Büküm ve Moment Ölçümü için Manyetik Cımbız

Manyetik cımbız, güçlü bir tek moleküllü manipülasyon teknikleri, biyolojik makromoleküllerin (manyetik bir tork cımbız olarak adlandırılan bir konfigürasyonu kullanılarak) ve tork (manyetik cımbız serbestçe yörüngeli adı konfigürasyonu kullanılarak) bükümün doğrudan ölçümleri için uyarlanabilir. Bu tür ölçümler yapmak için rehber DNA ve ilgili nükleotid protein filamanların çalışma uygulamaları da dahil olmak üzere verilmiştir.

Bu deneyin genel amacı, tek molekül seviyesinde çift sarmallı DNA moleküllerinin bükülmesindeki burulma gerilmelerini veya değişikliklerini doğrudan ölçmektir. Bu, ilk tahlilde serbest yörüngeli manyetik cımbız veya yumruklu olarak adlandırılan iki tahlil kullanılarak gerçekleştirilir. Tek bir işlevselleştirilmiş DNA molekülü, manyetik bir boncuk ile bir cam yüzey arasına bağlanır.

Silindirik şekilli bir mıknatıs DNA'yı geren bir kuvvet uygularken Bu konfigürasyonda, boncukların açısal konumu, mıknatıs tarafından değil, yalnızca bağlı DNA tarafından sınırlandırılır ve kırmızı okla gösterildiği gibi boncuk dönüşüne izin verir. Dairesel bir halka veya çörek üzerinde yatmak için XY konumu. Bu XY pozisyonunun dönme açısına dönüştürülmesi, manyetik tork cımbızı adı verilen ikinci bir ilgili testte bağlı DNA'nın bükülmesindeki değişikliklerin izlenmesini mümkün kılar veya boncukların açısal hareketini sınırlamak için ana silindirik mıknatısa MTTA yan mıknatısı eklenir.

Bu mıknatıs konfigürasyonu ile, mıknatıs düzeneğinin basit bir şekilde döndürülmesi, ilk burulma olarak gevşetilmiş konfigürasyonuna kıyasla bir dizi tur uygulandıktan sonra boncukların açısal konumunun sapmasının ölçülmesi yoluyla bağlı DNA molekülüne harici torklar uygulanabilir, boncukları sınırlayan manyetik tuzağın sertliğinin kalibrasyonu ile birlikte, açısal hareket, DNA'daki tork birikimini ölçmeyi mümkün kılar. Yazı tipi ve MTT'yi geleneksel manyetik cımbızlara göre kullanmanın temel avantajı, nükleik asitlerin bükülmesindeki torku ve değişiklikleri doğrudan ölçebilmemizdir. Bu yöntem, DNA ve RNA'nın mekaniği hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir ve dış kuvvetlere ve torklara verdikleri tepkileri haritalamamıza izin verebilir.

Bu tekniğin sonuçları, DNA'nın proteinlerle etkileşimlerini araştırmaya kadar uzanır. Örneğin, DNA onarımı, depolanması veya transkripsiyonundan sorumlu proteinler Bu yöntemin görsel gösterimi, geleneksel bir manyetik cımbız kurulumunun ona yeni yetenekler kazandırmak için ne kadar kolay değiştirilebileceğini göstermektedir. Aşağıdaki deneyler için kullanılan kurulum, geleneksel bir manyetik cımbız kurulumuna dayanmaktadır.

Merkezinde, üstten bir LED ile aydınlatılan ve aşağıdan bir mikroskop objektifi ve CCD kamera ile görüntülenen bir akış hücresi bulunur. Akış hücresinin üzerinde, bilgisayar kontrollü motorlar kullanılarak yukarı ve aşağı hareket ettirilebilen ve döndürülebilen bir mıknatıs kafası bulunur. CCD kameradan alınan görüntüler, DNA bağlı boncukların X, Y ve Z konumunu belirlemek için özel laboratuvar görüntüleme yazılımı ile gerçek zamanlı olarak analiz edilir.

