Name: Kemirgen Epididimal Spermatozoalar phosphopeptide Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Keşfedin kemirgen epididimal spermatozoa fosfopeptit analizi yöntemini. Retrograd geri yıkama ile saf hücre izolasyonu, tripsin sindirimi ve TiO2 zenginleştirmesi kullanılarak sperm olgunlaşmasındaki fosforilasyon değişiklikleri kantitatif olarak incelenir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, bu çalışmayı destekleyen kariyer geliştirme ödülü ve hibe destek APP1066336 için NHMRC'ye teşekkür etmek istiyor.

Kültür Medya ve Yemekleri 1. Hazırlık <ol><li> 5.54 g NaCI, 0.356 g KCI, 0.25 g CaCl2, 0.162 g H-2 KO 4 P ve 0.294 gr MgSO 4 Milli-Q su içinde L1 eklenmesiyle Biggers Whitten ve Whitten (BWW) 17 çalışma çözeltisi 200 ml yapmak . Bu stok çözeltisi ve bir aya kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Stok solüsyonundan, NaHCO 3 420 mg ekleyin - 200 mg glikoz, 6 mg sodyum piruvat, 600 mg Sığır Serum Albümin, 0.74 ml sodyum laktat ve BWW stokunun 4.0 ml HEPES tamponu 193 mi. Bu çalışma çözeltisi ve her zaman kullanımdan önce gün taze yapılmış ve 37 ° C&#39;de dengelenir. </li><li> Kanül yapmak için, boru erimeye başlar ki (tipik olarak metanol alev) örneğin 0.4 mm bir iç çapa ve 1,1 mm&#39;lik bir dış çapa sahip polietilen (PE) tüp almak ve düşük bir ısı üzerinde tutun. Hemen outw boru çekmeard germek ve dış çapı daha dar yapmak. </li><li> Vaz deferens kolay kanülasyon için izin verir bir ucunda bir daralma üretmek için Kes. </li><li> Yaklaşık 15 cm kanül diğer ucu kesilir. Künt ucunu 30 G iğne takın, ve buna bir 3 ml şırınga takın (tamamen geri çekilmiş). </li><li> PE boru (4.2 mm iç çap, 6.4 mm dış çapında) bir 20 cm uzunluğunda kesilerek bir emme ağızlık yapın. Bir ucunda bir ağızlık yerleştirin. </li><li> Mikro-kapiller cam tüp tutucu ve cam mikro-kılcal kendisi (bir fare için tipik 3 ul, bir sıçan için 40 ul) yerleştirin. </li></ol> Mouse epididimisten 2. Kaldırma <ol><li> Her kuruma özgü IACUC onaylı prosedürlere göre fareler Euthanize. </li><li> Hayvan al ve epididim maruz skrotum küçük bir kesi yapmak. Saatçilik 5. forseps bir çift kullanarak boşluğundan dışarı testis ve epididim çekin. </li><li> Öyle ki en az 1-2 cm kauda epididimise bağlı kalır vas deferens kesin. Buna ek olarak, testis epididim bağlayan proksimal efferent kanalları ve doku kesip tüm erkek üreme parçayı çıkarın. </li><li> 5-40X sırasına göre bir büyütme aralığında olan bir mikroskop altında tüm erkek üreme parçayı yerleştirin. </li></ol> 3. Epididimis cannulating <ol><li> Daralmış (koni şeklinde) sonunda 1-2 cm lens aracılığıyla ücretsiz ve görünür şekilde mikroskop kanül aşağı Teyp. </li><li> Saatçilik 5. forseps bir çift alın ve yavaşça vaz deferens her tarafını toka ve kanül vaz deferens gider şekilde, kanül üzerine vaz deferens çekin. </li><li> Emilmeyen siyah örgülü tedavi ipek (boyut 5-0) uzunluğu alın ve kanüle vaz deferens etrafında bir düğüm. Emin olun düğüm vaz deferens içinde kanül tutmak için sıkı çekildiğinde hava basıncı from şırınga uygulanır. </li></ol> 4. retrograd veya Caudal Epididimal Spermatozoa&#39;lar Ters yıkama <ol><li> Saatçiler 5. forseps kullanarak, kauda epididymisten distal ucunu yakala ve bir tek epididim tübül ortaya koymak için tunika albuginea&#39;yı kaldırın. </li><li> Forseps kullanarak, hafifçe maruz tübül çekin ve sperm serbest bırakılması için bir açıklık oluşturmak amacıyla daha sonra ayrı kızdırmak. </li><li> Vas deferens içine şırınga havayı atmak şekilde yavaşça 3 ml (fare) veya 20 ml (sıçan) şırınga itin. Uygun basınçta, sperm yavaş yavaş kauda epididimis uzak ucunda kırık tübül çıkmaya başlayacaktır. Bu zamanda, cam boru içine sperm çekmek için ağız emme uygulanır. Not: Genellikle bir farede, sperm 2-3 ul hayvanın yaşına bağlı olarak elde edilebilir. Bir sıçan irade, ortalama verim 30-40 ul üzerinde. </li></ol> 5. Yıkamave Proteomics Hazırlık spermatozoa Parçalama <ol><li> Yavaşça mikrofona üfleme veya bir şırınga takmak ve kılcal geri sperm itmek üzere havayı atarak BWW çözeltisi 1 ml çözelti (37 ° C) içine cam kapiller gelen sperm kovmak. </li><li> Sperm hücrelerinin dağınık sonra, kirletici proteinleri uzaklaştırmak için 1 mi oranında BWW ile 3 kez (300 x g, 5 dakika) yıkanır. Son yıkamadan sonra, süpernatant kaldırmak. Not: Bu noktada, sperm hücreleri daha sonra kullanılmak üzere dondurulabilir. </li><li> Aralıklı vorteks ile 1 saat süre ile 4% CHAPS, 2M tioüre ve 50 mM Tris, pH 7.4 kullanılarak proteinleri çözünebilir hale getirdi. </li><li> Hücreler, santrifüj (10,000 x g, 20 dk) Lize etme sonrasında üstteki sıvı kısmı alınır ve yeni bir tüpe aktarılır. Not: Bu noktada, protein, miktar tayini yapılabilir. </li></ol> 6. disülfit bağ Azaltma ve Alkilasyonu <ol><li> Lize proteinlere nihai bir konsantrasyona kadar 10 mM DTT ekleme Vorty ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> Lizat, girdaba nihai bir konsantrasyona kadar 50 mM idodoacetamide ekleyin ve karanlıkta 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li></ol> 7. Yağış <ol><li> Metanol kloroform, lizatın 1 hacim (örnek olarak 400 ul) ekleyerek örnek çöktürmek metanol bir hacmi (400 ul) ve 0.5 hacim (200 ul) kloroform ekleyin. </li><li> Vortex örnek ve spin (10.000 xg, 2 dk). </li><li> Iki faz santrifüj aşağıdaki görüneceğini unutmayın. Üst tabaka (dikkatli olmak arayüzü rahatsız değil) bütün fakat 2 mm atın. </li><li> Metanol 1 hacim (400 ul) ekleyin, invert tüpü yavaşça (10.000 xg, 15 dk) karıştırın ve tekrar dönmeye 1-2x. 3-4 dakika atık süpernatant ve hava kuru pelet atın. </li></ol> 8. Tripsin Sindirim <ol><li> 50 oranında 1 M üre ihtiva eden 25 mM amonyum bikarbonat içinde tripsin sulandırın: 1 (a / a protein: tripsin) ve ove kuluçkalanmıştırtercihen bir termomikser üzerinde 700 rpm&#39;de 37 ° C&#39;de rnight. </li><li> Sıkma (10,000 x g, 15 dakika) sindirilmemiş malzeme peletlendi. Yeni bir tüpe süpernatant aktarın. </li></ol> 9. phosphopeptide Zenginleştirme <ol><li> Daha önce açıklandığı gibi 18 sindirmek triptik gelen arınma ve Phosphopeptides zenginleştirme gerçekleştirin. 350 mg / ml 2,5 dihydrobenzesulfonic asit (DHB),% 80 (h / h) ACN (asetonitril),% 2 (v / v) TFA (trifluoroasetik: Triptik peptitler DHB tamponunda 10 kat seyreltilir [DHB tamponu oluşmaktadır asit)] ve Tio 2 boncuk (200 mikrogram) kurumaya geçerlidir. </li><li> 1 saat süre ile, oda sıcaklığında, bir döndürücü üzerinde bırakın. </li><li> DHB tamponu ile örnek yıkayın dönmeye ve süpernatant kaldırmak. Daha sonra numune, yıkama tamponu [% 80 ACN (h / h),% 2 TFA (h / h)], DHB &#39;nin çıkarmak için üç kez yıkayın. </li><li> Nihai döndürmesi sonrasında doğrudan% 2.5 amonyum hidroksit 25 ul, pH ≥ 10.5 çözeltisinin eklenmesiyle elüsyon tamponu kullanılarak fosfopeptidler tasfiye edilir. Spin ve süpernatant kaldırmak. Hemen ~ 0.3 ul formik asit ile nötralize. </li></ol>

