Kemirgen Epididimal Spermatozoa'lar phosphopeptide Analizi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, sperm hücresi olgunlaşması sırasında spermatozoa içinde meydana gelen fosfo peptit değişikliklerini ölçmektir. Bu, coddle epididimusunun fareden çıkarılması, sperm hücrelerinin retrograd olarak geri yıkanması ve hücrelerin bir mikro kılcal tüpe toplanmasıyla elde edilir. Daha sonra sperm hücrelerinin, kirletici proteinlerin uzaklaştırılmasını sağlayan dengeli bir tuz çözeltisine girmesine izin verilir ve daha sonra kirletici tuzları ve yağları uzaklaştırmak için yıkanır, yakılıp çökeltilir.

Gular proteinler tripsin kullanılarak sindirilir, daha sonra fosfo peptitleri zenginleştirmek için titanyum dioksit kullanılarak zenginleştirilir. Sonuçlar, sıvı kromatografisi, kütle spektrometresi analizine dayalı olarak proteinlerin fosforilasyon durumundaki kantitatif değişiklikleri göstermektedir. Bu yöntem, üreme biyolojisi alanında, spermin EPI'leri geçerken veya kapasitasyon sırasında fosfoproteomik değişikliklerin neler olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu yöntem sperm hücresi biyolojisi hakkında bir fikir vermiş olsa da, model organizmalara, kanser gibi hastalık çalışmalarına, nörolojik patolojilere ve genel sinyal iletim yollarına da uygulanabilir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi, EPI'lerin manipüle edileceği alanların anatomisini belirlemek zor olduğu için kritik öneme sahiptir. Bir kanül yapmak için bir litre Milli Q suyuna aşağıdakileri ekleyerek 200 mililitre Biggers, Whitten ve Whitten veya BWW çalışma sapı çözeltisi yaparak başlayın.

Sırasıyla 0,4 milimetre ve 1,1 milimetre iç ve dış çaplara sahip polietilen boru kullanılması. Boru erimeye başlayana kadar kısık ateşte tutun. Borunun uçlarını germek için hemen dışarı doğru çekin, böylece dış çapı azaltın.

Bir ucunda daralma sağlamak için boruyu kesin, bu da S deens'in daha kolay kanülasyonuna izin verecektir. Karşı ucunu yaklaşık 15 santimetreye kadar kesin. Daha sonra kör uca 30 gauge bir iğne sokun ve tamamen geri çekilmiş üç mililitrelik bir şırınga takın.

20 santimetre uzunluğunda bir PE boru keserek bir emme ağızlığı yapın ve kanülün bir ucuna yerleştirin. Mikro kılcal cam tüp tutucuyu ve cam mikro kılcal damarı yerleştirin. Metin protokolüne göre bir fareyi ötenazi yaptıktan sonra, epi'yi ortaya çıkarmak için skrotumda küçük bir kesi yapın.

Ardından bir çift saatçi kullanın. Testisi ve epididimusu boşluktan çıkarmak için beş numaralı forseps. Kata epididymus'tan büyük saygının yaklaşık bir ila iki santimetresi dışında hepsini çıkarmak için kesin.

Daha sonra proksimal EENT kanallarını ve epididimusu testise bağlayan dokuyu çıkarmak için kesin ve beş x ile 40 x büyütme arasında bir diseksiyon mikroskobu altında tüm erkek üreme yolunu çıkarın. Kanülün daralmış ucunun bir ila iki santimetresini görüş alanına yerleştirin ve beş numara saatçi forsepsleri ile sabitlemek için bant kullanın. Geniş saygının her iki tarafını nazikçe sıkın ve kanülün görünen kısmının üzerine çekin.

Daha sonra emilmeyen siyah örgülü işlem görmüş ipek ile, saatçileri kullanarak kanüllü dokunun etrafına güvenli bir düğüm atın. Beş numara forseps. Kata epi ides'in distal ucunu tutun ve tunika Eugenia'yı çıkarın.

Tek bir epidermal tübülü açığa çıkarmak için, tübülü nazikçe açığa çıkarın ve spermin serbest bırakılması için bir açıklık oluşturmak için ayırın. Daha sonra, havayı geniş bir saygıya atmak için şırınganın pistonuna hafifçe bastırın. Basınç, spermatozoanın kırık tübülden çıkmasına neden olur.

