir. Dolayısıyla bu yöntem, serebellar coex'teki CLA F'lerin plastisitesinin yapısı hakkında fikir verebilir. Herhangi bir floresan yapıyı incelemek için uygulanabilir.

Canlı beyinde las baskısı gerçekten de daha önce tek hücreli cisimlerin bozulmasını hedef almıştı. Eylem: TH'nin korteksindeki dendritik dallar ve hatta piramidal nöronların tek dikenleri, bir GFPM faresi Bu işleme kılcal damarı bir ila iki mikrolitre dekstran konjuge boya yükleyerek başlayın. Daha sonra, kilogram başına 90 miligram ketamin ve kilogram başına dokuz miligram Ksilazin intraperitoneal enjeksiyonu ile bir fareyi uyuşturun, hayvanın bir kuyruk veya ayak parmağı tutamağı kullanarak tamamen sakinleştirildiğinden emin olun.

Daha sonra anestezi altındayken kuruluğu önlemek için her iki gözünüze merhem kullanın, boynun üstündeki saçları bir jiletle tıraş edin. Cerrahi bölgeyi% 70 etanol ile dönüşümlü olarak Betadine ile iki kez sürün. Bundan sonra, fareyi stereotaksik bir tutucuya yerleştirin, kafayı vücutla 140 derecelik bir açı oluşturacak şekilde konumlandırın.

Sonra kulaklar arasındaki cilde birkaç damla lidokain uygulayın. Daha sonra, diseksiyon mikroskobu altında oksiputun altındaki cilt üzerinde yaklaşık bir santimetrelik bir kesi yapın. Deri altı dokusunu ve kasları künt cımbızla nazikçe ayırın.

Daha sonra yatay kas demetini aşağı doğru itin ve foramen magnum üzerindeki durayı ortaya çıkarmak için iki dikey kas kızağını birbirinden ayırın. Daha sonra, durayı bir şırınga iğnesi veya çok keskin forseps ile dikkatlice inceleyin. Beyin sapını stereotaktik mikro manipülatörde açığa çıkarmak için, kılcal damarın tutucusunu dikeyden 45 derece döndürün.

Kılcal damarı, serebellar korteksin kıvrımlı kenarı ile ilk servikal omur arasındaki orta noktaya yerleştirin. Pipeti yüzeyden iki milimetre derinliğe yerleştirin, 10 ila 15 dakika içinde 0,5 ila 1,5 mikrolitre boya verin. Kılcal damarı çıkarmadan önce 15 dakika daha yerinde bırakın.

Yavaşça, hassas bir şekilde kasları yeniden hizalayın ve yukarıdaki cildi dikin. Anesteziden tamamen kurtulana kadar hayvanı ısıtılmış bir kafeste tutun. Kalıcı kraniyal pencerenin altında seyrek olarak etiketlenmiş serebellar tırmanma liflerini görselleştirmek için, önce fareyi daha önce olduğu gibi uyuşturun ve hayvanın tamamen sakinleştiğinden emin olmak için ayak parmaklarını kullanın.

Daha sonra, fareyi stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin ve başı deri altından sıkıca tutmak için kulak çubuklarını konumlandırın, beynin şişmesini ve olası iltihabı önlemek için kilogram başına 0.2 miligram, deksametazon ve kilogram başına beş miligram carprofen uygulayın. Bundan sonra, kafatasının üzerindeki cilde bir damla lidokain uygulayın. Kulakların arasından gözlerin üstüne kadar bir kapak kesin.

Daha sonra lidokain solüsyonunu bir neşter ile kazımadan önce periost üzerine tekrar uygulayın. Şimdi beyinciğin üzerindeki yarım daire biçimli bir kafatası bölgesini inceltmek için diş matkabını kullanın. Bir tıraş bıçağı ve cımbız yardımıyla bir kapak camını ikiye bölün.

Ardından, kapak camının kemik koridorundan biraz daha büyük olduğundan ve benzer bir şekle sahip olduğundan emin olun. Ardından, cımbızla kemik kanadını çıkarın. Kapak camını dikkatlice duranın üzerine yerleştirin.

Daha sonra, pencereyi akrilik yapıştırıcı ve diş çimentosu karışımı ile kapatın. Ameliyattan iki ila yedi gün sonra anesteziden tamamen iyileşene kadar hayvanı bir iyileşme odasında bir ısıtma yastığı üzerinde tutun, ilk görüntüleme seansını, anestezi uygulanan hayvanın başını stereotaktik bir tutucuya yerleştirerek gerçekleştirin, böylece kraniyal pencere objektif odak düzlemine paralel uzanır. İki foton floresan ile kraniyal pencerenin altındaki kortekse bakın.

Görüntüleme: Laboratuvar görünümü yazılımını açın ve hedeflenen aksonun 3D rekonstrüksiyonunu oluşturmak için bir Zack edinin. Ardından, lazer gücünü görüntüleme için kullanılan güçten beş ila 10 kat daha fazla artırın. Daha sonra, bir serebellar tırmanma lifinin distal kısmında seçilen noktayı yüksek enerji dozu ile ışınlayın, ablasyonun iyi bir şekilde yapıldığından emin olmak için ışınlamadan birkaç dakika sonra aynı bölgenin bir yığınını elde edin.

Bölge şişmeye başladıysa ve akson boncuk benzeri yapılar oluşturduysa, nöron başarılı bir şekilde diseke edilmiştir. Bu durumda, aksonun distal kısmı birkaç saat içinde dejenere olacak ve tamamen kaybolacaktır. Daha sonra, iki foton in vivo görüntüleme ile lazer ex sodomiyi takip eden günlerde aksonun nihai yeniden şekillenmesini izleyin.

Bu şekil, LOR 4 88 dekstran ile etiketlenmiş ve 16. günden 18. güne kadar iki foton floresan mikroskobu ile in vivo olarak görüntülenen bir serebellar tırmanma lifinin hızlandırılmış görüntülerini göstermektedir. Ve bu şekil, tırmanan bir fiberin tek bir dalındaki lazer ex sodomiyi göstermektedir. Nöron ışınlandı.

İşte 16. günde, bu kırmızı ok ucu, 18. günde lazer balta sodomisi sonrası aksonun distal kısmının kaybolmasını vurgulamaktadır. Ve işte yeni oluşan bir enine dal. Bu prosedürü takiben, immünofloresan boyama veya elektromikroskopi gibi yöntemler, bunlar üzerinde olası yeni sinaptik temas oluşumu gibi ek soruları yanıtlamak veya lazerin neden olduğu hasarın yakındaki yapılar üzerindeki etkili etkisini değerlendirmek için uygulanabilir.

Bu videodan sonra, görüntünün nasıl etiketleneceğini ve lazer taksotomisi ile tırmanan lifleri lazerle nasıl inceleyeceğinizi anlayabilirsiniz.