<ol><li>Blandau, R., Rumery, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+of+swimming+movements+of+epididymal+spermatozoa+to+their+fertilizing+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">The relationship of swimming movements of epididymal spermatozoa to their fertilizing capacity.</a> Fertil. Steril. 15, 571-579 (1964).</li>
<li>Tournade, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diff%C3%A9rence+de+motilit%C3%A9+des+spermatozo%C3%AFdes+pr%C3%A9lev%C3%A9s+dans+les+divers+segments+de+l%E2%80%99%C3%A9pididyme%5BTitle%5D)+AND+%22C.+R.+Soc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Différence de motilité des spermatozoïdes prélevés dans les divers segments de l’épididyme.</a> C. R. Soc. Biol. 74, 738-739 (1913).</li>
<li>Wyker, R., Howards, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropuncture+studies+of+the+motility+of+rete+testis+and+epididymal+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Micropuncture studies of the motility of rete testis and epididymal spermatozoa.</a> Fertil. Steril. 28, 108-112 (1977).</li>
<li>Eddy, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+germ+cell+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+progress+in+hormone+research%22%5BJournal%5D)">Male germ cell gene expression.</a> Recent progress in hormone research. 57, 103-128 (2002).</li>
<li>Lin, M., Lee, Y. H., Xu, W., Baker, M. A., Aitken, R. J. Ontogeny of Tyrosine Phosphorylation-Signaling Pathways During Spermatogenesis and Epididymal Maturation in the Mouse. 75 (4), 588-597 (2006).</li>
<li>Jones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+structure+and+remodelling+during+sperm+maturation+in+the+epididymis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil.+Suppl%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane structure and remodelling during sperm maturation in the epididymis.</a> J. Reprod. Fertil. Suppl. 53, 73-84 (1998).</li>
<li>Robaire, B., Hinton, B. T., Orgebin-Crist, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRobaire%2C+B+%22The+Epididymis%22">The Epididymis</a>. Neill, J. D. 3, Elsevier. 1072-1120 (2006).</li>
<li>Lacham, O., Trounson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilizing+capacity+of+epididymal+and+testicular+spermatozoa+microinjected+under+the+zona+pellucida+of+the+mouse+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Fertilizing capacity of epididymal and testicular spermatozoa microinjected under the zona pellucida of the mouse oocyte.</a> Mol. Reprod. Dev. 29, 85-93 (1991).</li>
<li>Bedford, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+duct+ligation+on+the+fertilizing+ability+of+spermatozoa+from+different+regions+of+the+rabbit+epididymis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Effects of duct ligation on the fertilizing ability of spermatozoa from different regions of the rabbit epididymis.</a> J. Exp. Zool. 166, 271-281 (1967).</li>
<li>Orgebin-Crist, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+function+of+the+epididymis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol%2C+Reprod%22%5BJournal%5D)">Studies on the function of the epididymis.</a> Biol, Reprod. 1, 155-175 (1969).</li>
<li>Orgebin-Crist, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+spermatozoa+in+the+rabbit+epididymis%3A+effect+of+castration+and+testosterone+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Maturation of spermatozoa in the rabbit epididymis: effect of castration and testosterone replacement.</a> J. Exp. Zool. 185, 301-310 (1973).</li>
<li>Lin, M., Hess, R., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+sperm+maturation+in+vitro+in+epididymal+cell+cultures+of+the+tammar+wallaby+%28Macropus+eugenii%29%3A+disruption+of+motility+initiation+and+sperm+morphogenesis+by+inhibition+of+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Induction of sperm maturation in vitro in epididymal cell cultures of the tammar wallaby (Macropus eugenii): disruption of motility initiation and sperm morphogenesis by inhibition of actin polymerization.</a> Reproduction. 124, 107-117 (2002).</li>
<li>Baker, M. A., Hetherington, L., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+SRC+as+a+key+PKA-stimulated+tyrosine+kinase+involved+in+the+capacitation-associated+hyperactivation+of+murine+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of SRC as a key PKA-stimulated tyrosine kinase involved in the capacitation-associated hyperactivation of murine spermatozoa.</a> J. Cell. Sci. 119, 3182-3192 (2006).</li>
<li>Baker, M. A., Hetherington, L., Curry, B., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+and+consequent+stimulation+of+the+tyrosine+kinase+c-Abl+by+PKA+in+mouse+spermatozoa%3B+its+implications+during+capacitation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation and consequent stimulation of the tyrosine kinase c-Abl by PKA in mouse spermatozoa; its implications during capacitation.</a> Dev. Biol. 333, 57-66 (2009).</li>
<li>Baker, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Titanium+Dioxide+To+Find+Phosphopeptide+and+Total+Protein+Changes+During+Epididymal+Sperm+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Use of Titanium Dioxide To Find Phosphopeptide and Total Protein Changes During Epididymal Sperm Maturation.</a> J. Proteome. Res. 10 (3), 1004-1017 (2010).</li>
<li>Baker, M. A., Weinberg, A., Hetherington, L., Velkov, T., Aitken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-Ejaculatory+Changes+in+the+Metabolic+Status+of+Rat+Spermatozoa+as+Measured+by+GC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Post-Ejaculatory Changes in the Metabolic Status of Rat Spermatozoa as Measured by GC-MS.</a> Metabolomics. 11, 1-14 (2012).</li>
<li>Biggers, J. D., Whitten, W. K., Whittingham, D. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBiggers%2C+JD+%22The+culture+of+mouse+embryos+in+vitro%22">The culture of mouse embryos in vitro</a>. , Freeman. (1971).</li>
<li>Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+from+peptide+mixtures+using+titanium+dioxide+microcolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns.</a> Mol. Cell. Proteomics. 4, 873-886 (2005).</li>
<li>Wessel, D., Flugge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Anal. Biochem. 138, 141-143 (1984).</li>
<li>Thingholm, T. E., Jorgensen, T. J., Jensen, O. N., Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+using+titanium+dioxide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides using titanium dioxide.</a> Nat. Protoc. 1, 1929-1935 (2006).</li>
<li>Thingholm, T. E., Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+titanium+dioxide+micro-columns+to+selectively+isolate+phosphopeptides+from+proteolytic+digests%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of titanium dioxide micro-columns to selectively isolate phosphopeptides from proteolytic digests.</a> Methods. Mol. Biol. 527, 57-66 (2009).</li>
<li>Ecroyd, H., Asquith, K. L., Jones, R. C., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+signal+transduction+pathways+during+epididymal+maturation+is+calcium+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The development of signal transduction pathways during epididymal maturation is calcium dependent.</a> Dev. Biol. 268, 53-63 (2004).</li>
<li>Ecroyd, H., Jones, R. C., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+Phosphorylation+of+HSP-90+During+Mammalian+Sperm+Capacitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Tyrosine Phosphorylation of HSP-90 During Mammalian Sperm Capacitation.</a> Biol. Reprod. 69 (6), 1801-1807 (2003).</li>
<li>Jones, R., Mann, T., Sherins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxidative+breakdown+of+phospholipids+in+human+spermatozoa%2C+spermicidal+properties+of+fatty+acid+peroxides%2C+and+protective+action+of+seminal+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa, spermicidal properties of fatty acid peroxides, and protective action of seminal plasma.</a> Fertil. Steril. 31, 531-537 (1979).</li>
<li>Wade, M. A., Jones, R. C., Murdoch, R. N., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+activation+and+second+messenger+signalling+in+spermatozoa+from+rat+cauda+epididymidis%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Motility activation and second messenger signalling in spermatozoa from rat cauda epididymidis.</a> Reproduction. 125, 175-183 (2003).</li>
<li>Nolan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm-specific+protein+kinase+A+catalytic+subunit+C%7Balpha%7D2+orchestrates+cAMP+signaling+for+male+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Sperm-specific protein kinase A catalytic subunit C{alpha}2 orchestrates cAMP signaling for male fertility.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13483-13488 (2004).</li>
<li>Mitchell, L. A., Nixon, B., Baker, M. A., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+role+of+SRC+in+capacitation-associated+tyrosine+phosphorylation+of+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Investigation of the role of SRC in capacitation-associated tyrosine phosphorylation of human spermatozoa.</a> Mol. Hum. Reprod. 14, 235-243 (2008).</li>
<li>Leclerc, P., Goupil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+human+sperm+tyrosine+kinase+c-yes.+Activation+by+cyclic+adenosine+3%27%2C5%27-monophosphate+and+inhibition+by+Ca%282%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Regulation of the human sperm tyrosine kinase c-yes. Activation by cyclic adenosine 3',5'-monophosphate and inhibition by Ca(2).</a> Biol. Reprod. 67, 301-307 (2002).</li>
<li>Krapf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Ser%2FThr+phosphatases+induces+capacitation-associated+signaling+in+the+presence+of+Src+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Ser/Thr phosphatases induces capacitation-associated signaling in the presence of Src kinase inhibitors.</a> J. Biol. Chem. 285, 7977-7985 (2010).</li>
<li>Lundgren, D. H., Hwang, S. I., Wu, L., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+spectral+counting+in+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Role of spectral counting in quantitative proteomics.</a> Expert. Rev. Proteomics. 7, 39-53 (2010).</li>
<li>Platt, M. D., Salicioni, A. M., Hunt, D. F., Visconti, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+differential+isotopic+labeling+and+mass+spectrometry+to+analyze+capacitation-associated+changes+in+the+phosphorylation+status+of+mouse+sperm+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Use of differential isotopic labeling and mass spectrometry to analyze capacitation-associated changes in the phosphorylation status of mouse sperm proteins.</a> J. Proteome. Res. 8, 1431-1440 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