Daha sonra spermatozoayı cam kılcal damara çekmek için ağızlığa emme uygulayın. Ağızlığa nazikçe üfleyin veya bir şırınga takın ve spermatozoayı cam kılcal damardan bir mililitre savaş öncesi B WW çözeltisine boşaltın. Ve herhangi bir kirletici proteini uzaklaştırmak için hücreleri üç kez yıkamak için solüsyonu kullanın.

Son yıkamayı çıkardıktan sonra, spermi daha sonra kullanmak üzere dondurun veya% 4, iki molar tiyo üre ve 50 milimolar tris pH 7.4 kullanarak proteinleri aralıklı girdap ile bir saat inkübe edin. Daha sonra çözeltiyi 20 dakika boyunca 10.000 GS'de santrifüjleyin ve disülfid bağlarını azaltmak için süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve DTT'deki proteinleri protein çözeltisine 10 milimolar nihai konsantrasyonda alkilleyin. Girdap yapın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Daha sonra lizat girdabına 50 milimolar IO asetamid ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Proteinleri çökeltmek için bir hacim lizat, bir hacim metanol ve 0.5 hacim kloroformu birleştirin. Numuneyi girdapladıktan sonra, iki dakika boyunca 10.000 Gs'de döndürün, üst tabakayı toplayın ve arayüzün aspire edilmesini önlemek için yaklaşık iki milimetre bırakın.

Bir hacim metanol ekledikten sonra, tüpü yavaşça ters çevirin ve tekrar döndürün. Süpernatanı atın ve tripsin, sindirim ve fosfopeptit zenginleştirmesini gerçekleştirmek için peleti üç ila dört dakika havayla kurutun. Bir molar üre içeren 25 milimolar amonyum bikarbonat kullanarak başlayın.

Tripsini sulandırmak için, F 50'yi proteinin tripsine ağırlık başına bir ağırlık oranında birleştirin ve gece boyunca 37 santigrat derece ve 700 RPM'de bir termo karıştırıcı üzerinde inkübe edin. Sindirilmemiş materyali peletlemek için döndürdükten sonra, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Metin protokolüne göre hazırlanan DHB tamponunu kullanarak, denemenin inize edilmiş peptitlerini on kat seyreltin ve inkübasyondan sonra oda sıcaklığında bir saat boyunca bir döndürücü üzerinde inkübe edilen 200 mikrogram kuru titanyum dioksit boncuklarına uygulayın, numuneyi bir kez daha yıkamak için DHB tamponunu kullanın. Son santrifüjlemeyi takiben numuneyi üç kez yıkamak için %80 A CN ve %2 TFA'dan oluşan yıkama tamponunu kullanmadan önce fosfo peptitleri şu şekilde elüte edin: Eğirme işleminden hemen sonra% 2.5 amonyum hidroksit ilave edilerek süpernatan toplanır.

Burada görüldüğü gibi numuneyi asitleştirmek için 0.3 mikrolitre formik asit kullanın. Bu protokolün bir avantajı, spermatozoanın izole edilmesidir. Hareketsiz bir durumda, birçok hücre B WW ortamına atıldıktan hemen sonra kümelenir.

Ancak 10 dakika sonra modal hale gelirler ve çözelti homojen hale gelir. Bu videoda açıklanan preparat tipik olarak 200 çarpı 10 üzeri altı zoa üretir. Bu şekil, AR sıçan Cota epididymus'tan elde edilen spermatozoanın saflığını göstermektedir.

Numune hazırlama ile ilgili en önemli konulardan biri, geziler ve sindirimden elde edilen verimdir. Genellikle numunenin pH'ının ayarlanmasını gerektiren TCA çökeltisinin aksine, fenol kloroform çökeltmesi hızlıdır ve burada gösterilen numuneyi asitleştirmez, tipik olarak gösterilen alt ve üst arayüz arasındaki 100 mikrogram numuneden görülen protein peletidir. İşte bu protokolün tekrarlanabilirliği.

Zamanla ortaya çıkan mavi çizgiler, bir C 18 nano sütunundan gelen peptitlerdir. Modal popülasyonda asetonitril konsantrasyonu arttıkça, yaklaşık 651.5 Dalton'da olmayan aralıkta tamamen bulunmayan bir peptit kümesi vardır. Bir kez fosfat peptit zenginleştirme protokolü etkili bir tekniktir.

Bu prosedürü denerken, proteomik için tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için numune hazırlamanın önemli bir husus olduğunu unutmamak önemlidir. Bu yöntem, hangi proteinlerin proteomlarının asit içeriğinde bir değişikliğe uğradığı gibi ek soruları yanıtlamak için kullanılabilen glikoproteinleri izole etmek için uyarlanabilir.