4.11: Yumurta içinde Tavuk Embriyolarının Elektroporasyonu

Elektroporasyon, yabancı genetik materyali hücrelere sokmak için kullanılan bir tekniktir. Civciv embriyolarının yumurta içinde elektroporasyonu veya yumurta elektroporasyonu, gelişimsel biyologlar için değerli bir araçtır, çünkü genetik materyalin verilmesi belirli dokulara ve belirli gelişimsel zaman noktalarına lokalize edilebilir. Bu video, in ovo elektroporasyonun temel ilkelerini tanıtacak, prosedürün temel adımlarını açıklayacak ve bu tekniğin geliştirme sırasında biyolojik süreçleri incelemek için nasıl kullanılabileceğini tartışacaktır.

Başlamak için, DNA'yı bir hücreye sokmak için nasıl kullanılabileceğini anlamak için elektroporasyonun temel ilkelerini gözden geçirelim.

İlk olarak, DNA'yı ilgilenilen bir hücreye yakın bir yerde iletmek için mikroenjeksiyon kullanılır. Bununla birlikte, DNA hücreye girmek için plazma zarına nüfuz edemez.

Bu sorunu çözmek için, zarın stabilitesini bozmak ve gözenekler oluşturmak için bir elektrik akımı uygulanır. Bu elektrik alanının ikinci bir sonucu, negatif yüklü DNA'nın pozitif elektrota doğru göçüdür. Sonuç olarak, sadece enjeksiyon bölgesinin pozitif elektroda daha yakın olan tarafındaki hücreler DNA ile transfekte edilir.

Artık temel prensipleri bildiğinize göre, embriyoların elektroporasyon için nasıl hazırlanacağı hakkında konuşalım. Hamburger Hamilton evre 20'den daha eski embriyoları kullanmanız gerekiyorsa, daha iyi doku erişimi için civcivlerinizi kabuğun dışında veya ex ovo olarak kültürlemek en iyisidir. Bu video, kabuk içinde veya ovo'da gelişen erken embriyolar üzerinde gerçekleştirilen elektroporasyonlara odaklanacaktır.

Başlamak için, yumurtalar 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde kuluçkaya yatırılmalıdır. İstenilen gelişim aşamasına ulaşana kadar C. Yumurtalar kuluçkaya yatırılırken, aletleri enjeksiyon ve elektroporasyon için hazırlayın. İlk olarak, bir pipet çektirme ile 0,5 mm'lik bir cam pipeti çekerek kılcal iğneler yapın. Pipeti açmak için mikroskop altına yerleştirin ve ucundan küçük bir parça koparın. Ardından, enjekte edilen çözeltiyi görselleştirmenize yardımcı olacak bir boyanın yanı sıra yapınızın uygun bir seyreltmesini içermesi gereken enjeksiyon çözeltisini hazırlayın.

İğne içindeki sıvının hareketini kontrol etmek için, iğneyi insan gücüyle çalışan bir ağız pipetine takın. Alternatif olarak, iğne, ayarlanabilir hava basıncı darbeleri sağlayan bir mikro enjektör üzerine yüklenebilir. Ucu enjeksiyon solüsyonuna batırarak ve negatif basınç uygulayarak iğneyi doldurun.

İğnelere ek olarak, elektrotlara da ihtiyacınız olacak. Bunlar, bir adaptörle birbirine sabitlenmiş iki açıkta kalan telden oluşur. Bir çift kablo, elektrotları darbe süresini, frekansını ve voltajını kontrol eden elektrikli darbe üretecine veya elektroporatöre bağlar. Eller serbest kullanım için, elektroporatör bir ayak pedalı ile etkinleştirilebilir.

Yumurtalar hazır olduğunda, kabukta bir pencere açın ve embriyonun kurumasını önlemek için Hanks gibi birkaç damla fizyolojik tuz çözeltisi ekleyin. Mikroskop altında, yumurtayı, ilgilenilen doku iğne tarafından erişilebilir olacak şekilde konumlandırın. Daha sonra embriyoyu kılcal iğne ile delin ve hafif bir baskı uygulayarak çözeltiyi verin.

Artık yapıyı enjekte ettiğimize göre, elektroporasyonu gerçekleştirme zamanı. Elektrotları, Hank'in çözeltisine batırılacak ve ilgilenilen doku aralarında ortalanacak şekilde konumlandırın. Elektrik akımını uygulamak için ayak pedalına basın ve elektrotların etrafında oluşan kabarcıkları arayın.

Elektroporasyon tamamlandıktan sonra, elektrotları embriyodan çıkarın ve% 70 etanol ile silin. Enfeksiyonu önlemek için antibiyotiklerle desteklenmiş birkaç damla tuz çözeltisi ekleyin ve pencereyi bantla kapatın. Son olarak, fenotipik analizden önce sürekli gelişim için yumurtaları kuluçka makinesine geri koyun.

Artık ovo elektroporasyon hakkında her şeyi öğrendiğimize göre, bilim adamlarının bu tekniği gelişimsel araştırmalarda nasıl uyguladıklarına dair bazı örneklere bakalım.

Başlangıç olarak, elektroporasyon, yıkılabilir yapıların iletilmesiyle gen ekspresyonunu bloke etmek için kullanılabilir. Bu örnekte, gelişmekte olan nöral tüpün hücreleri, gen susturma yapıları ile elektropore edildi. Embriyoların gelişmesine izin verildi ve daha sonra akson rehberliğinin genetik kontrolünü değerlendirmek için normal ve knockdown örnekleri arasında akson yörüngeleri karşılaştırıldı.

Diğer taraftan, in ovo elektroporasyon, protein kodlayan bir gen ve bir promotör içeren bir plazmid ekleyerek bir hücre alt kümesindeki bir proteini eksprese etmek için de kullanılabilir: transkripsiyonu başlatmak için RNA polimerazı bağlayan bir dizi. Burada, bilim adamları embriyonik beynin hücrelerine tek bir gen verdiler. Hem bu genin protein ürününü hem de spesifik nöral alt tiplerin belirteçlerini tespit etmek için yapılan doku boyama, elektroporasyonlu genin nöral gelişimi değiştirdiğini gösterir.

Floresan proteinleri kodlayan DNA yapıları, gelişim sırasında hücreleri ve yapıları görselleştirmek için elektroporasyon yoluyla da tanıtılabilir. Bu, omurilik gelişimi gibi karmaşık süreçlerin canlı olarak görüntülenmesine olanak tanır ve zaman içindeki hücre hareketlerinin dinamikleri hakkında fikir verir.

JoVE'nin civcivlere genetik materyal vermek için yararlı bir teknik olan in ovo elektroporasyona girişini izlediniz. Bu videoda, elektroporasyonun temel prensipleri, civcivleri enjekte etmek ve elektroporasyon yapmak için gerekli adımlar ve bu tekniğin mevcut gelişimsel araştırmalardaki uygulamaları tartışılmıştır. İzlediğiniz için teşekkürler!