sperm başarılı ve tekrarlanabilir proteomik analiz için kritik adımlar şunlardır: başlangıç ​​malzemesinin 1) saflık; İstenmeyen tuzların ve deterjanların 2) çıkarılması; Tripsin proteinleri, yüksek bir verim sindirimi izin verecek şekilde 3) tam kapasitede proteinleri denatüre ve 4) peptidin kaybını azaltmak için kullanım örneği en aza indirir. Başarılı bir şekilde cauda epididimisi Geri akış için, bu sperm çıkar olan alan bulmak için gereklidir. Sıçan ve farelerin her ikisinde de, bu epididimis kaudal bölgenin ortasında (Şekil 2A &#39;ya bakınız), konkav alanın üst ucunda. Bir vas deferens doğru daha gelirse, geri yıkama kolay ve başarı oranı genellikle yüksektir. Ancak, bu sperm sayılarının kaybı geliyor. Bir külliyatı daha yakın hareket ettirmeye çalışır Alternatif olarak, eğer o basınç miktarı epididymis yoluyla geri sperm itmek için gerekliEl kanallar epididime hasar kaçınılmaz oluşur, genellikle çok yüksek. Epididimis Ters yıkama geleneksel sperm 22-25 kaldırmak için su, doymuş, mineral yağ ve bir ortam olarak şırınga kendi içinde dengeli tuz çözeltisi kullanılarak gerçekleştirilir. Her iki prosedürler LC-MS potansiyel sorunludur. İlk olarak, maden hiçbiri prosedürü taşınan böylece alınmalıdır temel proteomik analizi ve bakımı için dünya çapında kullanılan nano-C18 nano sütun engellemek için olasıdır. Bu durum ortaya çıkarsa, devam etmek imkansız ve örnek aslında kaybolur. Bu, başarılı olsa da, yakında BWW çözelti temas gelen en kısa sürede sperm çok hareketli hale kabul kaudal epididimal ile karıştırılır, ancak oranında BWW veya şırınga diğer dengeli tuz çözeltileri kullanılarak aşılabilir Hücreler. Bu sorunu aşmak için biz sadece hava ile sperm Backflush. Sadece Qual olansıvı bazlı yöntemler karşılaştırılabilir sperm Sığ, ama miktarı aynıdır. Phosphoproteomics belki sinyal yolları sperm sonrası boşalma meydana hangi kurmak için tek yollarından biridir. Biz araştırıyoruz önemli yollardan biri kapasitasyon işlemidir. Bir yumurta bağlanabilen önce spermatozoa &quot;kapasitasyonu&quot; geçmesi gerekmektedir. Uygulamada, bu, bir süre için sperm inkübe edilerek esas olarak elde edilir (sıçan 1.5 saat, fare, 40 dakika, insan 3-24 saat), serum albümini BWW çözelti içinde gerçekleştirilir. Daha önce, ve diğerleri kapasitasyonu ilgili çeşitli kinazlar için bir rolü olduğunu göstermiştir. Ilgi, PKA silinmesi II olan sperm in vitro kendiliğinden yüzmek fareler üretmek, ancak hiperaktivasyondan 26 uğramaz edebilir μ. İkinci sperm bir düşüğe, yüksek hız, düşük genlikli kendi yüzme desen değiştirmek sayede, kapasitasyon bir özelliğidirhız, yüksek genlik frekans yendi. Biz bu süreçte yer alan mansap kinazlar pp60-CSRC (SRC) dahil göstermiştir 13,27 c-evet 28 ve c-ABL 14. İlginç bir şekilde, SRC inhibisyonu kapasitasyon bağımlı tirozin fosforilasyonunu 13 durur. Bununla birlikte, bu, SRC doğrudan tirosin fosforilasyonu 29 genel başlaması ile ilintili olan değil ama bir fosfatazı 29 regüle olabileceğini düşündürmektedir okadaic asit ile aşılabilir. epididim dışarı sperm zorlamak için bir araç olarak BWW kullanarak sorun bir kez aktive, fare sperm sadece yetkilendirmek için yaklaşık 40 dakika sürer olduğunu. Sperm izolasyonu 5 dak / fare ve genellikle birkaç fareler deneyde kullanılan alabilir göz önüne alındığında, daha sonra sperm deneyin başlangıcında vade farklı aşamalarında olur. Bunun üstesinden gelmek için, hava basıncı, cam kanül içine kuyruk epididimden sperm itmek için kullanılabilir. Sadece tüm sperm İnakt vardırive ve kaudal ortamda bulunacağını esas olarak, bu mümkün olmayan hareketli ve hareketli phosphoproteomics karşılaştırmak için yapar. Iki farklı fonksiyonel durumlarda sperm karşılaştırırken phosphoproteomics için işleme örnek minimumda tutulmalıdır. Protein yağış 1) diğer geleneksel yöntemlere göre metanol kloroform kullanımı 2) tuz ve yağ hemen hemen tüm izlerini ortadan kaldırır ve 3) TCA 19 üzerinde düşük bolluk proteinleri çöktürmek için kanıtlanmış bir yeteneği vardır, ekstra yıkama adımlar ihtiyacını azaltır. Tripsin sindirimi öncesinde protein yağış proteini (tripsin sindirim yardımcı olan) denatüre bu yardım yapar, ancak hücre içinde bulunan MS-uyumsuz metabolitlerin birçok kaldırır sadece beri tavsiye edilir. Sperm Phosphopeptides karşılaştırması çeşitli şekillerde yapılabilir. Başka bir bu temel düzeyde bir numunede belirlenen fosfopeptid basit bir karşılaştırılması, en&quot;spektral sayımı&quot; olarak bilinen işlemde örnek yapılabilir. Erken proteomik çalışmalar düşük çoğaltır kullanılarak çünkü Ancak eleştiri temelde bu yaklaşım olmuştur (dolgun bir tartışma için Lundren ark. 30). Daha sofistike bir yaklaşım peptit ana kütlesinin yoğunluğu bakmak ve diğer örneklerin (etiket ücretsiz karşılaştırma) ile bu karşılaştırmaktır. Şekil 4&#39;te gösterilen örnekte, m / z 650-670 olmayan hareketli dan (Şekil 4) durumunda mevcut değildir fakat hareketli olarak mevcut olan bir peptit (Şekil 4 alt) sperm görülebilir. MS temelli etiket serbest miktar olarak adlandırılır Bu işlem, bir etiket içermeyen bir stratejidir. Yaygın proteomik ölçümü için gerekli çalışan miktarını azaltmak için kullanılan alternatif bir strateji izotopları kullanmaktır. Bir izotop kütle farklı olduğu için, kütle spektrometresi elüt yoğunluklarını karşılaştırmak için kullanılabilirpeptidler ing. Bununla birlikte, diğer hücre tipleri farklı olarak, bazı izotopik etiketleme sperm tatbik edilemez. Doku kültüründe kullanılabilir Örneğin, kararlı izotoplar eklenmesi (bir hafif bir versiyonu başka ilave alır iken bir ağır izotop, bir örneğe eklendi alır). Izotoplar protein içine dahil olsun zaman, proteomik analizi iki numune (çoklayıcı) birleştirilmesi ile gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte sperm durumunda bu, 1) izotop işaretleme doku kültüründe () 8 kadar çeşitli pasajlar gerektirir ve 2), sperm hücreleri, bu nedenle herhangi bir nükleer gen, transkripsiyon ve çeviri sahiptir ve bu sadece gerçeği sayesinde, yapılamaz onlar zaten tüm protein içine izotopları dahil değildir. Bu etrafında bir yolu, radyo-etiketli fare sipariş etmek, bununla birlikte, bu bildiği pahalıdır. Alternatif bir yaklaşım kimyasal etiketi kullanmaktır. Bu sigara kapasitan fareler kapasitan fareler ile karşılaştırıldığında yapılmıştır. Bu durumda, D 0 ve D ise <sub&gt; 3 -label kütle spektrometresi 31 bir örnek ve bir başka ayırt etmek için kullanıldı. Diğer yaklaşımlar lizinlerinin farklı kütle izotoplar ile kimyasal olarak etiketlenmiştir böylece iTRAQ (nispi ve mutlak miktar tayini için izobarik etiketi) kullanımını içerebilir; sisteinler farklı kütle izotopları ve ağır ve hafif su etiketleme ile etiketlenmiş sayede iCAT (izotop kodlu afinite etiketi). Her durumda, bununla birlikte, tek bir şey akılda tutulması gerekmektedir. MS, sadece bir numunede mevcut olanı raporları, ve bu o noktaya o örnek up oldu her şeyin bir yansımasıdır. Her adımda veriminin maksimize ederken örnek işlemlerine en aza indirmek başarılı proteomik analizi için gereklidir.