Özel laboratuvar görünümü yazılımı, istek üzerine yazarlardan temin edilebilir. DNA'ya bağlı manyetik boncuklara sahip bir akış hücresi hazırladıktan sonra, bunu geleneksel manyetik cımbızlara monte edin ve hem referans boncuğa hareketsiz hale getirilmiş bir yüzey hem de uygun uzunlukta tek bir DNA molekülünün bağlı olduğu bir boncuk seçin. Kurulum, yazı tipi moduna dönüştürülebilir.

Geleneksel cımbız konfigürasyonu için mıknatısı tutan tam mıknatıs kafasını manuel olarak sökerek başlayın. Yazı tipi için silindirik bir mıknatıs tutan mıknatıs kafası ile değiştirin. F için kullanılan silindirik mıknatısı mıknatıs kafasına yerleştirirken, seçilen DNA bağını görüş alanı içinde tuttuğunuzdan emin olun.

Bu prosedürün en zor yönü, mıknatısları form geometrisi için doğru şekilde hizalamaktır. Mıknatısları sistematik olarak hareket ettirerek ve her adımdan sonra hizalamayı test ederek iyi bir hizalama elde edilir, bunu göstereceğiz. Şimdi, laboratuvar görünümü yazılımında mıknatısları manuel olarak hareket ettirmek için konum aşamalarını kullanarak yazı tipindeki mıknatısın bir rota hizalamasını gerçekleştirin.

XY konum dalgalanmalarını veya sapmalarını ölçmek için kayıt düğmesine tıklayın. Kaydedilen izler ekranda gerçek zamanlı olarak görüntülenir ve X, Y, Z konum bilgilerini içeren metin dosyaları olarak kaydedilir. XY sapmaları burada gösterildiği gibi bir yayı takip ederse, silindirik mıknatıs düzgün şekilde hizalanmamıştır, silindirik mıknatısı uygun yönde hareket ettirmeye ve XY dalgalanmaları tam bir dairesel model çizene kadar ölçüm yapmaya devam edin, bu da rota hizalamasının sağlandığını gösterir. Önümüzdeki.

Daha fazla deney için gerekirse, akış hücresini hareket ettirmek için yüksek çözünürlüklü otomatik bir aşama kullanarak yazı tipinde ince bir hizalama gerçekleştirin ve silindirik mıknatısı boncuğun yaklaşık 10 mikronu içinde hizalayın. Ardından, daha önce olduğu gibi, XY gezilerini kaydedin. Dairesel halka üzerindeki dalgalanmalar neredeyse eşit olana kadar sahneyi hareket ettirmeye ve gezileri kaydetmeye devam edin.

Son hizalamayı doğrulamak için, bir histogram veya termogramdaki dalgalanmaları çizmek ve tekdüzelik açısından incelemek için istek üzerine yazarlardan temin edilebilen bir MATLAB komut dosyası kullanın. DNA torkunun ölçümlerini almak için, yazı tipi için kullanılan silindirik mıknatısı çıkarın ve silindirik bir mıknatıs ve kalıcı bir yan mıknatıs ile değiştirin. MTT için, seçilen DNA bağının görüş alanı içinde kaldığından emin olun.

Kontrol laboratuvar görünümü yazılımının ilgili paneline manyetik dönüşlerin sayısını ve oranını girin. Burada. Dönüş sayısı beşe ve hız 0,1 hertz'e ayarlanmıştır. Bu, ölçüm sırasında mıknatısların yavaş dönmesine neden olacaktır.

Daha sonra matlab'da, istek üzerine yazardan temin edilebilen XY konumunu izlemeye dayalı açısal bir izleme komut dosyası kullanın. Açısal dalgalanmaları zamanın bir fonksiyonu olarak gösteren bir çizim, teta T görünecektir. Laboratuvar görünümünde her şey ayarlandıktan sonra kayıt düğmesine tıklayın.

İzler daha önce olduğu gibi gerçek zamanlı olarak görünecektir. Matlab'da, açısal dalgalanmaların standart sapmasını belirlemek için açı sinyaline Gauss uyumu ile ekranda teta T açısı ve T izinin boncuk yüksekliği Z çizimlerini üretmek için MATLAB komut dosyasını kullanın. Sigma teta.