Testisten çıkan sonra, sperm oldukça henüz belirgin ayırt edilir, bu hücreler olgunlaşmamış 1,2 bulunmaktadır. Gibi, onlar oosit 3 yüzmeye yeteneği ve bağlama dahil, komple işlevselliği eksikliği. Sperm daha olgunlaşması gerekmektedir, ancak, hücre farklılaşma bu aşamasında, bu gen transkripsiyonu ve daha fazla protein biyosentezi 4 yetersiz olduğundan, bu kanonik yollar ile meydana gelemez. Onlar testis terk ve epididim 5 olarak da bilinen erkek üreme sisteminin bir parçası girerken Biyolojik yetkinlik sperm üzerine haiz. epididimis vaz deferens için (testis) efferent kanalları birbirine bağlayan ve tüm erkek memelilerde 6 mevcut olan sıkı sarmal, son derece farklılaşmış tüp. Spermatozoa kademeli cr olduğunu sürekli değişen lümen ortama dayanarak, epididim iniş sırasında gübreleme potansiyeli kazanmakYerel epididimal epitel hücreleri 7 ile Eated. epididim ortam eyleminde bulunan çeşitli salgı ve yeniden emici faaliyetler protein, karbonhidrat ve lipid kompozisyonu 6 değişen, sperm kendisi değiştirmek için. Bu yapının özellikle ilk &#39;caput&#39; bölge epididimis önemi, cerrahi ligasyon teknikleri kullanılarak 8 örneklenmiştir. Efferent kanalı ligasyonu ile testis içinde sperm tutulan tamamen oosit 9-11 döller herhangi bir sıfatla eksiktir. Epididimal ortamına ek olarak, sperm çalışma içinde sinyal iletim yolları translasyon sonrası mevcut sperm hücresi tamamlayıcı değiştirmek için kullanılır. Örneğin, epididim erken bölgelerinden sperm bu ikinci bölgelere 5,12 oranla protein fosforilasyon farklı desen görüntüler. C büyük farklılıklar vardır çünkü bu şaşırtıcı değilBu bölgelerden sperm apability. Örneğin, erken gelen, epididim kaput spermatozoa immotilite vardır. Buna karşılık, kauda bölgeden sperm hücreleri ileri bir kez izotonik ortamda yerleştirilen ilerici hareketliliğini uğrayacaktır. Epididimal sperm hücrelerinin de novo protein sentezi aciz olduğu için, sperm fonksiyonunu düzenleyen tüm iç yolları post-translasyonel modifikasyonlar (PTM) üzerinden olmalıdır. Bu nedenle, bu işlenmektedir nedenle duruyor ve biz sperm hücresi olgunlaşmasını anlamak istiyorsak özellikle fosforilasyon gibi PTMS soruşturma büyük bir itme olmalıdır. Alternatif bir yöntem, 13-16 retro geri akışlandırma kullanımı epididymidies spermatozoa elde edildi. Bu tekniğin kesinlikle daha zaman alıcı ve operatör tarafından beceri büyük bir derecesi alır rağmen, sperm sürekli% 99,99 aşan saflığını göstermek aldı. Buna ek olarak, tüm diğer tekniklerin aksine, sperm can mümkün sperm hareketliliği nasıl başladığı çalışma yapma, hareketsiz bir durumda izole edilebilir. Numune hazırlama proteomik analiz için en önemli unsur olduğundan, sperm izolasyon sperm proteomik çalışmaların en önemli yönlerinden biri haline gelmiştir. Bu protokol kauda epididimis izole nasıl sperm bir açıklama sağlar. Bunu takiben, TiO2 fosfopeptid zenginleştirme işlemi son derece farklılaşmış sperm hücrelerinden peptidler ayıklamak için nasıl özel referans ile, ana hatlarıyla. MS yaklaşım bir tek devlet kaudal epididim sperm karşılaştırmak olsaydı değişen Phosphopeptides ayırt etmek için kullanılabilir (hareketsiz veya non-kapasitan) sperm incelemek için bu güçlü bir yaklaşım yapma (vb, tepki gösterdi hareketli, kapasitan akrozomun) başka işlevi.

<table><tbody><tr><td>2,5-Dihidroksi-1,4-benzokinon</td><td>Aldrich</td><td>195464</td><td></td></tr><tr><td>2-D Kantitasyon Kiti</td><td>VWR (GE Healthcare)</td><td>80-6483-56</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serumundan albümin</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Amonyak çözeltisi %25</td> <td>Merck</td><td>1.05432</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum bikarbonat</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS 3 - [3- (kolamidopropil) dimetilamonyak ] -1-propansülfonat</td><td>Araştırma Organikleri</td><td>1300C</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>BDH</td><td>10077.6B</td><td></td></tr><tr><td>Disodyum hidrojen fosfat</td><td>Merck</td><td>1.06580</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td> <td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Formik asit</td><td>Sigma</td><td>O6440</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin-L</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (serbest asit)</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>İyodoasetik asit içermeyen asit</td><td>Sigma</td><td>I4386</td><td></td></tr><tr><td>Laktik asit</td><td>Sigma</td><td>L1750</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Res. Org.</td><td>0090M</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck</td><td>10158.6B</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (steril)</td><td>VWR (GE Healthcare)</td><td>GEHE17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataz İnhibitörü Kokteyl Halt</td><td>ThermoFisher Scientific (Pierce)</td><td>PIE78420</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum hidrojen karbonat</td><td>Tıbbi Mağaza</td><td>CH 600</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dihidrojen fosfat</td><td>Merck</td><td>1.06346</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidrojen karbonat</td><td>BDH</td><td>10247.4V</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Tris, ultra saf sınıf</td><td>Amresco (Astral)</td><td>AM0497</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin Altın, kütle özellik sınıfı</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td></td></tr><tr><td>Üre</td><td>Sigma</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>Çinko klorür</td><td>Sigma</td><td>Z0173</td><td></td></tr><tr><td>0.4 mm Polietilen boru</td><td>Goodfellow</td><td>ET317100</td><td></td></tr><tr><td>30 G iğne</td><td>Terumo</td><td>NN2038R</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Şırınga</td><td>Terumo</td><td>SS035</td><td></td></tr><tr><td>4.2 mm Polietilen boru</td><td>Goodfellow</td><td>ET317640</td><td></td></tr><tr><td>Örgülü ipek (5-0)</td><td>Dynek</td><td>CSS0100</td><td></td></tr><tr><td>Trikloroasetik asit</td><td>Sigma</td><td>299537</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 boncuklar (demonte kolondan)</td><td>Titansphere</td><td>6HT68003</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tüp</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>C7B30</td><td>Sigma</td><td>C0856</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

kemirgen epididimal spermatozoa&#39;lar phosphopeptide analizi

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Spermatozoa hücre tipleri arasında oldukça özeldir. Testiste üretilen rağmen ön-imleç yuvarlak hücreli uzatılmış ve morfolojik bir spermin olarak tanınan ne içine ayırt başlar kez, hem nükleer gen transkripsiyonu ve çevirisi kapatılır. Ancak, sperm hareketliliği veya yumurta tanınması için hiçbir yeteneğine sahip, çok olgunlaşmamış olduğunu. Bu olayların her ikisi de sperm geçiş kez epididim olarak bilinen ikincil bir organ meydana gelir. Bir sperm hücresi epididime geçmesi için gereken ~ 12 gün geçişi sırasında, mevcut proteinlerin post-translasyonel modifikasyonlar hücre olgunlaşmasında önemli bir rol oynamaktadır. Böyle bir büyük faset protein fosforilasyonu olduğunu. Sperm olgunlaşması sırasında oluşan fosforilasyon olaylarını karakterize etmek amacıyla, saf sperm hücresi popülasyonları ve Phosphopeptides ön ayırma hem de tespit edilmelidir. Saf sperm o izolasyonu için, bir yöntem yıkama teknikleri geri kullanmadistal veya kuyruk epididymisten f kaliteli ve verim özetlenmiştir. çözülmesi, sindirim ve TiO2 afinite kromatografisi aracılığıyla spermin Phosphopeptides ön paya ayırma için adımlar açıklanmıştır. İzole sonra, fosfopeptidler, sperm olgunlaşması işlemleri sırasında fosforilasyonu yer alarak seviyelerini spesifik amino asit kalıntıları iki protein fosforilasyon olaylarını belirlemek ve ölçmek için, MS içine enjekte edilebilir.