Bu komut dosyası, açısal dalgalanmaların varyansından burulma tuzağının sertliğini doğrudan belirler. Sigma teta radyan cinsinden kare. Burada gösterilen formülü kullanarak, MTT'de, geleneksel manyetik cımbızlardan çok daha düşük olan, radyan başına 10 ila 1000 pico newton nanometre arasında dönme tuzağı sertliği elde etmenin tipik olduğunu unutmayın.

Burada, örneğin, dönme tuzağı sertliğini radyan başına yaklaşık 52 domuz nanometre olarak belirledik. Manyetik tork cımbızının geleneksel manyetik cımbızlara kıyasla dönme tuzağı sertliği, onu tek moleküllü tork ölçümleri için uygun hale getirir, ancak aynı zamanda uygulanabilecek maksimum torkun azaltılması anlamına gelir. Bu, MTT'nin hızlı dönüşün neden olduğu sürtünme torklarını dengeleyemeyeceği anlamına gelir.

Bu nedenle çok hızlı dönmemeye özen gösterilmelidir. Tipik olarak yaklaşık 0.1 hertz hızlarında döneriz. Daha sonra, DNA bağlantısı, mıknatısları yavaşça döndürerek, belirli bir sayıda dönüşle boğulur ve başka bir açısal dalgalanma izi kaydederek, mıknatıs dönüşlerinin sayısı ve hızı, kontrol eden laboratuvar görüntüleme yazılımının ilgili paneline tekrar girilir.

Burada dönüş sayısı 40 ve hız 0,1 hertz olarak ayarlanmıştır. Bu, nükleik asit bağında biriken torku belirlemek için ölçüm sırasında mıknatısların yavaşça dönmesine neden olacaktır. N turdan sonra, açılı parantezlerin ortalamayı ve teta sıfırı gösterdiği burada gösterilen formülü kullanırız.

Ve teta N, sırasıyla burulma olarak gevşemiş bir ipe ve dönüşlere karşılık gelen sıfır dönüşlerdeki açıdır. Mıknatısların döndürüldüğü adımları tekrarlayın ve tek bir ölçüm çalışmasında bir molekülün toque tepkisini tam olarak belirlemek için gerektiği gibi bir açısal dalgalanma platosu kaydedin. Çift sarmallı DNA'ya bağlanması hem uzar hem de gevşeyen onarım proteini RAD 51 tarafından indüklenen DNA bükümündeki değişiklikleri ölçmek için.

DNA rad 51, yazı tipine bağlı bir DNA molekülüne eklendi. Burada gösterildiği gibi, boncuk spiral bir yörünge çizer. Bu hareket, DNA'nın zaman içinde nasıl uzadığını ve gevşediğini tanımlayan bileşenlere ayrılabilir.

MTT kullanılarak DNA'da depolanan torku ölçmek için, uygulanan her dönüş sayısı için sistematik olarak üst ve alt sargılı molekül ve açısal dalgalanmalar ölçüldü. Açısal tuzak sertliğini rapor eden açısal dalgalanmaların standart sapması, uygulanan dönüş sayısından bağımsız olmalıdır. Burada, standart sapma burada gösterildiği gibi yaklaşık dokuz derecedir.

Açısal konumların ortalaması, sabit açısal tuzak sertliği kullanılarak uygulanan dönüş sayısı ile sistematik olarak değişir. Ortalama açıdaki değişiklikler torka dönüştürülür ve uygulanan dönüşlere karşı DNA'da depolanan torku verir. Boncukların Z pozisyonunun eşzamanlı olarak kaydedilmesi, uygulanan dönüşlere karşı DNA'nın uzunluğunu verir.

Bu iki eğri birlikte, DNA'nın aşırı ve az sargıya tam mekanik tepkisini verir. Bu videoyu izledikten sonra, geleneksel manyetik cımbızların kolayca uyarlanabileceği yeni tek molekül tahlillerine serbest yörüngede dönen manyetik cımbızları ve manyetik tork cımbızlarını kullanarak biyolojik moleküller üzerinde nasıl ölçüleceğini, büküleceğini ve torklanacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu tekniklerin geliştirilmesi, örneğin DNA veya RNA'nın burulma özelliklerini incelemek ve DNA sıkıştırma ve onarımı gibi süreçleri gözlemlemek gibi biyofizik alanındaki araştırmaların önünü açmaktadır.