Herhangi bir proteomik analiz sonuçlarının kalitesi başlangıç ​​malzemesinin büyük ölçüde bağlıdır. Modern MS ile, örnek hazırlıkları hafif kirlenmeler kolayca toplanır. Bu nedenle, son derece saf sperm veren bir yöntemi seçmek için, sperm hücresi proteomik durumunda, önemlidir. Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi, retrograd geri yıkama kauda epididimis sperm hücrelerini almak için kullanılır. Bu, bir yavaş yavaş ekli şırınga hava basıncını uygulamak sağlar PE boru ile vas deferens cannulating içerir. Şekil 1A vas deferens ile birlikte kauda epididimiti göstermektedir. Şekil 1B vaz deferens bağlı nasıl bir kadar yakın çekim olduğu kanül yerleştirilir. Yaparken, bu yüzden sperm kuyruk epididymisten bir tübül eksize sonunda serbest bırakılır. Şekil 2A&#39;da gösterildiği gibi, sperm Caud tepe bölgelerinden ekstre edilmiştirBir Epididimis ve hareketsiz bir durumda (Şekil 2B) bir cam boru içine kadar emilir. Bu daha önce ve hareketlilik aktivasyonu sonrası sperm bir phoshoproteomic analizini gerçekleştirmek için yeteneği en az olan geleneksel &quot;swim-up&quot; yöntemleri, üzerinde birçok avantajı vardır. sperm sonra kişinin seçim ortamına ihraç edilebilir. Şekil 2C (sol taraf) sperm BWW ortama sınırdışı hemen sonra nasıl görüneceğini gösterir. Hücrelerin çoğu kümeleştiler edilir. Onlar solüsyonu (Şekil 2C, sağ tarafı hücreleri) içine homojenlik dışarı yüzmek Ancak, hücrelerin 10 dakika sonra yetkinlik gösterilmiştir. Geri yıkama tekniği sperm hücreleri çok az etkisi olduğundan, biz yakın% 100 motilite almak ve hücreler dış provokasyon olmadan ortama hızla dağılırlar. Tipik bir geri yıkama deneyde, sperm İsviçre-fare içerir kurtarıldı6 10 x 1-5 arası hücre. Bu hayvanın yaşına bağlıdır ve farklı fare suşları arasında değişebilir. Norveçli Rat, biz genellikle 200 x 10 6 sperm elde,% 20 ±. Şekil 2B sıçan kauda epididimis elde edilen sperm saflığını temsil eder. Numune kendisi dışında, örnek hazırlama ile ilgili önemli konulardan biri tripsin sindirimi ürünüdür. Protein çökeltme de proteinleri denatüre sadece MS ile uyumlu olan, her ikisi de, istenmeyen deterjanlar ve bunların tuzlarını, ortadan kaldırılması, çok önemli bir rol oynar. En iyi çalışması için metanol-kloroform çökelmesini bulduk. Sadece bu prosedür TCA yağış 19 olmak üzere diğerlerinden daha iyi düşük bol protein çöktürmek bildirilmiştir, ancak ek avantajlar sahiptir. TCA ile presipitasyondan sonra, oldukça kalabilir TSA pelletinin süspansiyonu ardından pH yeniden ayarlamak için genellikle gereklidirasidik. TCA Çökelen topak asiti çıkarmak için yüksek organik çözeltiler içinde yıkanabilir olsa da, bu taşıma ve sonuçların irreproducibility örnek ekler. Asidi nötralize etmek için ihmal kötü triptik peptid verimi ile sonuçlanır. Metanol-kloroform yağış sadece hızlı ama örnek asitleştirmek olmaz. 3 tipik alt ve üst interfazda arasındaki numune 100 ug görülen protein pelet göstermektedir Şekil. Phosphopeptides izolasyon bir dizi yolla meydana gelebilir; Ancak uyarlık örneği bu aşamada dahil kadar ele alınmış ve nasıl bağlıdır. Daha yaygın, gelişmekte olan yöntemlerden biri de TiO2 olduğunu, aslında Martin Larsen 18,20,21 grubu tarafından geliştirilen. Microcolumns kullanmak için bir işlem olarak açıklanmaktadır, ancak biz toplu kromatografisi kullanılarak tekrarlanabilir verileri de elde edebilir. sürecin başarısı elüsyon tamponu üzerinde bağımlı olduğu, deli olan olmalı<html> Doğru bileşim ile, e; aksi takdirde fosfopeptidler hiç ayrıştırılmıştır değildir. TiO2 gelen protokol ve temsil verilerin tekrarlanabilirliği olmayan hareketsiz (Şekil 4 üst) ve m hareketli (Şekil 4 alt) devlet içinde kauda epididim sperm Phosphopeptides zenginleştirilmiş / z 650-670 görülebilir. Bu biyolojik çoğaltır 17 kullanıldığında bile bir çok tekrarlanabilir bir teknik olduğunu göstermiştir. zaman içinde ortaya çıkan mavi çizgiler asetonitril konsantrasyonu arttıkça, bir C 18 nano sütunundan elüsyon peptidlerdir. Açıktır ki, hareketli popülasyonda (n = 3, gösterilen, n = 8, tipik olarak çalışır), hareketsiz aralığında tamamen yok 651,5 Da aralığında etrafında monoizotopik kütle ile, bir peptid kümesi vardır. Tandem kütle spektrometresi bu peptidi tanımlamak için kullanılır. 546 / 51546fig1highres.jpg &quot;/&gt; Şekil 1:. Kauda epididimis kauda epididimis Kanülasyon (A) Resim. kanül kendisi önceden çekti sonundan itibaren yaklaşık 1-2 cm maruz aşağı bantlanmış. Bu ince # 5watchmakers forseps kullanarak vas deferens sokulur. (B) kanül vaz deferens ve kanül ikisini de içeren bir segmente çevresindeki ince ipek ipe yerinde tutulur. Fare kaynaktan, kuyruklu epididimal hücreleri ve sıvının yaklaşık olarak 2-3 ul, 1 x 10 6 / ul konsantrasyonunda toplanır. Sıçan (gösterilmemiştir) ilgili sıvının yaklaşık olarak 30-40 | il benzer konsantrasyonlarda elde edilir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/51546/51546fig2highres.jpg" /> Şekil 2: Yetkili epididim sperm toplamak için kullanılan cam kılcal. (A) kauda e apeksten biri tübül<html> pididymis izole ve kırık. Bu gösterilen husule geldiği yaklaşık konum. (B) Görüntünün üst bir boş cam kapiller tüp gösterir ve alt önceden akıtmaya sıçan birini göstermektedir. Kan kontaminasyon ve minimal epitel hücre kontaminasyonu vardır. (C) sperm hala epididim sıvısında inceltilmiş gibi, onlar etkinleştirmek için başlamamıştır. Sperm başlangıçta BWW çözeltisi içine atılır, onlar bir kompakt &quot;string&quot; (Sol taraf) olarak çıkıyor. 10 dakika sonra sperm çoğu herhangi bir harici rahatsızlık (Sağ taraftaki) olmadan çözelti içine yüzmek beri hücrenin yetkinlik kolayca kurulur. (D) onlar yüzmeye bırakılmış hemen sonra kaudal epididim hücrelerinin bir kısım bir resmi dışarı hücrelerin saflığını gösterir. g3highres.jpg &quot;/&gt; Şekil 3:. Metanol-kloroform çökeltme sonra sperm çözünür olması, çözünür pay metanol-kloroform proteinleri ve kirletici maddelerin çıkarılması denatürasyonunu sağlamak için çökeltilir. protein topağı metanol / su ve kloroform fazlan arasındaki arabirimde görüntülenir. Bu pelet rahatsız etmemek için üst tabaka dikkatlice çıkarılır. Bu, protein kaybolur, böylece, üst fazın yaklaşık 2-3 mm bırakmak için yaygındır. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig4highres.jpg" width="600" /> Şekil 4:. Tipik TiO2 bakımından zenginleştirilmiş fosfopeptid profili açıklanan protokolü kullanarak, kaudal epididimal sperm (üst N = 3) hareketsiz ya izole edildi ya da hareketli devletler (alt, N = 3). ~ 651,5 D bir mono-izotopik kütle ile bir peptid kümesiBir hareketsiz olanlar (ok) hareketli populasyonda bulunan fakat tamamen yok olduğu gösterilmektedir. Bu tür karşılaştırmalar &quot;etiketi içermeyen (MS bazlı)&quot; olarak adlandırılır. Peptit, kitle ve tutma süresi, sonra peptid türetildiği proteinin tandem-kütle spektrometresi için bileşiği hedeflemek ve tanımlamak için kullanılır.

Herhangi bir hücre tipinin proteomik analizi, sıvı kromatografi kütle spektrometresinden (MS) önce numuneyi dekompleksten arındırmak için başlangıç materyalinin hem saflığına hem de ön fraksiyonlanmasına büyük ölçüde bağlıdır. Ters yıkama teknikleri kullanılarak, kemirgenlerden saf spermatozoa elde edilebilir. Sindirimi takiben, fosfopeptitler TiO2 kullanılarak zenginleştirilebilir.

Kemirgen Epididimal Spermatozoa&#39;lar phosphopeptide Analizi

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, sperm hücrelerinin olgunlaşması sırasında spermatozoalarda meydana gelen fosfopeptit değişimlerini nicelendirmektir. Bu işlem, farenin kauda epididiminin çıkarılması, sperm hücrelerine retrograd geri yıkama uygulanması ve hücrelerin bir mikro kapiler tüpe toplanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, sperm hücrelerinin dengeli bir tuz çözeltisine doğru yüzmesine izin verilerek kontamine proteinlerin uzaklaştırılması sağlanır ve sonrasında kontamine tuz ve yağları gidermek için hücreler yıkanır, lizise uğratılır ve çöktürülür.Gular proteinler tripsin kullanılarak sindirilir ve ardından fosfopeptitleri zenginleştirmek amacıyla titanyum dioksit ile zenginleştirilir. Sonuçlar, sıvı kromatografisi ve kütle spektrometrisi analizine dayanarak proteinlerin fosforilasyon durumundaki kantitatif değişiklikleri göstermektedir. Bu yöntem, sperm hücrelerinin EPI'lerden geçişi veya kapasitasyon sırasındaki fosfoproteomik değişikliklerin neler olduğu gibi üreme biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu yöntem sperm hücresi biyolojisine dair bir içgörü sağlamış olsa da model organizmalara, kanser gibi hastalık çalışmalarına, nörolojik patolojilere ve genel sinyal iletim yolaklarına da uygulanabilir. EPI'lerin manipüle edileceği bölgelerin anatomisini belirlemek zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritik önem taşır. Bir kanül hazırlamak için bir litre Milli Q suyuna aşağıdakileri ekleyerek 200 mililitre Biggers, Whitten ve Whitten veya BWW çalışma sap solüsyonu hazırlayarak başlayın.İç çapı 0.4 mm ve dış çapı 1.1 mm olan polietilen boru kullanın. Boru erimeye başlayana kadar düşük ısıya tutun. Boruyu germek ve böylece dış çapını küçültmek için uçlarını hemen dışarı doğru çekin.S deenlerin kanülasyonunu kolaylaştırmak için tüpün bir ucunu daraltacak şekilde kesin. Karşı ucu yaklaşık 15 santimetre olacak şekilde kesin. Ardından, küt uca 30 gauge bir iğne yerleştirin ve buna tamamen geri çekilmiş üç mililitrelik bir şırınga takın.20 santimetre uzunluğunda PE tüp keserek bir vakum ağızlığı hazırlayın ve bunu kanülün bir ucuna yerleştirin. Mikro kapiler cam tüp tutucuyu ve cam mikro kapileri yerleştirin. Bir fareyi metin protokolüne uygun olarak ötanize ettikten sonra, epididimi açığa çıkarmak için skrotumda küçük bir insizyon yapın.Ardından, testisi ve epididimisi boşluktan dışarı çekmek için bir çift 5 numara saatçi pensi kullanın. Vas deferens'in cauda epididymis'ten yaklaşık 1 ila 2 santimetreden fazlasını kesecek şekilde kesin.Ardından, proksimal EENT kanallarını ve epididimi testise bağlayan dokuyu çıkarmak için kesin ve bir diseksiyon mikroskobu altında, 5x ile 40x arasında büyütme kullanarak tüm erkek üreme yolunu çıkarın. Kanülün daralmış ucunun bir ila iki santimetresini görüş alanına yerleştirin ve 5 numara saatçi pensi ile sabitlemek için bant kullanın. Vas deferens'in her iki yanını nazikçe kavrayın ve kanülün görünür kısmı üzerine çekin.Ardından, emilmeyen siyah örgü işlem görmüş ipek kullanarak, saatçi tipi 5 numara pens yardımıyla kanüle edilmiş dokunun etrafına güvenli bir düğüm atın. Kateterin distal ucunu tutun ve tunica vaginalis'i çıkarın.Tek bir epidermal tübülü açığa çıkarmak için, tübülü nazikçe ortaya çıkarın ve spermlerin salınması için bir açıklık oluşturacak şekilde onları birbirinden ayırın. Ardından, vas deferense hava göndermek için şırınganın pistonunu hafifçe bastırın. Oluşan basınç, spermatozoaların yırtılan tübülle çıkmasını sağlayacaktır.Ardından, spermatozoaları cam kapiler içine çekmek için ağızlığa vakum uygulayın. Ağızlığa nazikçe üfleyin veya bir şırınga takarak spermatozoaları cam kapilerden bir mililitre önceden hazırlanmış B WW solüsyonuna boşaltın. Kontamine proteinleri uzaklaştırmak için hücreleri bu solüsyonla üç kez yıkayın.Son yıkama işlemini tamamladıktan sonra, spermleri daha sonra kullanmak üzere dondurun veya proteinleri çözmek için %4 chaps, 2 M tiyüre ve 50 mM tris pH 7.4 kullanın; ara ara vorteksleyerek bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, çözeltiyi 10.000 ×g'de 20 dakika santrifüjleyin ve disülfit bağlarını indirgemek için süpernatanı yeni bir tüpe aktarın; protein çözeltisine nihai konsantrasyonu 10 mM olacak şekilde DTT ekleyerek proteinleri alkilleştirin. Vorteksleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.Ardından lizata 50 millimolar IO asetamid ekleyip vorteksleyin ve oda sıcaklığında, karanlıkta 30 dakika inkübe edin. Proteinleri çöktürmek için bir hacim lizatı, bir hacim metanol ve 0,5 hacim kloroform ile birleştirin. Örneği vorteksledikten sonra 10,000 Gs'de iki dakika santrifüjleyin; ara yüzeyi aspire etmekten kaçınmak için yaklaşık iki milimetre boşluk bırakarak üst tabakayı toplayın.Bir hacim metanol ekledikten sonra, tüpü nazikçe ters çevirin ve tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı uzaklaştırın ve tripsin sindirimi ile fosfopeptit zenginleştirmesini gerçekleştirmek için peleti üç ila dört dakika boyunca havada kurutun. İşleme 1 molar üre içeren 25 millimolar amonyum bikarbonat kullanarak başlayın.Tripsini yeniden oluşturmak için, protein ile tripsin arasında ağırlıkça bir oran olacak şekilde F 50 ekleyin ve bir termo mikserde 37 °C ve 700 RPM'de gece boyunca inkübe edin. Sindirilmemiş materyali çöktürmek için santrifüj yaptıktan sonra, süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Metin protokolüne göre hazırlanan DHB tamponu kullanarak, tripsinle sindirilmiş peptitleri on kat seyreltin ve 200 µg kuru titanyum dioksit boncuğuna uygulayın; bir rotatörde oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası, numuneyi bir kez daha DHB tamponu ile yıkayın ve ardından %80 ACN ve %2 TFA içeren yıkama tamponu ile numuneyi üç kez yıkayın. Son santrifüj işlemini takiben, %2,5 amonyum hidroksit ekleyerek fosfopeptitleri elüye edin ve santrifüjün hemen ardından süpernatantı toplayın.Burada görüldüğü gibi, örneği asitlendirmek için 0.3 µL formik asit kullanın. Bu protokolün avantajlarından biri, spermatozoaların izole edilmesidir. Dinlenme durumunda birçok hücre, B WW medyumuna boşaltıldıktan hemen sonra kümeleşir.Ancak 10 dakika sonra modal hale gelirler ve çözelti homojenleşir. Bu videoda açıklanan hazırlama işlemi tipik olarak 200 × 10⁶ zoa üretir. Bu şekil, AR sıçan Cota epididymusundan elde edilen spermatozoaların saflığını göstermektedir.Numune hazırlama ile ilgili temel sorunlardan biri, çöktürme ve sindirimden elde edilen verimdir. Genellikle numunenin pH değerinin ayarlanmasını gerektiren TCA çöktürmesinin aksine, fenol kloroform çöktürmesi hızlıdır ve numuneyi asidifiye etmez; burada, gösterilen alt ve üst arayüzler arasında 100 mikrogramlık numuneden tipik olarak elde edilen protein peleti görülmektedir. Burada, bu protokolün tekrarlanabilirliği sunulmuştur.Zamanla ortaya çıkan mavi çizgiler, C 18 nano kolondan ayrılan peptidleri göstermektedir. Modal popülasyondaki asetonitril konsantrasyonu arttıkça, non range'de tamamen eksik olan, yaklaşık 651.5 Dalton civarında bir peptid kümesi görülür. Fosfat peptid zenginleştirme protokolü etkili bir tekniktir.Bu prosedürü uygularken, proteomik için tekrarlanabilir sonuçlar elde etmede numune hazırlamanın kilit bir husus olduğunu unutmamak önemlidir. Bu yöntem, proteomlarının siyak asit içeriğinde hangi proteinlerin değişime uğradığı gibi ek soruları yanıtlamak için kullanılabilecek glikoproteinleri izole etmek üzere uyarlanabilir.

phosphopeptide-analysis-of-rodent-epididymal-spermatozoa

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, bir peptit karışımından fosfopeptitlerin antikor bazlı immünopresipitasyonunu gösteriyoruz. Zenginleştirilmiş fosfopeptitler vakumla konsantre edilir ve aşağı akış analizi için depolanır.

Fosfopeptit Zenginleştirme: Spesifik Fosforile Peptitleri Kompleks Peptit Karışımlarından Ayırmak için Antikor Bazlı Bir İmmünopresipitasyon Tekniği

Bu tübül squash teknik hızla hücresel bütünlüğünü koruyarak fare spermatocytes geliştirme saytolojik özellikleri değerlendirmek için hedeftir. Bu yöntem tüm aşamalarında spermatogenez çalışma için izin verir ve diğer biyokimyasal ve moleküler biyolojik yaklaşımlar için fare mayoz çalışmanın yanında kolayca uygulanabilir.

Seminifer tübül Squash tekniği fare modeli kullanarak sperma saytolojik analizi için

Bu da çalışmanın Rab10 fosforilasyon endojen düzeyleri lösin yönünden zengin tekrar kinaz 2 algılama basit bir yöntem açıklanır.

Rab10 fosforilasyon algılama SDS-sayfa bir fosfat bağlayıcı etiketi ile kullanarak LRRK2 etkinliğini tarafından

Bu iletişim kuralı ayıklamak ve prostat kanseri hücre hatlarından veya doku phosphoproteome ile kütle spektrometresi tabanlı proteomik analizi için phosphopeptides zenginleştirmek için bir yordam açıklanır.

Prostat kanserinde Phosphoproteome araştırmak için etiket içermeyen nicel kütle spektrometresi ile birleştiğinde Phosphopeptide zenginleştirme

Burada, proteinler parafin gömülü fare epididimal bölümlerde yer tespiti ve bu bir ölümsüzleştirdi epididimal hücre hattı (mECap18) iletişim kuralları göstermek için dynamin ayirt lokalizasyonu raporu. Ayrıca izolasyon epididimal sıvı ve şartına hücre medya salgı proteinlerin protokollerde açıklar.

Epididimal Protein sentezi ve salgı Analizi

Fare sperm kapamanı sırasında glikoliz ve oksidatif fosforilasyondaki gerçek zamanlı değişiklikleri izlemek için hücre dışı akı analizörü uygulamasını tanımladık.

Fare Sperm Kapasasyonu Sırasında Glikoliz ve Oksidatif Fosforilasyondaki Değişiklikleri Ölçmek için Hücre Dışı Akı Analizörü Kullanma

Bu protokol, iyon kanalı aktivitesini doğrudan kaydetmek amacıyla, tüm hücre konfigürasyonunda memeli sperm hücrelerinden elektriksel kayıtların nasıl gerçekleştirileceğini açıklar. Yöntem, çeşitli sperm iyon kanallarının elektrofizyolojik profillerini tanımlamada etkili olmuş ve moleküler kimliklerini ve regülasyonlarını ortaya çıkarmaya yardımcı olmuştur.

Memeli Sperm Hücrelerinin Plazma Zarı Boyunca Elektrik Akımlarının Kaydedilmesi

Bu makalede, erkek mayotik bölünmesi için değerli bir model olan abdominal cerrahi ve testiküler GSK923295 enjeksiyonu yoluyla CENP-E'nin in vivo inhibisyonu bildirilmiştir. İmmünofloresan, akım sitometrisi ve transmisyon elektron mikroskobu tahlillerini kullanarak, CENP-E inhibisyonunun fare spermatositlerinde kromozom yanlış hizalaması ve genom instabilitesi ile sonuçlandığını gösterdik.

Kinesin-7 CENP-E'nin In Vivo İnhibisyon, İmmünofloresan ve Akım Sitometrisi Kullanılarak Spermatositlerde Fonksiyonel Değerlendirilmesi

Protokol, disseke edilmiş fare embriyo yüz süreçlerinden veya kültürlenmiş fare embriyonik palatal mezenkim hücrelerinden tüm hücre protein lizatlarını izole etmek ve fosforile protein seviyelerini değerlendirmek için müteakip batı lekelemesini gerçekleştirmek için bir yöntem sunar.

Fosfoprotein Analizi için Fare Yüz İşlemleri ve Kültürlenmiş Palatal Mezenkim Hücrelerinden Tüm Hücre Protein Lisatlarının İzolasyonu

Burada, farelerin başlangıç segmentinde (interstisiyal enjeksiyon) ve kauda epididimidis (intravasal enjeksiyon) inflamatuar uyarımları indükleyen iki farklı cerrahi enjeksiyon modeli tanımlanmıştır. Bu yöntemler, epididimin farklı bölgelerindeki bölgeye özgü yanıtların incelenmesini mümkün kılar.

Patojenle İlgili Moleküler Desenler Tarafından İndüklenen Epididimit Fare Modelleri

Keşfedin kemirgen epididimal spermatozoa fosfopeptit analizi yöntemini. Retrograd geri yıkama ile saf hücre izolasyonu, tripsin sindirimi ve TiO2 zenginleştirmesi kullanılarak sperm olgunlaşmasındaki fosforilasyon değişiklikleri kantitatif olarak incelenir.

Kemirgen Epididimal Spermatozoa'lar phosphopeptide Analizi

Daha fazla video keşfet